Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Литературный обзор
1.1. Роль продуктов окисления липидов в регуляции клеточного метаболизма 9
1.2. Трансформация гидрофобных ксенобиотиков в организме животных 11
13. Биологические последствия загрязнения окружающей среды. 19
1.4 Роль параметров системы регуляции ПОЛ в формировании биологических последствий действия неблагоприятных экологических факторов 24
Глава 2. Материалы и методы исследования 27
2.1. Условия радиобиологических экспериментов 27
2.2. Однократное введение химических токсикантов в малых дозах 28
2.3. Выделение липидов 29
2.4. Определение продуктов ПОЛ и белка 30
2.5. Анализ показателей антиоксидантного статуса липидов 31
2.6. Количественное определение состава фосфолипидов 33
2.7. Определение холестерина в пробах 35
2.8. Статистическая обработка результатов 36
Глава 3. Влияние антиоксидантного статуса на характеристики липидов в тканях животных после острого облучения в сублетальных дозах 37
3.1. Влияние острого облучения в сублетальных дозах на взаимосвязь между показателями антиоксидантного статуса 37
3.2. Влияние острого облучения в сублетальных дозах на состав липидов тканей животных 47
Глава 4, Влияние совместного воздействия химических агентов ирентгеновского излучения на параметры системы регуляции перекисного окисления липидов 56
Глава 5. Влияние химических токсикантов на состояние параметров системы регуляции перекисного окисления липидов в тканях мышей. 72
5.1. Сравнительный анализ аитиоксидантной-системы печени и кровимышей при воздействии химических токсикантов, экстрагированных изпитьевой воды 72
5.2. Влияние химических токсикантов на физиологические показатели втканях мышей 78
5,3- Взаимосвязь между параметрами перекисного окисления липидов при действии химических токсикантов 87
5.4. Влияние химических токсикантов в разных дозах на состав липидов печени мышей 92
5.5- Влияние химических токсикантов в широком диапазоне концентраций на состав эритроцитов крови 103
Заключение 113
Выводы 117
Список литературы 119
- Трансформация гидрофобных ксенобиотиков в организме животных
- Роль параметров системы регуляции ПОЛ в формировании биологических последствий действия неблагоприятных экологических факторов
- Однократное введение химических токсикантов в малых дозах
- Влияние острого облучения в сублетальных дозах на состав липидов тканей животных
Введение к работе
Одной из основных особенностей конца XX начала XXI века является глобальное стабильное загрязнение окружающей среды вредными веществами, способными перемещаться на сверхдальние расстояния от источников загрязнения. Следствием этого является сокращение видового разнообразия, выживание наиболее устойчивых агрессивных видов и появление мутантпых организмов, вызывающих новые формы патологии [55]. Кроме того, углубленный анализ токсико-гигиенических параметров 120 веществ разных структурных классов опровергает справедливость предположения об аддитивности вклада разных путей поступления, независимо от соотношения ингаляционной и пероральной токсичности экспозиционных и поглощенных доз и концентраций [78]. Прогнозирование биологических последствий воздействия физических и химических факторов на состояние биоты и здоровье человека вызывает необходимость детального изучения механизмов действия повреждающих факторов на сложные биологические объекты и выявление метаболически важных показателей, позволяющих оценить последствия этих воздействий и возможность их модификации, Одним из перспективных направлений является исследование состояния процесса перекисного окисления липидов (ПОЛ), поскольку показана высокая чувствительность параметров системы регуляции ПОЛ в тканях диких грызунов и лабораторных животных к воздействию факторов химической и физической природы [52,99]. Необходимость поиска информативных тестов для оценки функционирования сложных систем организма возрастает как в связи с отсутствием линейной зависимости «биологический эффект-доза» в области слабых воздействий [17, 21, 67, 98, 125, 137, 156], так и при оценке биологических последствий совместного действия ионизирующей радиации и химических агентов вследствие непредсказуемости эффекта
разных факторов и вероятности их синергического действия на биологические организмы [66].
В связи с вышесказанным целью настоящего исследования явилось выявление общности и различий отдаленных биологических последствий воздействия химических факторов в малых дозах и ионизирующего излучения в сублетальных дозах, а также их сочстанного влияния на состояние параметров системы регуляции ПОЛ в органах животных.
В соответствии с этим задачами работы являлись:
Изучить чувствительность и способность к нормализации параметров физико-химической системы регуляции ПОЛ органов и крови животных разных видов в зависимости от характеристик липидов спустя месяц после острого облучения животных в сублетальных дозах.
Изучить отдаленные последствия совместного действия твина -80 и ацетона в малых дозах и рентгеновского излучения в сублетальных дозах на параметры физико-химической системы регуляции ПОЛ в тканях мышей,
Исследовать изменения показателей антиоксидантного (АО) статуса и состава липидов в печени и крови мышей в течение месяца после однократного перорального введения химических токсикантов с разным содержанием бенз(а)пирена (БП) и полихлорбифенилов (ПХБ) в широком диапазоне концентраций.
Выявить наиболее информативные показатели для оценки степени воздействия неблагоприятных экологических факторов химической и физической природы на организм.
Научная новизна работы:
Впервые показано, что спустя месяц после воздействия рентгеновского излучения в сублетальных дозах и его совместного действия с химическими агентами на состояние показателей физико - химической
системы регуляции ПОЛ в тканях животных зависят от исходного АО статуса, кинетических характеристик липидов, и обусловлены биологическими особенностями вида- Установлено, что воздействие однократного перорального введения гексан-эф ирных экстрактов из питьевых водоисточников в малых дозах с разным соотношением БП и ПХБ на параметры физико-химической системы регуляции ПОЛ существенно зависят как от химической природы и дозы экстрактов, так и времени после воздействия. Наиболее существенное влияние на параметры ПОЛ оказало введение экстрактов и с более высоким содержанием и БП? и ПХБ в самой низкой дозе 5.3 х 10"5мг/кг. Выявлено усиление эффекта воздействия на показатели АО статуса в печени мышей, с ростом дозы рентгеновского излучения при предварительном введении малотоксичных химических агентов в малых дозах на биологические объекты. Впервые показано, что спустя месяц после воздействия как химических токсикантов в малых дозах, так и рентгеновского излучения в сублетальных дозах 4 Гр и 5 Гр более существенно изменяется способность липидов печени к окислению. Тогда как при совместном действии твина-80, ацетона в малых дозах и рентгеновского излучения в сублетальных дозах сильнее изменяется структурное состояние мембранной системы печени.
Положения выносимые на защиту:
1. Разная чувствительность и отсутствие нормализации параметров
физико-химической системы регуляции ПОЛ в тканях животных спустя
месяц после острого рентгеновского излучения в сублетальных дозах и
совместного действия твина-80, малотоксичного ацетона и рентгеновского
излучения в сублетальных дозах обусловлены исходным АО статусом
ткани,
2. Нелинейность изменения АОА липидов, содержания продуктов ПОЛ,
соотношения фракций фосфолипидов (ФЛ) в тканях животных при
воздействии химических токсикантов в малых дозах в зависимости от их суммарной концентрации.
3, Переход системы регуляции ПОЛ па другой уровень функционирования
вследствие изменения масштаба и направленности взаимосвязей между
параметрами физико-химической системы регуляции ПОЛ при действии
неблагоприятных факторов физической и химической природы,
4. Оценка биологических последствий действия факторов радиационной и
химической природы для групп животных по изменению масштаба и
направленности взаимосвязей между параметрами физико-химической
системы регуляции ПОЛ
Научно-практическая значимость. Полученные данные расширяют представление о биологических последствиях воздействия химических токсикантов в малых дозах, рентгеновского излучения в сублетальных дозах, а также их совместного влияния твина-80, малотоксичного ацетона в малых дозах и рентгеновского излучения в сублетальных дозах на живые организмы. Проведенное комплексное исследование состояния параметров физико-химической системы регуляции в тканях лабораторных животных позволило оценить вклад параметров этой системы в обеспечение ее функционирования в зависимости от характеристик липидов, обеспеченности их АО и интенсивности процесса окисления. Результаты исследований позволяют выявить информативные показатели для оценки функционирования сложных систем и биологических последствий воздействия физических и химических факторов на категории населения с разным антиоксидантным статусом. Высокая чувствительность липидного обмена эритроцитов и показателей АО статуса компонентов крови животных к действию неблагоприятных экологических факторов позволяет предложить их использование в качестве объектов для тестирования биологических последствий воздействия.
ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР
1Л. Роль продуктов окисления липидов в регуляции клеточного метаболизма.
Процессы лерекисного окисления липидов (ПОЛ) постоянно протекают в любой живой клетке и являются необходимым условием ее нормальной жизнедеятельности [15, 22, 117, 124, 145]. В физиологических условиях регуляция ПОЛ в клетке осуществляется как цитозольными (глутатионпероксидаза, супероксиддисмутаза, каталаза и др.)» таї< и мембраносвязанными системами (липидрастворимые антиоксиданты, структурный эффект и др.). Ранее установлено, что стационарность процессов ПОЛ в норме обеспечивается физико-химической системой рефляции окислительных реакций в липидах мембран, параметрами которой являются ЛОЛ и состав липидов, способность их к окисленню, структурные переходы в компонентах мембран [4, 15, 108, 109]- Работа этой регуляторной системы непосредственно связана с функциональной активностью мембран, в частности с изменением активности мембраносвязанных ферментов [4, 18, 145], что и обусловливает ведущую роль процесса ПОЛ в регуляции метаболизма клетки. Однако независимо от причин интенсификации ПОЛ изменение скорости окисления взаимосвязано с уменьшением количества биоантиоксидантов и изменениями в составе ФЛ мембран [13] за счет как более быстрой деградации окисленных липидов, так и ускорения реакций переноса липидов переносящими их белками. В последние годы показано функционирование физико-химической системы регуляции ПОЛ как на мембранном уровне [124], так и на клеточном и органном уровне [93].
Однако при избыточной генерации активных форм кислорода (АФК) процесс свободнорадикального окисления принимает каскадный характер, что приводит к липид-липидным и белок-липидным нарушениям,
нарушению структуры мембран, разобщению процессов окислительного фосфорилирования и сопряженного с ним тканевого дыхания и, как следствие, к тяжелому дисбалансу клеточного метаболизма [39,40,79,116, 156], Образующиеся в процессе ПОЛ радикальные интермедиаты , и различные продукты окисления взаимодействуют с белковыми компонентами мембранных структур. В результате, таких взаимодействий снижается уровень белковых мономеров, и образуются ковалентно связанные белок-липидные комплексы, а также белки с неспаренной валентностью способные к дальнейшей полимеризации [127, 173], которые вызывают деградацию ДНК и хромосомные повреждения [116]. Полагают, что действие радикалов приводит как к прямой фрагментации мембранных белков, так и к формированию липидных пероксидов, которые моїуг разлагаться в присутствии металлов с переменной валентностью, вызывая модификацию белков. Даже ограниченная окислительная модификация белков продуктами ПОЛ может привести затем к более значительному ферментативному их гидролизу [125],
Наибольшее внимание исследователей привлекают пероксиды липидов, которые являются первичными и лабильными продуктами окисления, Пероксиды липидов являются универсальным сырьем, которое используется в организме для синтеза биологически активных веществ: простагландинов, тромбоксанов, стероидных гормонов [22, 162]- Показано, что пероксиды липидов, как и сами липиды, могут активировать и ингибировать активность фермента [18]. Один из вторичных продуктов ПОЛ - малоновый диальдегид (МДА) имеет определенное функциональное назначение и способен контролировать клеточное деление на стадии репликации ДНК [14], а продукты ПОЛ являются связующим звеном между дыхательной цепью и АТР - синтазой [15]. Способность МДА разрушать белки может быть одним из механизмов, при помощи которых в процессе ПОЛ происходит инактивация ферментов [173]. В сложных
биологических системах об интенсивности ПОЛ судят, как правило, по содержанию в тканях ТБК-активпых продуктов - МДА и других вторичных продуктов ПОЛ, вступающих в реакцию с тиобарбитуровой кислотой [40, 143]. При этом МДА часто идентифицируют как соединение, способное действовать на расстоянии: образовываясь на месте окислительного повреждения, он может переноситься в другую часть клетки, например, ядро, и вызывать повреждения там [70], Предполагают, что уровень МДА указывает на эффективность удаления недоокисленых продуктов [73]. Хотя МДА способен превращаться в ацетат и «сгорать» в цикле трикарбоновых кислот [34, 73], основные биологические функции МДА обусловлены его взаимодействием с аминогруппами белков, нуклеиновых кислот и фосфолипидов (ФЛ), а также с SH-группами белков, что приводит к образованию внутри и межмолекулярных сшивок [159]. Имеются указания на то, что процессы клеточной пролиферации и дифференцировки, наряду с управляющим воздействием на них специфических регуляторов, контролируются работой системы ПОЛ в биомембраиах [1, 2, 65].
1*2. Трансформация гидрофобных ксенобиотиков в организме животных.
Воздействие чужеродных химических соединений - ксенобиотиков (КБ) на живые организмы имело место всегда, но особенно усилилось в индустриальную эру, когда антропогенная активность стала существенным фактором химического загрязнения объектов окружающей среды. Эволюционно в живых организмах существует несколько систем, препятствующих неблагоприятному воздействию чужеродных веществ (ксенобиотиков) на клетки. Белок Р-гликопротеин, расположен во внешней мембране клетки,- и «выбрасывает» во внеклеточное пространство ксенобиотики, предохраняя внутриклеточное компоненты клетки от их
воздействия- Монооксигеназная ферментная система (I фаза), окисляющая липофильные соединения, в том числе чужеродные вещества, с образованием более водорастворимого метаболита, чем исходное соединение. Ферменты конъюгации (II фаза), катализирующие взаимодействие окисленных ксенобиотиков с глутатионом, глкжуроновой и другими кислотами, что делает их более водорастворимыми и способствует быстрому выведению из организма. Основным функциональным назначением этих ферментов является поддержание внутриклеточного гомеостаза в конечном счете поддержание гомеостаза всего организма [45].
Трансформация ксенобиотиков в клетке происходит первоначально в
результате окислительно-восстановительных превращений,
катализируемыми цитохромами группы Р-450, оксидазами, редуктазами и
дегидрогеназами. Основным ферментом микросомальной
монооксигеназной системы является цитохром Р-450 [5]. Окисление субстрата SH под влиянием цитохрома,Р-450 описывается реакцией;
Р-450
SH+02+NADP Н -> SOH-ь NADP+ +Н2О
Другими словами, из двух атомов О молекулы 02 один атом внедряется в молекулу субстрата, другой востанавливается до воды.
Цитохром Р-450 - это общее название широкого семейства гсмопротеинов, катализирующих метаболизм большого числа не только ксенобиотиков, но и эндогенных соединений, Цитохром Р-450 является
мембраносвязанным, липидзависимым ферментом- Локализованы цитохромы Р-450 преимущественно в эндоплазматическом ретикулумс, хотя некоторое количество обнаруживаются в ядерных мембранах и митохондриях [152].
В отличие от ферментов, вовлеченных в метаболизм эндогенных соединений, для ферментов метаболической активации и детоксикации ксенобиотиков характерна низкая субстратная специфичность. Столь нехарактерное для энзиматических реакций отсутствие специфичности объясняется существованием большого количества изоформ с различным механизмом регуляции экспрессии и являющихся продуктом различных генов. Существует около 100 изоформ цитохрома Р-450, которые можно разделить на две категории. Изоформы, необходимые для синтеза стероидных гормонов, расположены в надпочечниках, яичниках, семенниках, молочной железе, а изоформы, назначение которых сводится к выведению чужеродных липофильных веществ из организма, экспрессированы в органах, наиболее подверженных воздействию чужеродных веществ: печень, почки, легкие, кожа. При этом организмы, отличающиеся по изоферментному спектру цитохрома Р-450, могут по -разному метаболизировать одни и те же ксенобиотики и вследствие этого обладать разной чувствительностью к их действию.
Помимо цитохрома Р-450, в монооксигеназную ферментативную систему входят цитохром bs, флавопротеид NADP Н- цитохром Р-450 редуктаза и НАД-Н-цитохром ~ bs- редуктаза [5]. Как уже отмечалось, для функционирования цитохрома Р-450 требуется наличие фосфолипидов, в работах in vivo [114, 32] показано, что фосфатидилхолин является ФЛ~ эффектором системы цитохрома Р-450, Эксперименты с очищенными компонентами монооксигеназной ферментной системы показали, что окисление многих субстратов более эффективно в присутствии цитохрома Ы [178, 44], хотя механизм участия этого гемопротеида в цитохром Р-450-зависимых реакций пока не ясен.
NADP Н- цитохром Р-450 редуктаза, влияющая на каталитические свойства цитохрома Р-450, является амфипатичным белком. Ее "якорная" часть, или "ножка"* погружена в мембрану, а "головка", в состав которой
входит активный центр (ФМН или ФАП), находится в цитозоле. Считается, что часть изоферментов цитохрома Р-450 полностью погружена в липидный матрикс мембраны - Р-450(Л), а другая часть -функционально важный домен цитохрома, содержащий гем, локализуется на границе раздела мембрана/ цитоплазма - Р-450(В).
Различием в гидрофобности изоформ цитохрома Р-450 и в локализации их активных центров в липидах мембраны или в цитозоле, можно объяснить некоторые особенности метаболизма гидрофобных субстратов с участием этих ферментов [37], В случае полициклических ароматических углеводородов (ПАУ), исходная молекула не содержит в своей структуре каких-либо функциональных полярных группировок, является истинно гидрофобной молекулой. Попадая в клетку, ПАУ локализуется в липидном матриксе мембран, что может привести к нарушению их функционирования [26]. Удаление таких молекул из мембран происходит в результате внедрения в их состав полярных групп под действием цитохрома Р-450 с образованием фенолов и эпоксидов. В частности, считается, что в окислительном метаболизме одного и того же исходного субстрата, например, бенз(а)пирена (БП), на разных стадиях его биотрансформации принимают участие разные изоформы цитохрома Р-450 [80].
Р-450(Л) ЭГ Р-450(В)
БП — 7,8-эпокси-БП -> 7,8-диол-БП -> 7,8-диол-9Д0-
эпоксид-БП
Бенз(а)пирен локализованный в липидной фазе микросомальиой мембраны, сначала подвергается первичному эпоксидированию по связи 7-8 с участием цитохрома Р-450 (Л), активный центр которого таюкс полностью находится в липидной фазе мембраны. Образующийся 7,8 -эпокси- БП гидролизуется микросомной эпоксигидролазой в 758-диол-БП,
которая как амфипатичная молекула транслоцирустся на границу раздела фаз "мембрана-цитозоль". Здесь он подвергается вторичному эпоксидированию по связи 9-Ю, но уже с участием цитохрома Р-450(В)( активный центр, которого ориентирован в цитозоль. В результате происходит образование 7,8- диол-9,10-эпоксида, который в силу наличия в его структуре полярных групп становится субстратом для других защитных ферментов, трансформирующих его в нетоксичные продукты. Эпоксиды ПАУ являются весьма реакционноспособными интермедиатами, обладающими генотоксическим действием [140]. Потенциально они могут модифицировать ДНК, РНК, белки и вызывать развитие патологических процессов, но этому препятствуют другие защитные ферменты метаболизма и детоксикации ксенобиотиков.
Непосредственно в мембранах эндоплазматического ретикулума, т.е. там же, где функционирует цитохром Р-450, катализирующий образование эпоксидов, локализованы два фермента, специфически нейтрализующие эпоксиды; эпоксигидролаза (ЭП), превращающая эпоксид в соответствующий диол - более полярное, менее генотоксическое соединение и глутатион-трансфераза, ко ныо тирующая эпоксид с глутатионом. Диолы, в свою очередь, подвергаются дальнейшим превращениям с участием микросомальных или цитозольных ферментов — трансфераз, с образованием безвредных продуктов и их последующим выведением из клетки. Вообще говоря, канцерогенная и мутагенная активность ПАУ связывается именно с образованием соответствующих эпоксидов и диол-эпоксидов. Считается [179], что основным метаболитом БП у млекопитающих является (+)-энантиомер бенз(а)пирен- trans-7,8-дигидроксидиол-9,10-эпоксид (BPDE)- Этот эпоксид обладает канцерогенным действием в отношении мышей и мутагенной активностью в отношении локусов гипоксантин-фосфорибозил-трансферазы (hprt) и дигидрофолат-редуктазы (dhfr) клеток китайского хомячка [111, 134],
В микросомах печени крыс обнаружено несколько изоформ эпоксигидролазы (ЭГ), Они проявляют чрезвычайно широкую субстратную специфичность. Локализован фермент в микросомах вблизи цитохрома Р-450. При этом многие индукторы цитохрома Р-450 являются также индукторами ЭГ [148]. Наряду с микросомальной существует и цитозольная эпоксигидролаза [133].
Из защитных ферментов, участвующих в так называемой II фазе трансформации ксенобиотиков, следует отметить сульфат-трансферазу (СТ), уридиндифосфатглюкуронозил-трансферазу (УДФ-ГТ) и глутатион-
трансферазу (ГТ).
Сульфат-трансфераза- представлена семейством ферментов, катализирующих коньюгацию сульфата с широким рядом соединений, имеющих в своей структуре гидрокси- и амино-группы [148]. Фермент, локализован преимущественно в цитозольной фракции клеток. Существует несколько типов СТ с множественностью форм каждого типа. Наиболее часто встречаются СТ, катализирующие сульфатирование ксенобиотиков или их активных метаболитов за счет превращения фенольных групп в сульфоэфиры. Это приводит к детоксикации КБ вследствие отсутствия биологической активности сульфатов и быстрой экскреции этих высокополярных соединений из организма, В то же время сульфатирование некоторых КБ и их метаболитов может приводить к образованию более канцерогенно-токсичных продуктов, чем исходный субстрат [163].
Многие ксенобиотики и их метаболиты, имеющие в своей структуре гидроксильные или аминогруппы, одновременно являются субстратами не только СТ, но и УДФ- глюкуронозилтрансферазы [149].
Этот мембраносвязанный фермент катализирует введение в молекулу КБ остатка глюкуроновой кислоты с образованием B-D-глюкуронидов [133], В
результате возрастает не только полярность КБ, но и благодаря наличию карбоксильной группы возможно образование соли, что облепгает выведение конъюгата через мочу или желчь, Глюкурониды продуктов первичного или вторичного окисления некоторых ПАУ могут способствовать усилению канцерогенных и мутагенных свойств ПАУ [150],
Для УДФ-ГТ также обнаружена множественность форм [163], Фермент индуцируется под влиянием многих химических соединений, в том числе под влиянием фенобарбитала и Арохлора 1254 (смесь полихлорированных бифенилов). Как правило, действие индукторов приводит к изменению изоферментного профиля фермента и увеличению его содержания. Между СТ и УДФ - ГТ существует тесная взаимосвязь и в соотношение активности этих ферментов существует обратная зависимость.
Важную роль в детоксикации ксенобиотиков играют катализируемые глутатион трансферазой (ГТ) реакции коньюгации электрофильных соединений с глутатионом [130]. Глутатион содержится в клетках в относительно высоких концентрациях (в среднем 3.10-*М), особенно в печени млекопитающих, где его концентрация достигает Ю-2 М [121]. Гидрофильные свойства этого трипептида резко повышают растворимость в водной фазе липофильных соединений, с которыми он конъюгирует. ГТ обладает активностью по отношению к соединениям самых различных классов, содержащих электрофильные атомы С, N, S, О, В клетке ГТ находится преимущественно в цитозоле, частично в ядерной мембране и в митохондриалыгом матриксе [133], Широкая субстратная специфичность ГТ обусловлена существованием ее множества форм. Важной особенностью цитозольной ГТ является ее индуцибильность под действием целого ряда соединений, в том числе барбитуратов, ПАУ, галогенированных бифенилов, антиоксидантов, спиртов и др.
Широкая субстратная специфичность и высокая активность по отношению к разным классам КБ и их метаболитам, высокое содержание глутатиона в клетке и наличие как цитозольной, так и микросомальной форм ГТ делает ферментативную конъюгацию с глутатионом одним из доминирующих путей в метаболизме КБ, приводящих к их детоксикации.
Большое количество исследований было проведено по влиянию антиоксидантов (АО) на ферменты метаболизма и детоксикации КБ- АО являются соединения различных классов, объединенные на основе ингибировать свободнорадикальные процессы. В повседневной жизни АО используются в качестве пищевых добавок и консервантов. Показано, что наряду с радио- и геропротекторными свойствами, АО обладают также антитоксическим, антимутагенпым и антиканцерогенным действием по отношению к широкому ряду соединений [15, 62,72, 94]. Отличительными особенностями действия АО на систему биотрансформации КБ являются высокая специфичность индукции ферментов II фазы и слабо выраженное влияние на цитохром Р-450. С учетом множественности изоформ этих ферментов можно предположить, что в процессе многоступенчатого («эстафетного») механизма биотрансформации каждого КБ участвуют и играют определяющую роль специфические изоформы цитохрома Р-450, ЭГ,П\УДФ~ГТ.
Следует отмстить, что у интактных организмов каталитический потенциал ферментов I] фазы значительно превышает таковой ферментов I фазы - цитохром Р-450, Так, в печени разных линий мышей и крыс активность ЭГ в гидролизе фенантрен-9,10-оксида в 30-40 раз превышает активность цитохрома Р-450, катализирующего образование этого эпоксида из фенантрена, а активность ГТ, специфически копъюгирующей 7,8-диол-9,10-оксид-БП с глутатионом, во много раз превышает активность ферментов, участвующих в образовании этого соединения [76]. При этом
активность ферментов II фазы может быть намного увеличена при действии специфических индукторов, в частности, АО,
Следует подчеркнуть и то обстоятельство, что образующиеся с участием цитохрома Р-450 активные метаболиты КБ могут ковалентно связыватся с белками и формировать конъюгированные антигены, к которым в организме синтезируются антитела. Таким образом» к борьбе с КБ подключается иммунная система организма [46, 77],
В работе [127] показано, что при ПОЛ происходят как деструктивные нарушения цитохрома Р-450, так и конверсия в неактивную форму Р-420, обусловленная изменениями в гидрофобном окружении гема. Обнаружено, что для деструкции цитохрома Р-450 требуется образование пероксидных группировок в 15-20 жирных ацилах, для разрушения цитохрома bs- от 40 до 50 молекул пероксидов липидов в микросомалыюй мембране [39].
Радикальные процессы, инициированные пероксидом водорода при световом воздействии [161], могут затрагивать не только мембраны, но и приводить к повреждению молекулы ДНК in vitro [153].
Обычно в аэробных клетках, помимо природных АО, имеются системы защиты от активных форм кислорода. В частности, в клетке присутствуют супероксиддисмутазы, каталаза, глутатион-пераксидазы.
1.3. Биологические последствия загрязнения окружающей среды*
Загрязнение окружающей среды химическими токсикантами в настоящее время имеет глобальный характер, о чем свидетельствуют факты выпадения кислотных дождей в районах, отстоящих на сотни километров от мест первоначального выброса кислот и окислов в атмосферу, нахождение в Антарктиде, Арктике пестицидов (ДДТ, лиидаиа и полихлорированных бифенилов). Экотоксиканты способны длительно сохраняться в окружающей среде и накапливаться в организме наземных и водных животных, растениях и водорослях с последующим попаданием
по пищевым цепочкам в организм человека- К таким веществам относятся полихлорированные бифенилы (ПХБ), полициклические ароматические углеводороды (ПАУ), поверхностно-активные вещества (ПАВ), ацетон.
Полихлорированные бифенилы (ПХБ) относятся к группе известных загрязнителей окружающей среды, приводящих к возникновению ряда заболеваний, связанных с повреждением кожных покровов, заболеваниями печени, нарушениям в гормональной деятельности организма [141, 142], Это устойчивые соединения: на открытом воздухе период полураспада может составлять от 10 до 100 лет. Они находят применение в холодильных установках, как пластификаторы в пластмассах, а также как жидкие теплоносители и в качестве компонента технических масел. Токсичность ПХБ заметно возрастает с увеличением содержания в них хлора [24, 54]. Формы с меньшим содержанием хлора (около 30%) менее устойчивы и легче выводятся из организма, чем высокогалогенированные (> 60%) соединения [54]. Для полностью галогенированных соединений характерно почти полное отсутствие токсичности- Данные о генотоксической активности ПХБ противоречивы. В ряде работ был исследован уровень аберраций хромосом лимфоцитов периферической крови лиц, подвергавшихся воздействию ПХБ, Показано [174], что у 52,7 % пациентов, контактирующих с этими загрязнителями, наблюдали повышение как содержания в крови ПХБ, так и уровня аберраций хромосом. По данным чехословацких исследователей [132], рабочие, подвергавшиеся в течение 10 лет воздействию продуктами Делор 103 и Делор 106, имеют повышенный уровень аберраций хромосом и сестринских хромосомных обменов в периферических лимфоцитах, а также повышенный уровень содержания ПХБ в крови. Аналогичные данные получены и югославскими авторами [131], которые обнаружили повышенный уровень
микроядер и сестринских хроматидных обменов в периферических лимфоцитах рабочих, соприкасавшихся с ПХБ, В работе американских авторов [139], исследовавших периферические лимфоциты тайваньских женщин, подвергавшихся воздействию ПХБ, не было обнаружено изменений в уровне аберраций хромосом в лимфоцитах, однако оказалось, что лимфоциты пациенток с повышенным содержанием в крови ПХБ обладают повышенной чувствительностью к индукции в них сестринских хроматидных обменов, В работе [144, 158] было показано, что кластогенная активность ПХБ зависит от их структуры. Так обработка лимфоцитов планарным 3,4,3',4'~ тетрахлорбифенилом в концентрациях от 0,0001 до 0,1 мкг/мл приводит к появлению дозозависимого увеличения выхода аберраций хромосом, в то время как при обработке лимфоцитов непланарным З^^'^'-тетрахлорбифенилом не было обнаружено аберраций хромосом даже при концентрации этого агента равной 1 мкг/мл. Кроме того, в ряде работ показано влияние ПХБ на активность ферментов АО защиты рыб, снижение активности СОД, пероксидазы и глутатионредуктазы [74, 113, 172]. Показано на угре и рыбах, что ферменты I фазы биотрансформации ксенобиотиков наиболее чувствительны к действию ПХБ, чем ферменты II фазы [173,174].
Полициклические ароматические углеводороды (ПАУ) во многом сходны с ПХБ, они почти не растворимы в воде, имеют высокую температуру кипения и с трудом поддаются разрушению. В 30-х годах нашего столетия были открыты химические канцерогены в классе полициклических ароматических углеводородов (ПАУ), типичным представителем и индикатором служит бенз(а)пирен (БП), БП является наиболее опасным канцерогенном, а в тех объектах, где он обнаруживается, обычно" присутствуют и другие ПАУ- Источником выброса ПАУ являются предприятия, электростанции и транспорт, сжигающие и перерабатывающие нефтепродукты. Ежегодно в
окружающую среду выбрасывается до 5000 тонн БП, часть которого разрушается в окружающей среде, В крупных городах в организм человека за счет вдыхания воздуха с выхлопными газами в день может попадать до 0.6 мг БП, т.е. то количество, которое содержится в дыме 50 сигарет [8], Увеличение содержания БП в воздухе производственных помещений увеличивает число аберраций в лимфоцитах рабочих угледобывающей промышленности [183]. По данным американских исследователей, повышение содержания в 1 куб. м. БП на I мкг увеличивает на 5 % вероятность смерти от заболевания раком легких [170]. В организме БП метабилизируется в печени с образованием активных продуктов, в частности бснз(а)пирен диол эпоксида [104, 176], способных взаимодействовать с ДНК с образованием различных ДНК-адцуктов [158, 172], В работе [146] показано, что 3, 4- беиз(а)пирен вызывает пролиферацию клеток печени крыс,
Бенз(а)пирен обладает генотоксическим действием на живые организмы. Так, согласно данным работы [138], введение мышам БП в дозе 6.25 мг/кг увеличивает в костном мозге число аберраций хромосом, а при введение БП в дозе 25 мг/г увеличивается число микроядер в полихроматофильных эритроцитах. Длительное (от 2-х до 8 суток) пребывание в водной среде, содержащей БП в концентрациях от 0,0125 до 0-050 мкг/мл, увеличивает число микроядер в эритроцитах личинок тритонов.
Одним из химических агентов, с которым наиболее часто контактирует человек, является ацетон. Он широко используется в промышленности, главным образом, как растворитель и промежуточное звено на химическом производстве, в производстве лекарственных средств, а также в пищевой промышленности как растворитель для жиров и масел или осаждающее средство в очистке крахмала и сахара. Ацетон попадает в поверхностную воду рек и озер со сточными водами
промышленных предприятий, например, при производстве бумаги, пластмассы, фармацевтических препаратов, краски и т.п. Источниками выброса ацетона в почву являются сельскохозяйственные и пищевые отходы, домашние сточные воды и места выброса химических отходов.
Ацетон является метаболическим компонентом и содержится в крови и выдыхаемом воздухе. Ацетон обнаружен во многих растениях и пищевых продуктах, включая помидоры, молоко, бобы, грудку цыпленка и т.д. Естественные испарения от различных разновидностей деревьев также содержат ацетон. Таким образом, воздействие ацетона на организм может происходить как естественным, так и антропогенным путем [136].
Ацетон может поступать в организм вследствие ингаляции его парами, через пищеварительный тракт, кожу. Он быстро транспортируется по всему телу- Несмотря на то, что ацетон распределен во всех тканях, главным органом его накопления и метаболизма в организме является печень. Ацетон действует, прежде всего, как депрессант центральной нервной системы [51]. Он относительно менее ядовит, чем многие другие промышленные растворители; однако, при высоких концентрациях пары ацетона могут вызвать слабость, кардиореспираторный отказ и смерть [136]. Поэтому ацетон относят к растворителям сравнительно низкой токсичности и токсичным при хронических воздействиях [147].
Исследованиям биологических последствий воздействия ацетона на сложные организмы посвящены единичные работы [51, 136, 147]. Более изучены биологические последствия ингаляций паров ацетона. Показано, что длительное воздействие на крыс ингаляциями ацетона, произвело обратимое уменьшение абсолютной массы мозга. При этом изменений массы других органов или целого тела не было обнаружено. Однако наличие ацетона в разных концентрациях в питьевой воде, вызывало изменение содержания гемоглобина, увеличение индекса печени и селезенки [136].
Одним из наиболее распространенных техногенных неблагоприятных факторов - поверхностно-активные вещества (ПАВ). Их роль в формировании биологических последствий совместного действия разных агентов возрастает вследствие свойств ПАВ способствовать проникновению в клетки гидрофобных соединений. Эту особенность ПАВ обычно использует на практике для профилактического или терапевтического введения жирорастворимых препаратов в организм. Для этих целей часто используют полиоксиэтиленсорбитанмоноолеат (твин-80) [15]. Так, в работе [96], было обнаружено, что при совместном воздействии твина - 80 и рентгеновского излучения в малой дозе возникают нарушения функционирования физико-химической системы регуляции ПОЛ, проявление которых зависит от времени после воздействия, времени введения твина - 80 (до или после облучения), типа изученного параметра и исследуемой ткани. При введении твина-80 как до, так и после облучения величина АОА липидов печени оказалась приблизительно у половины животных каждой из опытных групп достоверно ниже, а у другой существенно выше соответствующего показателя в контрольной группе. Масштаб изменения содержания продуетов ПОЛ липидов в печени мышей, которым вводили ПАВ после облучения, был более значителен, чем в группе мышей, которым твин-80 вводили до облучения животных. Выявлены существенные изменения масштаба взаимосвязи между обобщенными показателями состава фосфолипидов в печени интактных и опытных мышей спустя месяц после воздействия.
1.4 Роль параметров системы регуляции ПОЛ в формировании биологических последствий действия неблагоприятных экологических факторов,
В настоящее время общепризнано, что ионизирующее излучение при остром воздействии оказывает существенное влияние на антиоксидантний (АО) статус, липидный обмен и структурное состояние мембраной системы клеток и тканей животных [15, 28, 47, 69, 89]. Установлено, что в ранние сроки острое облучение животных оказывает неодинаковое воздействие на скорость синтеза разных классов липидов в тканях и клеточных органеллах [47], а величина АОА липидов критических органов является одним из показателей клеточного метаболизма, обеспечивающих радиорезистентность животных разных видов и линий [20], Однако имеются лишь отдельные исследования отдалённых последствий острого воздействия излучения в сублетальных дозах на величину АОА и состав липидов тканей [15, 25, 98]. Кроме того, практически отсутстоуют данные о связи АО статуса с изменениями характеристик липидов тканей у животных, выживших после острого облучения. Поскольку масштаб изменения различных показателей липидного обмена под действием радиации зависит от чувствительности параметра и возможности его восстановления [15, 23, 47]- То одной из задач нашего исследования явилось^ изучение влияния исходного АО статуса органов и крови животных разных видов на состояние параметров физико-химической системы регуляции ПОЛ спустя месяц после острого облучения в сублетальных дозах.
Рост числа техногенных катастроф вызывает острую необходимость изучения биофизических механизмов совместного действия повреждающих факторов разной природы, и исследования взаимосвязей в тканях и баланса функций в организме для оценки биологических последствий их воздействия. Особую опасность представляет вероятность
появления синергического эффекта различных химических и физических
факторов [66].
І Важная роль в поддержании гомеостаза организма в норме и при
патологических состояниях принадлежит кроветворной системе и гепатоцитам печени. Изменения кроветворной системы, вызванные факторами окружающей среды, имеют приоритетное значение при формировании как ранних, так и отдаленных биологических эффектов повреждающих воздействий. Показано, что гепатоциты обладают высокой чувствительностью к техногенному радиоактивному и химическому загрязнению среды [36, 52» 97, 100, 103]. Эти аргументы и обусловили выбор печени, крови и селезенки в качестве основных объектов для анализа биологических последствий воздействия неблагоприятных экологических факторов на сложные биологические организмы. Перспективным методом исследований для прогнозирования влияния неблагоприятных экологических факторов на окружающую среду и здоровье человека является анализ параметров физико-химической системы регуляции перекисного окисления лнпидов, изменение интенсивности которого сопутствует многим патологическим состояниям [4, 109]. Установлена огромная чувствительность параметров системы регуляции ПОЛ в тканях грызунов к действию неблагоприятных экологических факторов [16,92, 98].
Недостаточность информации об отдаленных биологических последствий действия острого облучения в сублетальных дозах, химических токсикантов в малых дозах, а также их совместного влияния на состояние параметров физико-химической системы регуляции ПОЛ вызывает необходимость проведения данной работы.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Условия радиобиологических экспериментов.
Острое рентгеновское облучение в сублетальных дозах.
Опыты проводили на 55 мышах-самках SHK (масса 17-27 г); 80 мышах-самках линии СВА (масса 15-19 г) и 18 беспородных крысах-самцах (масса 130-175 г). Однократное рентгеновское облучение мышей линии СВА и беспородных крыс в дозе 4.5 Гр, мышей SHK в дозе 5,0 Гр проводили на аппарате РУТ-200-20-3 при следующих условиях: напряжение 210 кВт сила тока 15 мА, фильтр 0,5 мм Си, мощность дозы 0.44 Гр/мин, Мышей облучали группами по десять штук, крыс по 3 штуки в специальных контейнерах. Для оценки исходных показателей липидного обмена для данной опытной группы проводили забой интактных животных из той же партии (не менее 10 мышей и б беспородных крыс) в день облучения.
Сочеташюе влияние острого рентгеновского облучения в сублстальных дозах 4 Гр и 5 Гр, и 0.3 % раствора твина - 80 в 10 % водном ацетоне изучали на 155 мышах - самцах линии Balb/c (массой 18-24 г). Раствор 0.3 % твина - 80 в 10 % водном ацетоне вводился внутрибрюшино за 30 мин. до облучения.
Однократное рентгеновское облучение мышей линии Balb/c проводили на аппаратах РУТ~200-20-3 и РУМ-17 при следующих условиях: напряжение 210 кВ, сила тока 15 мА, фильтр 0.5 мм Си + 1.0 мм А1, мощность дозы 0.49 Гр/мин. Мышей облучали группами по десять штук в специальных контейнерах. Перед облучением корм вынимался одновременно во всех клетках.
В каждой группе исследовалась динамика гибели животных после облучения. Выжившими считались животные, прожившие после облучения не менее 30 сут.
Расчет % гибели (выживаемости) мышей проводили по формуле [7]:
п \ п
где а — число погибших (выживших) мышей, п — общее число мышей в опыте.
Расчет среднего времени жизни погибших мышей проводился по общепринятому в радиобиологии методу. Достоверность различий рассчитывалась по t - критерию Стьюдента [7], Расчет среднего времени жизни облученных животных проводился с учетом выживших, время жизни которых полагали равным 30 сут.
Спустя месяц после облучения одновременно с выжившими в данном эксперименте забивали по 10 интактпьтх мышей и б беспородных крыс из той же группы (возрастной контроль). Животных забивали декапитацией спустя 1 месяц после облучения. Одновременно с опытными группами проводили забой интактных мышей (по 2-4 животных на каждый срок), У иптактных животных все показатели измеряли у каждого животного. Материал от животных в опытных группах либо объединяли от 2-3 животных, либо анализ показателей проводили у индивидуума.
2.2. Однократное введение химических токсикантов в малых дозах.
Опыты выполнены на 240 мышах - самках SHK массой 21 - 28 г. Забор воды из подземных водоисточников производили из двух населенных пунктов Зикеево (3) и Мужитино (М) Калужской области, которые различались содержанием БП и ПХБ* Исследованиями сотрудников НПО "Тайфун" установлено, что в экстракте М концентрация БП в 3.3 раза
выше, а суммарное содержание ПХБ равно 0.765 относительно соответствующих величин для экстракта 3, при этом содержание каждого химического вещества в питьевой воде было ниже ПДК. Гексан-эфирные экстракты воды вводили перорально (в оливковом масле) в дозах 53 (группы мышей 0); 5.3 х 10 "2 (группы мышей 1); 5.3 * 10 "5 (группы мышей 2) мг/кг. Забой животных проводили в одно и то же время суток (8 - 11 ч-утра) через 7, 14 и 31 сут после введения экстрактов. Одновременно с опытными животными проводили забой контрольных мышей (по 10 — 20 мышей на каждый срок). Контролем служили мыши, которым однократно перорально одновременно с опытными животными вводили оливковое масло. У интактиых животных все показатели измеряли у каждого животного. Материал от мышей в опытных группах объединяли от 3 - 4 животных.
2.3. Выделение липидов.
Для выделения липидов из тканей использовали метод Фолча в модификации Кейтса [41].
Печень и селезенку сразу после забоя помещали в бкжсы, охлажденные льдом, и гомогенизировали в стеклянном гомогенизаторе Поттера в 6.2 мл и 2 мл дистилированной воды, соответственно. Затем переносили гомогенат в колбу и добавляли 25 мл или 12.5 мл смеси хлороформ-метанол (1:2). Для полноты экстракции пробы оставляли на сутки в холодильнике. На следующий день пробы отфильтровывали, промывали смесью хлороформ-метанол-вода (1:2:0.8), к измеренному объёму фильтрата добавляли хлороформ и дистиллированную воду из расчёта по 2.5 мл хлороформа (х.ч.) и воды па каждые 9 мл фильтрата. Для отделения хлороформных растворов липидов от смеси воды и метанола (х.ч.) пробы помещали в холодильник не менее чем на 12 часов. Затем отбирали хлороформный слой, содержащий липиды, и оставляли его на сутки в холодильнике с осушителем (безводный сернокислый натрий фирмы
Sigma) для удаления воды. После отфильтровывания осушителя хлороформ удаляли с помощью водоструйного насоса до постоянной массы липидов.
2А Определение продуктов ПОЛ и белка
Определение продуктов, взаимодействующих с 2- тиобарбитуровой кислотой [ТБК-активные продукты, ТБК-АП], проводили по методу [81] в модификации [106]* Перед началом анализа печень гомогенизировали в 63-8 мл дистиллированной воды, селезенку в 2 мл дистиллированной воды. Аликвоту суспензии гомогената ткани или плазмы крови (0.2-0.25мл) добавляли к 1 мл 20 % раствора трихлоруксусной кислоты, к которому предварительно было добавлено 0.01 мл 0,01 % раствора ионола (х.ч,) в спирте. После добавления к пробам дистиллированной воды и по 1 мл 0,7%-ного водного раствора 2-тиобарбитуровой кислоты (фирмы Sigma) пробы кипятили на водяной бане в течение 15 мин. После центрифугирования определяли их оптическую плотность на спектрофотометре Du-50 (фирма Beckman, США) или фотоэлектрическом фотометре КФК-3 при длине волны 532 нм относительно глухой пробы на реактивы.
Содержание ТБК- активных продуктов в растворе рассчитывали по формуле:
ОхЗ-01
[ТБК-АП]
Ч^хЮ^І^бхЮ5'
где Упробы - объем суспензии гомогената ткани или плазмы крови; 3,01 - суммарный объем опытной пробы; D — оптическая плотность раствора при X = 532 нм; 1,56x10s - коэффициент молярной экстинции. Каждое измерение проводили в трех параллельных повторностях.
Количество белка в пробах определяли с помощью модифицированного биуретового метода [129] по интенсивности окраски
их комплексного соединения с Си в щелочной среде. Кровь отбирали в пробирки, обработанные 5%-ным раствором цитрата натрия. Эритроциты отделяли от плазмы крови центрифугированием. Для анализа количества белка ОЛ мл плазмы крови, суспензии гомогената печени или селезенки разбавляли в 1,0 мл; 3.0 мл и 1.5 мл дистиллированной воды соответственно. В пробирки отбирали по 0,2 мл полученной суспензии печени, по 0,25 мл суспензии селезенки, по 0.3 мл плазмы крови и, добавляли дистиллированной воды до 1мл и по 0.5 мл 0.21 % раствора CuS04 в 30 % растворе NaOH. Оптическую плотность проб анализировали на спектрофотометре* Du - 50 (фирма Bcckman, США) или КФК-3 при длине волны 540 нм. Для построения соответствующей калибровочной прямой использовали водный раствор яичного альбумина. Концентрацию белка рассчитывали по формуле: Сбелка=К х D540 ш, где К - коэффициент учитывающий разбавление и tg угла наклона калибровочной прямой, П540нм-оптическая плотность пробы при Я.=540 нм. Каждое измерение проводили в трех параллельных иовторностях. 2.5. Анализ показателей антиоксидантного статуса липидов Величину АОА липидов определяли на метилолеатной окислительной модели [15] по разности периодов индукции окисления метилолеата который предварительно очищали перегонкой в вакууме, в присутствие и отсутствие липидов, отнесенной к единице массы липидов. Окисление проводили в окислительных ячейках со стеклянным пористым фильтром при температуре окисления 37.0±0.1С. Рабочая концентрация липидов в метилолеате 10-20 мг/мл. Через раствор липидов в метилолеате воздух продували с такой скоростью, чтобы процесс термического автоокисления протекал в кинетической области, т.е. не зависел от концентрации кислорода. За ходом окисления следили по количеству образовавшихся пероксидов. За величину периода индукции принимали
время, при котором концентрация псроксидов достигала величины 0,02 или 0,035 ммоль/г. Определение количества пероксидов в липидах проводили методом йодометрического титрования [9] или использовали стандартную методику ГОСТ 26593. К взвешенной пробе 0.02-0,05 г. добавляли 4 мл смеси ледяной уксусной кислоты х.ч. и хлороформа х.ч. (1: 1 по объему) и приливали избыток (0.1мл) насыщенного водного раствора йодистого калия ос.ч. Пробирку закрывали пробкой и выдерживали 3 минуты. Перед титрованием в каждую колбу добавляли не менее 10 мл дистиллированной воды и выделившийся по реакции йод титровали 0.01N раствором тиосульфата натрия. Количество псроксидов определяли по формуле:
[ROOH] = , где
N - нормальность тиосульфата; V - объем тиосульфата, пошедший на титрование; р - навеска; 2- эквивалент тиосульфата натрия в реакции с йодом.
Все полученные результаты приводили к стандартным значениям-Величину АОА липидов вычисляли по формуле: Т1-то Wo
АОА= х t
С Wo станд
где ті- период индукции окисления растворов липидов в метилолсате, то — период индукции окисления чистого метилолеата; С-концентрация липидов; Wo станд. - скорость зарождения радикалов стандартного метилолеата. Wo — скорость зарождения радикалов для опытной партии метилолеата. В качестве стандарта выбран метилолеат, скорость зарождения радикалов которого равна 2.9х10"10 Мхе-1, а период индукции
окисления 20 час. Начальное количество пероксидов в липидах, либо определяли йодометрически непосредственно в липидах, либо оценивали по разности концентраций пероксидов в растворах липидов в метилолеата и чистого метилолеата, отнесенных к количеству липидов и измеренных до начала окислення, Антипероксидную активность (АПА)- способность липидов разлагать пероксиды на молекулярные продукты без образования свободных радикалов оценивали по разности пероксидов в метилолеате и в растворе липидов в метилолеате до начала окисления, отнесенной к 1 г липидов [60],
2-6. Количественное определение состава фосфолипидов.
Качественный и количественный состав фосфолипидов (ФЛ) определяли методом тонкослойной хроматографии [10], Для тонкослойной хроматографии использовали силикагель типа G по Шталю и стеклянные пластинки размером 9x12 см. Для удаления посторонних примесей пластинки промывали сначала ПАВ, затем выдерживали в хромовой смеси, прополаскивали проточной водой, затем дистиллированной водой и подсушивали. 1,5 г силикагеля размешивали в 5 мл раствора (6,8 мг Na2C03 на 100 мл воды), полученную суспензию выливали на пластинку и быстро разравнивали, затем высушивали в строго горизонтальном положении. Перед использованием пластинки активировали нагреванием в сушильном шкафу при температуре 200 С в течение 10-20 мин,
Липидыв виде раствора в хлороформе в концентрации 5 или 10 мг/мл наносили с помощью микрошприца на пластинки в количестве 100-200 мкг на пятно- В отдельную пробирку отбирали раствор для определения содержания общих липидов. Пластинку с нанесенными липидами помещали в предварительно насыщенную в течение 30-40 минут парами растворителей хромата графическую камеру, В качестве системы растворителей, использовали смесь хлороформ (хл)-метанол (хл.)-ледяная уксусная кислота (х.ч.)-вода в соотношениях 12,5: 7.5:2:1.
После "прогонки" в системе растворителей пластинки высушивали под приточно-вытяжной вентиляцией до исчезновения запаха уксусной кислоты и проявляли в парах йода. Затем хроматограммы зарисовывали, быстро и аккуратно «обкалывали» пятна иглой.
Для количественного анализа фосфолипидов пятна снимали специальной лопаточкой и переносили в маркированные пробирки. Для анализа основных фракций ФЛ (ФХ и ФЭ), соскребали по одному пятну в пробирку, а для анализа минорных фракций по 2-3 пятна с параллельных дорожек.
Для определения содержания неорганического фосфата в каждую пробирку добавляли по 0,1 мл 62% хлорной кислоты и выдерживали при температуре выше 200 С в течение 1,5-2 часа. После охлаждения в каждую пробирку добавляли в виде смеси 0.36 мл 62% хлорной кислоты, 0-94 мл дистиллированной воды, 0,4 мл 1.25% раствора молибдата аммония (фирмы Serva), 0.4 мл 5% раствора аскорбиновой кислоты. Затем пробирки ровно 5 минут выдерживали в кипящей воде. Концентрацию неорганического фосфата определяли спектрофотометрически по образованию фосфорно-молибденового комплекса в присутствии аскорбиновой кислоты при длине волны 810 нм на спектрофотометре Du-50, Построение калибровочной прямой проводили по раствору калия фосфорнокислого однозамещенного квалификации о.с.ч. Используя полученные значения оптических плотностей проб» рассчитывали процентное содержание каждой фракции в составе ФЛ, а также суммарное содержание ФЛ.
Помимо анализа количественного соотношения различных фракций фосфолипидов (ФЛ), оценивали и обобщенные показатели состава липидов: содержание фосфолипидов в составе общих липидов (%ФЛ); соотношение фосфатидилхолин/фосфатидилэтаноламин (ФХ/ФЭ) и
соотношение сумм более лсгкоокисляемых (ЛО) к более
трудноокисляемым (ТО) фракциям ФЛ (ІЛОФЛ/ЕТОФЛ). Последнее вычисляли по формуле [10]:
2ЛОФЛ/ХТОФЛ=(ФИ+ФС+ФЭ+КЛ+ФК)/(ЛФХ+СМ+ФХ), где ФИ - фосфатидилинозит, ФС - фосфатидилсерин, КЛ - кардиолипин, ФК - фосфатидная кислота, ЛФХ - лизоформы ФЛ, СМ - сфингомиелин. Каждая экспериментальная точка это результат анализа не менее 3-6 параллельных дорожек.
2.7. Определение холестерина в пробах.
Анализ количества холестерина (ХС) в липидах проводили по методу [160]. Навеску липидов растворяли в 1 мл хлороформа, добавляли одновременно 50 мкл концентрированной серной кислоты и 0.5 мл уксусного ангидрида, выдерживали пробирки в темноте в течение 30 мин. до образования комплекса холестерина с уксусным ангидритом.
Количество холестерина определяли на спектрофотометре Du-50 или на фотоэлектрическом фотометре КФК-3 при длине волны 625 нм. Для построения калибровочной прямой использовали холестерин (фирмы Sigma).
2.8. Статистическая обработка результатов.
Экспериментальные данные обрабатывали общепринятыми методами вариационной статистики [56] и с помощью компьютерного пакета программ KINS [12]. Данные на рисунках и в таблицах представлены в виде средних арифметических с указанием средних квадратичных ошибок среднего арифметического, а также в виде приращения. Последнее вычисляли по формуле:
(О/К)хЮ0-1003 где О-среднеарифметическое значение показателя в опытной группы» К-среднеарифметическое значение того же показателя в контрольной группе.
Вариабельность показателя оценивали как отношение средней квадратичной ошибки среднего арифметического к величине среднеарифметического значения показателя для анализируемой группы в процентах [56].
Трансформация гидрофобных ксенобиотиков в организме животных
Воздействие чужеродных химических соединений - ксенобиотиков (КБ) на живые организмы имело место всегда, но особенно усилилось в индустриальную эру, когда антропогенная активность стала существенным фактором химического загрязнения объектов окружающей среды. Эволюционно в живых организмах существует несколько систем, препятствующих неблагоприятному воздействию чужеродных веществ (ксенобиотиков) на клетки. Белок Р-гликопротеин, расположен во внешней мембране клетки,- и «выбрасывает» во внеклеточное пространство ксенобиотики, предохраняя внутриклеточное компоненты клетки от их воздействия- Монооксигеназная ферментная система (I фаза), окисляющая липофильные соединения, в том числе чужеродные вещества, с образованием более водорастворимого метаболита, чем исходное соединение. Ферменты конъюгации (II фаза), катализирующие взаимодействие окисленных ксенобиотиков с глутатионом, глкжуроновой и другими кислотами, что делает их более водорастворимыми и способствует быстрому выведению из организма. Основным функциональным назначением этих ферментов является поддержание внутриклеточного гомеостаза в конечном счете поддержание гомеостаза всего организма [45]. Трансформация ксенобиотиков в клетке происходит первоначально в результате окислительно-восстановительных превращений, катализируемыми цитохромами группы Р-450, оксидазами, редуктазами и дегидрогеназами. Основным ферментом микросомальной монооксигеназной системы является цитохром Р-450 [5]. Окисление субстрата SH под влиянием цитохрома,Р-450 описывается реакцией; Другими словами, из двух атомов О молекулы 02 один атом внедряется в молекулу субстрата, другой востанавливается до воды. Цитохром Р-450 - это общее название широкого семейства гсмопротеинов, катализирующих метаболизм большого числа не только ксенобиотиков, но и эндогенных соединений, Цитохром Р-450 является мембраносвязанным, липидзависимым ферментом- Локализованы цитохромы Р-450 преимущественно в эндоплазматическом ретикулумс, хотя некоторое количество обнаруживаются в ядерных мембранах и митохондриях [152]. В отличие от ферментов, вовлеченных в метаболизм эндогенных соединений, для ферментов метаболической активации и детоксикации ксенобиотиков характерна низкая субстратная специфичность.
Столь нехарактерное для энзиматических реакций отсутствие специфичности объясняется существованием большого количества изоформ с различным механизмом регуляции экспрессии и являющихся продуктом различных генов. Существует около 100 изоформ цитохрома Р-450, которые можно разделить на две категории. Изоформы, необходимые для синтеза стероидных гормонов, расположены в надпочечниках, яичниках, семенниках, молочной железе, а изоформы, назначение которых сводится к выведению чужеродных липофильных веществ из организма, экспрессированы в органах, наиболее подверженных воздействию чужеродных веществ: печень, почки, легкие, кожа. При этом организмы, отличающиеся по изоферментному спектру цитохрома Р-450, могут по -разному метаболизировать одни и те же ксенобиотики и вследствие этого обладать разной чувствительностью к их действию. Помимо цитохрома Р-450, в монооксигеназную ферментативную систему входят цитохром bs, флавопротеид NADP Н- цитохром Р-450 редуктаза и НАД-Н-цитохром bs- редуктаза [5]. Как уже отмечалось, для функционирования цитохрома Р-450 требуется наличие фосфолипидов, в работах in vivo [114, 32] показано, что фосфатидилхолин является ФЛ эффектором системы цитохрома Р-450, Эксперименты с очищенными компонентами монооксигеназной ферментной системы показали, что окисление многих субстратов более эффективно в присутствии цитохрома Ы [178, 44], хотя механизм участия этого гемопротеида в цитохром Р-450-зависимых реакций пока не ясен. NADP Н- цитохром Р-450 редуктаза, влияющая на каталитические свойства цитохрома Р-450, является амфипатичным белком. Ее "якорная" часть, или "ножка" погружена в мембрану, а "головка", в состав которой входит активный центр (ФМН или ФАП), находится в цитозоле. Считается, что часть изоферментов цитохрома Р-450 полностью погружена в липидный матрикс мембраны - Р-450(Л), а другая часть -функционально важный домен цитохрома, содержащий гем, локализуется на границе раздела мембрана/ цитоплазма - Р-450(В). Различием в гидрофобности изоформ цитохрома Р-450 и в локализации их активных центров в липидах мембраны или в цитозоле, можно объяснить некоторые особенности метаболизма гидрофобных субстратов с участием этих ферментов [37], В случае полициклических ароматических углеводородов (ПАУ), исходная молекула не содержит в своей структуре каких-либо функциональных полярных группировок, является истинно гидрофобной молекулой. Попадая в клетку, ПАУ локализуется в липидном матриксе мембран, что может привести к нарушению их функционирования [26]. Удаление таких молекул из мембран происходит в результате внедрения в их состав полярных групп под действием цитохрома Р-450 с образованием фенолов и эпоксидов. В частности, считается, что в окислительном метаболизме одного и того же исходного субстрата, например, бенз(а)пирена (БП), на разных стадиях его биотрансформации принимают участие разные изоформы цитохрома Р-450 [80].
Роль параметров системы регуляции ПОЛ в формировании биологических последствий действия неблагоприятных экологических факторов
В настоящее время общепризнано, что ионизирующее излучение при остром воздействии оказывает существенное влияние на антиоксидантний (АО) статус, липидный обмен и структурное состояние мембраной системы клеток и тканей животных [15, 28, 47, 69, 89]. Установлено, что в ранние сроки острое облучение животных оказывает неодинаковое воздействие на скорость синтеза разных классов липидов в тканях и клеточных органеллах [47], а величина АОА липидов критических органов является одним из показателей клеточного метаболизма, обеспечивающих радиорезистентность животных разных видов и линий [20], Однако имеются лишь отдельные исследования отдалённых последствий острого воздействия излучения в сублетальных дозах на величину АОА и состав липидов тканей [15, 25, 98]. Кроме того, практически отсутстоуют данные о связи АО статуса с изменениями характеристик липидов тканей у животных, выживших после острого облучения. Поскольку масштаб изменения различных показателей липидного обмена под действием радиации зависит от чувствительности параметра и возможности его восстановления [15, 23, 47]- То одной из задач нашего исследования явилось изучение влияния исходного АО статуса органов и крови животных разных видов на состояние параметров физико-химической системы регуляции ПОЛ спустя месяц после острого облучения в сублетальных дозах.
Рост числа техногенных катастроф вызывает острую необходимость изучения биофизических механизмов совместного действия повреждающих факторов разной природы, и исследования взаимосвязей в тканях и баланса функций в организме для оценки биологических последствий их воздействия. Особую опасность представляет вероятность появления синергического эффекта различных химических и физических факторов [66].
Важная роль в поддержании гомеостаза организма в норме и при патологических состояниях принадлежит кроветворной системе и гепатоцитам печени. Изменения кроветворной системы, вызванные факторами окружающей среды, имеют приоритетное значение при формировании как ранних, так и отдаленных биологических эффектов повреждающих воздействий. Показано, что гепатоциты обладают высокой чувствительностью к техногенному радиоактивному и химическому загрязнению среды [36, 52» 97, 100, 103]. Эти аргументы и обусловили выбор печени, крови и селезенки в качестве основных объектов для анализа биологических последствий воздействия неблагоприятных экологических факторов на сложные биологические организмы. Перспективным методом исследований для прогнозирования влияния неблагоприятных экологических факторов на окружающую среду и здоровье человека является анализ параметров физико-химической системы регуляции перекисного окисления лнпидов, изменение интенсивности которого сопутствует многим патологическим состояниям [4, 109]. Установлена огромная чувствительность параметров системы регуляции ПОЛ в тканях грызунов к действию неблагоприятных экологических факторов [16,92, 98].
Недостаточность информации об отдаленных биологических последствий действия острого облучения в сублетальных дозах, химических токсикантов в малых дозах, а также их совместного влияния на состояние параметров физико-химической системы регуляции ПОЛ вызывает необходимость проведения данной работы.
Однократное введение химических токсикантов в малых дозах
Опыты проводили на 55 мышах-самках SHK (масса 17-27 г); 80 мышах-самках линии СВА (масса 15-19 г) и 18 беспородных крысах-самцах (масса 130-175 г). Однократное рентгеновское облучение мышей линии СВА и беспородных крыс в дозе 4.5 Гр, мышей SHK в дозе 5,0 Гр проводили на аппарате РУТ-200-20-3 при следующих условиях: напряжение 210 кВт сила тока 15 мА, фильтр 0,5 мм Си, мощность дозы 0.44 Гр/мин, Мышей облучали группами по десять штук, крыс по 3 штуки в специальных контейнерах. Для оценки исходных показателей липидного обмена для данной опытной группы проводили забой интактных животных из той же партии (не менее 10 мышей и б беспородных крыс) в день облучения.
Сочеташюе влияние острого рентгеновского облучения в сублстальных дозах 4 Гр и 5 Гр, и 0.3 % раствора твина - 80 в 10 % водном ацетоне изучали на 155 мышах - самцах линии Balb/c (массой 18-24 г). Раствор 0.3 % твина - 80 в 10 % водном ацетоне вводился внутрибрюшино за 30 мин. до облучения.
Однократное рентгеновское облучение мышей линии Balb/c проводили на аппаратах РУТ 200-20-3 и РУМ-17 при следующих условиях: напряжение 210 кВ, сила тока 15 мА, фильтр 0.5 мм Си + 1.0 мм А1, мощность дозы 0.49 Гр/мин. Мышей облучали группами по десять штук в специальных контейнерах. Перед облучением корм вынимался одновременно во всех клетках.
В каждой группе исследовалась динамика гибели животных после облучения. Выжившими считались животные, прожившие после облучения не менее 30 сут. Расчет % гибели (выживаемости) мышей проводили по формуле [7]: где а — число погибших (выживших) мышей, п — общее число мышей в опыте. Расчет среднего времени жизни погибших мышей проводился по общепринятому в радиобиологии методу. Достоверность различий рассчитывалась по t - критерию Стьюдента [7], Расчет среднего времени жизни облученных животных проводился с учетом выживших, время жизни которых полагали равным 30 сут.
Спустя месяц после облучения одновременно с выжившими в данном эксперименте забивали по 10 интактпьтх мышей и б беспородных крыс из той же группы (возрастной контроль). Животных забивали декапитацией спустя 1 месяц после облучения. Одновременно с опытными группами проводили забой интактных мышей (по 2-4 животных на каждый срок), У иптактных животных все показатели измеряли у каждого животного. Материал от животных в опытных группах либо объединяли от 2-3 животных, либо анализ показателей проводили у индивидуума.
Опыты выполнены на 240 мышах - самках SHK массой 21 - 28 г. Забор воды из подземных водоисточников производили из двух населенных пунктов Зикеево (3) и Мужитино (М) Калужской области, которые различались содержанием БП и ПХБ Исследованиями сотрудников НПО "Тайфун" установлено, что в экстракте М концентрация БП в 3.3 раза выше, а суммарное содержание ПХБ равно 0.765 относительно соответствующих величин для экстракта 3, при этом содержание каждого химического вещества в питьевой воде было ниже ПДК. Гексан-эфирные экстракты воды вводили перорально (в оливковом масле) в дозах 53 (группы мышей 0); 5.3 х 10 "2 (группы мышей 1); 5.3 10 "5 (группы мышей 2) мг/кг. Забой животных проводили в одно и то же время суток (8 - 11 ч-утра) через 7, 14 и 31 сут после введения экстрактов. Одновременно с опытными животными проводили забой контрольных мышей (по 10 — 20 мышей на каждый срок). Контролем служили мыши, которым однократно перорально одновременно с опытными животными вводили оливковое масло. У интактиых животных все показатели измеряли у каждого животного. Материал от мышей в опытных группах объединяли от 3 - 4 животных. Для выделения липидов из тканей использовали метод Фолча в модификации Кейтса [41].
Печень и селезенку сразу после забоя помещали в бкжсы, охлажденные льдом, и гомогенизировали в стеклянном гомогенизаторе Поттера в 6.2 мл и 2 мл дистилированной воды, соответственно. Затем переносили гомогенат в колбу и добавляли 25 мл или 12.5 мл смеси хлороформ-метанол (1:2). Для полноты экстракции пробы оставляли на сутки в холодильнике. На следующий день пробы отфильтровывали, промывали смесью хлороформ-метанол-вода (1:2:0.8), к измеренному объёму фильтрата добавляли хлороформ и дистиллированную воду из расчёта по 2.5 мл хлороформа (х.ч.) и воды па каждые 9 мл фильтрата. Для отделения хлороформных растворов липидов от смеси воды и метанола (х.ч.) пробы помещали в холодильник не менее чем на 12 часов. Затем отбирали хлороформный слой, содержащий липиды, и оставляли его на сутки в холодильнике с осушителем (безводный сернокислый натрий фирмы Sigma) для удаления воды. После отфильтровывания осушителя хлороформ удаляли с помощью водоструйного насоса до постоянной массы липидов.
Влияние острого облучения в сублетальных дозах на состав липидов тканей животных
Сравнительный анализ последствий действия острого облучения на липидный обмен в тканях проведен на трех группах животных (беспородных крысах, мышах SHK и линии СВА). Достаточно высокий уровень АОА липидов печени у облученных животных способствует поддержанию состава липидов печени в группе более близким к показателям в печени соответствующего возрастного контроля у более радиорезистентных видов. Так ранее не было выявлено существенных изменений состава липидов печени мышей SHK и обнаружены значительные изменения как относительного содержания фракций, так и обобщенных показателей состава липидов печени более радиочувствительных мышей линии СВА [98], В ФЛ печени радиорезнстентных беспородных крыс спустя месяц после облучения в дозе 4.5 Гр найден некоторый рост относительного содержания ЛФХ, СМ, тенденция увеличения % ФЛ в составе общих липидов при незначительном падении относительного содержания ФК и доли более легкоокисляемых фракций ФЛ по сравнению с соответствующими показателями влипидах печени возрастного контроля.
Несмотря на отсутствие достоверных различий в величинах АОА липидов селезенки в группах возрастного контроля и выживших после облучения животных (табл.1), обнаружены изменения в составе отдельных фракций ФЛ селезенки в опытных группах. Результаты экспериментов представлены в виде приращения (выживших после облучения животных относительно возрастного контроля и выражены в %) приведены на рис. 5, Видно, что существенные изменения количественного содержания обнаружены не только минорных, но и основных фракций ФЛ. Так, в ФЛ селезенки мышей линии СВА, выживших после облучения, наблюдается уменьшение доли более легкоокисляемых фракций ФЛ и увеличение отношения ФХ/ФЭ за счет роста ФХ, относительно соответствующих показателей у возрастного контроля, В ФЛ селезенки беспородных крыс» % выживаемости которых в данном эксперименте достоверно не отличается от аналогичной величины для мышей линии СВА, обнаружено увеличение относительного содержания доли ЛФХ, КЛ и ФК при незначительном снижении доли ФХ и существенном уменьшении доли ФС и % ФЛ в составе общих липидов. В липидах селезенки мышей SHK отмечено снижение относительного содержания доли ЛФХ, ФК и рост доли ФИ и ФС. Наиболее значительные изменения состава ФЛ выявлены в эритроцитах крови облученных животных по сравнению с соответствующими показателями для возрастного контроля. Результаты анализа отдельных фракций ФЛ эритроцитов крови животных, выживших после рентгеновского излучения в сублетальных дозах, представлены на рис. 6 в виде приращения соответствующих показателей относительно контрольных значений и выражены в %. Видно, что рост относительного содержания лизоформ ФЛ наблюдается в эритроцитах крови во всех исследованных группах животных- В эритроцитах крови облученных мышей линии СВА обнаружена тенденция увеличения относительного содержания СМ и ФЭ и уменьшение суммарного содержания ФИ+ФС, доли ФК по сравнению с показателями возрастного контроля.
Значительный рост доли ФХ и особенно в 7 раз доли КЛ, заметное снижение суммарного содержания ФИ+ФС и доли ФЭ найдены в ФЛ эритроцитов крови облученных беспородных крыс. В ФЛ эритроцитов крови облученных мышей SHK выявлено увеличение доли ЛФХ, КЛ и ФК, а суммарное содержание ФИ+ФС снижено по сравнению с показателями в ФЛ эритроцитов крови в группе возрастного контроля, В целом масштаб изменения количественного содержания отдельных фракций в ФЛ эритроцитов крови облученных мышей SHK ниже, чем в группах беспородных крыс и мышей линии СВА. Возможно, это обусловлено достоверным увеличением АОА липидов эритроцитов крови, которое обнаружено только для мышей SHK, выживших после острого облучения (табл.1). Представленные данные свидетельствуют о том, что последствия острого облучения в сублетальных дозах на биосинтез и метаболизм разных фракций ФЛ через месяц после воздействия зависят как от исследованной ткани, так и от вида животного. Ранее была обнаружена обратная корреляционная взаимосвязь между соотношением ЕЛОФЛ/2ТОФЛ, характеризующих способность липидов к окислению, и отношением ФХ/ФЭ, отражающим структурное состояние мембранной системы органа в ФЛ печени мышей SHK [96] и ФЛ тканей полевок-экономок, отловленных на участках с нормальным радиационным фоном [92], Найдено также достоверное изменение коэффициентов линейной регрессии этих корреляционных зависимости как при рентгеновском облучении мышей SHK в малой дозе [96], так и при обитании полевок-экономок на участках с повышенным радиационным фоном [92] или в зоне аварии на Чернобыльской АЭС [52]. Поэтому для оценки степени выраженности количественных изменений в составе ФЛ печени и эритроцитов крови исследованных животных спустя месяц после острого облучения было проведено сопоставление масштаба взаимосвязанности обобщенных показателей состава ФЛ, Рис. 7. Взаимосвязь между соотношением сумм более легкоокисляемых к более трудноокисляемым фракциям и отношением фосфатидилхолин к фосфатидилэтаполамин в фосфолипидах печени А- мышей SHK интактных (I) и спустя 30 сут после облучения в дозе 5 Гр (2); Б. мышей линии СВА интактных (1) и спустя 30 сут после облучения в дозе 4,5 Гр (2); В. беспородных крыс интактных (1) и спустя 30 сут после облучения в дозе 4.5 Гр (2)
Похожие диссертации на Роль параметров системы регуляции перекисного окисления липидов в формировании биологических последствий воздействия неблагоприятных экологических факторов
