Содержание к диссертации
ГЛАВА 1. ПРЕДПОСЫЛКИ ДЛЯ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ БИОЛЮМИНЕСЦЕНТНЫХ ТЕСТОВЫХ СИСТЕМ ДЛЯ МОНИТОРИНГА РАДИОТОКСИЧНОСТИ (ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР)1.1. Биолюминесценция: природа и свойства
1.2. Использование биолюминесценции для мониторинга химической токсичности
1.2.1. Использование люминесцентных бактерий для мониторинга химической токсичности
1.2.2. Использование биолюминесцентных ферментативных реакций для мониторинга химической токсичности
1.3. Способы оценки радиационного состояния окружающей среды
1.3.1. Методы детектирования радионуклидов в различных объектах
1.3.2. Метод гамма-спектрометрии
1.3.3. Метод альфа-спектрометрии
1.3.4. Метод бета-спектрометрии
1.3.5. Масс-спектрометрия
1.3.6. Жидкостно-сцинтилляционная спектрометрия
1.3.7. Определение отдельных радионуклидов
1 -4. Воздействие ионизирующих излучений
1.4.1. Характеристика излучений
1.4.2. Биологические процессы под действием ионизирующего излучения. Радиобиологические методы
1.5. Проблема «малых доз»
1.6. Использование гуминовых веществ для детоксикации растворов
1.7. Перспективность использования бактериальной люминесценции для мониторинга радиотоксичности растворов
ГЛАВА 2. МЕТОДИКА ЭКСПЕРИМЕНТА
2.1. Реактивы и приборы
2.2. Методы измерения
2.2.1. Регистрация кинетики биолюминесценции
2.2.2. Приготовление образцов для измерения интенсивности биолюминесценции
2.2.2.1. Основные этапы
2.2.2.2. Приготовления проб и растворов (рабочих и контрольных) с использованием интактных и лиофильно высушенных бактерий
2.2.2.3. Приготовления проб и растворов (рабочих и контрольных) с использованием водорастворимой и иммобилизованной ферментативных систем
2.2.2.4. Измерение интенсивности биолюминесценции интактных бактерий в присутствии гуминовых веществ
2.3. Обработка данных биолюминесцентного анализа
2.4. Измерение активности растворов Ат-
2.5. Анализ ультраструктуры бактериальных клеток
2.6. Анализ распределения Ат-241 в клеточной культуре
ГЛАВА 3. ИЗУЧЕНИЕ ВЛИЯНИЯ РАСТВОРОВ Ат-241 НА БИОЛЮМИНЕСЦЕНТНЫЕ СИСТЕМЫ
3.1. Влияние растворов Ат-241 на биолюминесцентные системы
3.1.1 Бактериальные системы
3.1.1.1. Интактные бактерии
3.1.1.2. Лиофилизированные бактерии
3.1.2. Ферментативные системы
3.1.2.1 Водорастворимая биферментная система
3.1.2.2 Иммобилизованная в крахмальный гель ферментативная система
3.2. Сравнение влияния Ат-241 на биолюминесцентные системы
3.3. Распределение Ат-241 в бактериальной культуре
3.4. Результаты электронно-микроскопических исследований бактериальной культуры в растворе Ат-
ГЛАВА 4. СРАВНЕНИЕ ВЛИЯНИЯ СОЛЕЙ МЕТАЛЛОВ НА БАКТЕРИАЛЬНУЮ БИОЛЮМИНЕСЩНЦИЮ
4.1. Классификация эффектов металлов различных групп на биолюминесцентные системы (начальная стадия инкубирования)
4.2. Исследование эффектов тяжелых металлов при различных временах инкубирования
4.2.1. Хроническое воздействие Европия
4.2.2. Хроническое воздействие Урана
4.3. Сравнение воздействия на биолюминесценцию металлов различной удельной радиоактивности
4.3.1. Сравнение эффектов европия и америция
4-3-2 Сравнение эффектов европия и урана
4.3.3. Сравнение эффектов урана и америция
4.4. Итоги главы
ГЛАВА 5. ВЛИЯНИЕ ГУМИНОВЫХ ВЕЩЕСТВ НА ТОКСИЧНОСТЬ РАСТВОРОВ Ат-
5.1. Влияние гуминовых веществ на интенсивность биолюминесценции бактерий в растворах нитрата америция
5.2 Распределение радионуклидов между бактериальными клетками и средой в присутствии и отсутствии гуминовых веществ
5.3. Результаты электронно-микроскопических исследований воздействия гуминовых веществ на бактериальную культуру в растворе Ат-
5.4. Итоги главы
Введение к работе
В настоящее время в радиоэкологических исследованиях наблюдается смена концептуального подхода: на смену антропоцентрическому приходит экоцентрический подход. Созрело понимание необходимости изучения влияния радиоактивности на всю биоту в целом и на человека как составную часть этой биоты, интегрированную в биосферу множеством функциональных связей. Микроорганизмы являются простейшей и основополагающей частью биосферы, и их состояние может служить индикатором состояния системы в целом. В связи с этим исследования воздействия радиоактивности на микроорганизмы приобретают все большую актуальность.
Фундаментальной задачей в рамках указанной проблемы является разработка научных основ использования микроорганизмов для мониторинга радиационной токсичности. Удобными объектами являются морские люминесцентные бактерии, которые уже более сорока лет применяются для мониторинга химической токсичности различных сред (Гительзон и др., 1984; Кратасюк, 1994; Girotti, 2008). Для количественной оценки состояния этих микроорганизмов в различных условиях окружающей среды используется интенсивность их люминесценции. Имеется возможность аналитического использования как бактериальных клеток, так и выделенных ферментов, что дает возможность сравнивать результаты воздействия радиации на микробиологическом и биохимическом уровнях.
К настоящему времени известны исследования (Min, 2003), в которых биолюминесценция бактериального рекомбинантного штамма E.coli применялась для определения токсичности среды, задаваемой гаммаизлучением. Биолюминесцентные системы до сих пор не использовались для изучения воздействия следовых количеств изотопов с преимущественно альфа-излучением.
В последние годы исследователи все чаще обращаются к проблеме «малых доз». Обсуждаются неаддитивность и гетерогенность откликов организмов на низкодозовое воздействие. Наиболее важным достижением в данной проблеме является выявление нелинейности зависимости дозаэффект и понимание того, что воздействия излучений в малых дозах нельзя оценивать путем простой экстраполяции экспериментальных данных, полученных при использовании больших повреждающих доз облучения (Кудряшов, 2004). Известно, что в определенном диапазоне доз наблюдается стимуляция, а не угнетение клеточных процессов (так называемый эффект «гормезиса»).
Вместе с тем, несмотря большой интерес к проблеме «малых доз», вопрос о механизмах формирования вызываемых ими эффектов остается на уровне гипотез и предположений (Kim et al., 2007).
Одним из наиболее опасных, с точки зрения влияния на живые организмы, является воздействие радионуклидов, характеризующихся преимущественно альфа-распадом. Типичным альфа-излучающим радионуклидом является Am-241. Время его полураспада - 432,7 лет. Этот радиоизотоп имеет техногенное происхождение, является одним из побочных продуктов ядерного производства и в последние годы все чаще регистрируется в окружающей среде.
Цель исследования - изучение воздействия растворов Am-241 малой и средней активности на биолюминесцентные системы - люминесцентные бактерии и выделенные ферменты.
В работе поставлены следующие задачи: 1. Адаптировать биолюминесцентные методики для мониторинга радиотоксичности растворов малой и средней активности.
2. Сравнить воздействие на бактериальную биолюминесценцию Am241, радионуклидов низкой удельной активности (на примере урана) и стабильных тяжелых металлов. На основе этого сравнения оценить вклады химической и радиационной составляющих в воздействии Ат-241 и урана на биолюминесцентные системы.
3. Сравнить воздействие Ат-241 на биолюминесценцию бактерий и выделенных ферментативных систем.
4. Оценить распределение Ат-241 в бактериальной культуре.
5. Исследовать влияние гуминовых веществ на люминесценцию бактерий в растворах Ат-241, поврежденность клеток и содержание Ат-241 в клеточной фракции.
Научная новизна. На примере Ат-241 впервые исследовано воздействие растворов альфа-излучающего изотопа малой и средней активности на биолюминесцентные системы - интактные и лиофилизированные бактерии, водорастворимую и иммобилизованную в крахмальный гель ферментативные системы. Получены зависимости интенсивности биолюминесценции от времени воздействия радионуклида и его концентрации/удельной активности. Показано, что воздействие Ат-241 проявляется при низких концентрациях/удельных активностях радионуклида, характеризуется начальным периодом активации и последующим периодом ингибирования биолюминесценции.
На основе сравнения со стабильными элементами показано, что эффекты Ат-241 на биолюминесцентные системы определяется радиационными, а эффекты урана — химическими свойствами.
Обнаружено накопление Ат-241 бактериальными клетками, визуализированы изменения бактериальных клеток на различных этапах радиационного воздействия.
Биолюминесцентные системы впервые использованы для мониторинга процессов детоксикации растворов Ат-241 гуминовыми веществами.
Практическая значимость. Предлагаемые исследования являются основой для разработки биолюминесцентных методик мониторинга радиотоксичности радиоизотопов, характеризующихся альфа-распадом, в растворах низкой и средней активности. Биолюминесцентные системы могут быть использованы в экологии и медицине для мониторинга воздействия растворов радионуклидов на микробиологические и биохимические процессы, для выявления эффектов при различных дозах облучения.
Положения, выносимые на защиту: 1 Нелинейность зависимости эффекта от времени хронического воздействия Ат-241 на биолюминесцентные системы в растворах низкой и средней активности: активация на начальной и ингибирование на конечной стадиях воздействия.
2 Радиационная природа токсичности Ат-241 и химическая природа ТОКСИЧНОСТИ урана в растворах низкой и средней активности.
3 Уменьшение эффектов Ат-241 на люминесцентные бактерии в присутствии гуминовых веществ.
Апробация работы. Основные положения работы представлены на VII-ой Международной школе-семинаре молодых ученых "Актуальные проблемы физики, технологий и инновационного развития" (Томск, 2005), VIII-OM Международный симпозиум «Сложные системы в экстремальных условиях» (Красноярск, 2006), Российской школе-конференции молодых ученых «Экотоксикология: современные биоаналитические системы, методы и технологии» (Москва, 2006), конференции «Социально-экологические проблемы природопользования в Центральной Сибири» (Красноярск, 2006), ХИ-ом Международном симпозиуме по люминесцентной спектроскопии (Испания, Луго, 2006), 2-ой Всероссийской конференции по аналитической химии (Краснодар, 2007), Международной конференции по радиоактивности окружающей среды (CN-145, Вена, Австрия, 2007), 12-ом Международном симпозиуме по биолюминесценции (Шанхай, Китай, 2008), 1-ой Российской конференции «Радиоэкология: итоги, современное состояние и перспективы» (Москва, 2008).
Работа выполнена при финансовой поддержке следующих грантов: Грант Министерства Образования РФ REC-002 KR-006; ФСП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научнотехнологического комплекса России на 2007-2012 годы» по теме: «Биолюминесцентный анализ: биосенсоры и биокаталитические технологии»; Программа РАН «Молекулярная и клеточная биология»; грант молодежной инновационной программы Сибирского Федерального Университета «Биолюминесцентный метод мониторинга радиотоксичности», 2007.
Личный вклад соискателя состоял в адаптации биолюминесцеитных методик для мониторинга радиотоксичности растворов, проведении всех экспериментов, обработке и обсуждении экспериментальных данных.
Радиометрический анализ радиоактивных растворов осуществлялся в Лаборатории радиоэкологии ИБФ СО РАН, приготовление препаратов интактных и лиофилизированыых бактерий - в Лаборатории бактериальной биолюминесценции ИБФ СО РАН, иммобилизованных ферментативных препаратов — в лаборатории фотобиологии ИБФ СО РАН. Основная часть результатов была получена в сотрудничестве с Болсуновским А.Я., Бондаревой Л.Г., Есимбековой Е.Н., Кратасюк В.А., Кузнецовым A.M., Выдряковой Г.А., Могильной О.А., Александровой М.А. Вклад соавторов отражен в публикациях. Автор приносит благодарность всем коллегам за участие в совместных работах и обсуждении результатов.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 статей, 7 тезисов конференций, 1 патент Российской Федерации.
Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, трех глав с изложением результатов работы, заключения, выводов и списка литературы.
Работа изложена на 115 страницах машинописного текста, проиллюстрирована 8 таблицами и 22 рисунками. Библиография включает 150 источников.
