Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Литературный обзор
1.1. Биологическуе ритмы, зависимость циклического изменения показателей от условий окружающей среды 10
1.2. Липиды, их функции и роль процессов перекусного окисления липидов в жизнедеятельности организмов 19
1.3. Использование параметров физико-химической системы регуляции перекутого окисления липидов для оценку биологическую последствий воздействия ионизирующего излучения и других повреждающих факуюров 29
Глава 2. Материалы и методы исследования.
2.1. Введение химических агентов, моделирующих антропогенное воздействие 36
2.2. Фадиобиологическуе эксперименты 37
2.3. Выделение липидов 37
2.4. Анализ содержания продукуюв, реагирующих с 2—тобарбитуровой куслотой 38
2.5. Анализ содержания белки 39
2.6. "Количественное определение состава фосфолипидов методом тонкослойной Хроматографии 39
2.7. Методику йодометрическдго определения перок^идов 41
2.8. Определение стеринов в пробах.. 42
2.9. Статистическая обработку результатов 42
Глава 3. Результаты и их обсуждение.
3.1. Влияние характеристику липиЪов на взаимосвязь между показателями состава фосфолипидов в тщняо интхщтныос животных. 45
3.2. Сезонная вариабельность показателей физико-химический системы регуляции угол 55
Заключен ие 93
Выводы 106
Список литературы
- Липиды, их функции и роль процессов перекусного окисления липидов в жизнедеятельности организмов
- Использование параметров физико-химической системы регуляции перекутого окисления липидов для оценку биологическую последствий воздействия ионизирующего излучения и других повреждающих факуюров
- Фадиобиологическуе эксперименты
- Сезонная вариабельность показателей физико-химический системы регуляции угол
Введение к работе
Бурное развитие мембранологии с начала 70-х годов позволило обосновать биологическую важность свободнорадикальных реакций, протекающих в разных компартментах клетки, в регуляции клеточного метаболизма в норме (Владимиров и др., 1972; Бурлакова и др., 1975; Бурлакова, Храпова, 1985; Frankel, 1987; Membrane Lipid Oxidation, 1991; Hensley et al, 2000). Однако, несмотря на обилие работ в области свободнорадикальных исследований, выяснение детального механизма влияния физико-химических свойств липидов на регуляцию биохимических процессов в органах и тканях животных, по-прежнему, является актуальным, вследствие участия процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ) в формировании биологических последствий воздействия на организм повреждающих факторов физической и химической природы (Владимиров и др., 1972; Бурлакова и др., 1975; Гончаренко и др., 1980; Oxidative Stress, 1985; Барабой и др., 1991; Membrane Lipid Oxidation, 1991; S.-Rozca, Salanki, 1994; Hensley at al, 2000; Shtamm et al, 2002; Шишкина, Бурлакова, 2005). Способность липидов принимать участие в реакциях автоокисления при физиологических температурах на стадиях зарождения радикалов и продолжения цепи окисления (Шишкина и др., 1996; Шишкина, Хрустова, 2006) позволяет предположить влияние физико-химических свойств липидов на координацию взаимосвязей между различными показателями в тканях, различающимися интенсивностью процессов ПОЛ. Несмотря на то, что известно участие липидов в важнейших метаболических процессах (Бурлакова и др., 1975; Oxidative Stress, 1985; Степанов и др., 1991; Membrane Lipid Oxidation, 1991; Graber et al, 1994; Климов, Никулъчева, 1995; English, 1996; Ghosh et al, 1997; Дятловитская, Безуглов, 1998; Мартынова, 1998; Проказова и др., 1998), а также в развитии дегенеративных изменений и апоптоза (Алесенко и др., 1998; Kagan et al, 2000; McMillin, Dowhan, 2002; Дудник, 2004), на сегодняшний день практически отсутствуют данные о количественных взаимосвязях между показателями ПОЛ и морфофизиологическими параметрами, позволяющими судить о напряженности обменного баланса в организме (Безелъ, 2006).
Как известно, факторы окружающей среды, оказывая постоянное воздействие на организм, (Даренская и др., 1973; Шишкина и др., 1974; Рогачева и др., 1983; Оленев, 1989; Ораевский и др., 1998; Шилова, 1999; Шшикина, Смотряева, 2000; Кудяшева и др., 2004) могут изменять функциональное состояние организма, антиоксидантный (АО) статус в тканях, интенсивность процессов ПОЛ и реакцию на действие различных факторов, в том числе и на действие ионизирующей радиации. Тем не менее, до сих пор остается мало изученным влияние исходных физико-химических свойств липидов при формировании биологического ответа организма на действие повреждающих факторов разной природы, в то время как изучение биологических последствий совместного действия ионизирующего излучения и химических агентов приобретает особую актуальность вследствие усиления экологического пресса на биоту и роста числа технологических катастроф, связанных, в том числе, и с радиохимическими производствами. В частности, имеются лишь единичные исследования влияния состояния параметров физико-химической системы регуляции ПОЛ в тканях животных на формирование биологического ответа организма при совместном действии малотоксичных химических агентов в малых дозах и рентгеновского излучения в сублетальных и летальных дозах {Урнышева, 2004; Урнышева и др., 2004).
В связи с изложенным, целью данной работы явилось изучение влияния характеристик липидов на регуляцию биохимических процессов в тканях с разной интенсивностью ПОЛ, а также влияния исходного состояния параметров физико-химической системы регуляции ПОЛ в тканях животных на формирование биологических последствий воздействия малотоксичных химических агентов в малых дозах и острого рентгеновского облучения. Для достижения цели работы были поставлены следующие задачи:
1. изучить влияние физико-химических характеристик липидов (антиокислительная активность, АОА; количество пероксидов, [ROOH]o; способность разлагать пероксиды, АПА;) на характер и масштаб взаимосвязей между различными показателями на физиологическом и биохимическом уровнях в норме;
2. сопоставить влияние характеристик липидов на взаимосвязь между обобщенными показателями состава фосфолипидов в печени мышей линии Balb/c при модификации процессов ПОЛ либо введением поверхностно-активного вещества твин-80 и ацетона в малых дозах, либо рентгеновского излучения в сублетальных дозах;
3. изучить влияние окислительных процессов в липидах на состав липидов в печени мышей линии Balb/c после совместного действия малотоксичных твина-80 и ацетона в малых дозах и рентгеновского излучения в сублетальных и летальных дозах при разной интенсивности процессов ПОЛ в тканях контрольных групп животных;
4. провести детальный анализ взаимосвязей между измеренными показателями в норме и при совместном действии 0.3% твина-80 в 10% водном ацетоне и рентгеновского излучения для выявления значимых количественных корреляций между изменением параметров системы регуляции ПОЛ и исходными характеристиками липидов.
Научная новизна работы:
Экспериментально установлена существенная зависимость характера и масштаба взаимосвязей между различными показателями состава фосфолипидов, а также среднегрупповых значений данных показателей от характеристик липидов (АОА, [ROOH]o, АПА) печени и эритроцитов крови лабораторных интактных животных. Показано, что однократное воздействие малотоксичных твин-80 и ацетона в малых дозах модифицирует интенсивность процессов ПОЛ в печени, изменяет физико-химические характеристики липидов и взаимосвязь между скоординированными в норме показателями, вызывая дисбаланс биохимических функций в печени мышей линии Balb/c. Совместное действие 0.3 % твина - 80 в 10 % водном ацетоне и рентгеновского излучения в дозах 4 и 5 Гр нарушает линейную зависимость «радиобиологический эффект - доза», что обусловлено усилением действия острого рентгеновского излучения в дозах 4 и 5 Гр после предварительного введения малотоксичных химических агентов в малых дозах на состав липидов печени. Обнаруясено уменьшение различий масштаба корреляции между обобщенными показателями состава фосфолипидов печени после совместного действия изученных факторов в группах мышей с разным АО статусом тканей.
Комплексный анализ сезонных колебаний среднегрупповых значений параметров системы регуляции ПОЛ в печени и морфометрических показателей мышей линии Balb/c позволил классифицировать измеренные показатели по степени их зависимости от окисленности липидов, а также выявить количественные взаимосвязи между морфофизиологическими показателями и составом фосфолипидов, при этом масштаб и характер полученных корреляций существенно различается в зависимости физико-химических характеристик липидов печени мышей.
Положения выносимые на защиту:
5. степень ненасыщенности липидов, их способность разлагать пероксиды, обеспеченность липидов антиоксидантами, интенсивность процессов ПОЛ в печени мышей линии Balb/c оказывают существенное влияние как на процессы деградации и биосинтеза липидов, так и на индекс данного органа;
6. предварительное введение малотоксичных поверхностно-активных веществ (ПАВ) и ацетона в малых дозах усиливает повреждающее действие острого рентгеновского излучения в сублетальных и летальных дозах на состав липидов печени мышей, при этом линейная зависимость «радиобиологический эффект - доза облучения» отсутствует;
7. выявлены количественные «взаимосвязи второго порядка», определяющие изменения характера и масштаба корреляций между биофизическими и морфофизиологическими показателями как в норме, так и после совместного действия химических и физических факторов;
8. выживаемость мышей линии Balb/c после совместного действия 0.3 % твина - 80 в 10 % водном ацетоне и рентгеновского излучения в дозах 4 и 5 Гр зависит от соотношения основных фракций фосфолипидов (ФЛ) печени в группах возрастного контроля.
Научно-практическая значимость:
Полученные данные расширяют представление о биологических последствиях воздействия малотоксичных химических агентов в малых дозах, рентгеновского излучения в сублетальных дозах, а также совместного действия твина-80 как модельного ПАВ и малотоксичного ацетона в малых дозах и рентгеновского излучения в сублетальных и летальных дозах на живые организмы. Результаты исследований позволяют выявить информативные показатели, в том числе и морфофизиологические, для оценки функционирования сложных систем. Экспериментально обнаруженная взаимосвязь между выживаемостью мышей линии Balb/c и соотношением основных фракций фосфолипидов печени в группах возрастного контроля способствует разработке критериев для выявления групп риска среди категорий населения с разным АО статусом, что представляет несомненный теоретический и практический интерес для экологии и медицины.
Липиды, их функции и роль процессов перекусного окисления липидов в жизнедеятельности организмов
Как известно, к липидам относится широкий круг природных веществ, в частности свободные жирные кислоты, нейтральные триглицериды, воски, фосфолипиды, сфинголипиды, стерины, гликолипиды и т.д. Длительное время липидам отводили довольно скромную роль в жизнедеятельности клеток, рассматривая их как форму депонирования метаболического топлива. Позднее было установлено, что липиды являются одними из основных структурных компонентов клеточных мембран, выполняют не только энергетические, структурные и барьерные функции, но и являются важнейшими биологическими эффекторами, регуляторами и медиаторами, участвующими практически во всех важнейших физиологических процессах (иммунный ответ, передача нейрональной информации, регуляция сосудистого и мышечного тонуса, гемостаз, воспаление и т.д.), происходящих в организме, и в биохимических реакциях, протекающих в клетках животных и человека {Крепе, 1981; Болдырев и др., 1985; Степанов и др., 1991; Болдырев, 1992; Graber et al, 1994; Климов, Никулъчева, 1995; Gavrilova, Petkova, 1995; English, 1996; Дятловитская, Безуглов, 1998; Канапацкая и др., 1998; Мартынова, 1998; Goni, Alonso, 1999). В качестве вторичных мессенджеров они передают внутрь клетки различные внешние сигналы, а также сами являются межклеточными медиаторами (Nishizuka, 1992; Алесенко, 1998; Дятловитская, Безуглов, 1998; Проказова и др., 1998; Kagan et al, 2000; Пийр, Мишарин, 2004).
Таким образом, можно выделить три основные функции липидов: во-первых, липиды - это важнейшие структурные компоненты клеточных мембран; во-вторых, липиды - это важнейшие биоэффекторы, регулирующие внутриклеточные биохимические реакции и межклеточные взаимодействия, а также различные физиологические процессы, происходящие в организме. И, наконец, третья функция, которая много десятилетий считалась единственной, -это энергетический субстрат клетки. Поскольку взаимодействие биоэффекторов с их мишенями и, следовательно, специфичность эффекта определяются строением молекулы, то становится также более понятным столь большое многообразие химических структур липидов (Дятловитская, Безуглов, 1998).
Следовательно, несмотря на достаточно низкую концентрацию липидов в биологических системах (обычно не более 3% от массы клетки), жизнедеятельность клетки и организма в целом не может протекать в их отсутствие.
Липиды природных мембран в основном представлены фосфолипидами, у которых глицерол, реже сфингозин этерифицированы одной или двумя жирнокислотными цепями, а к третьему атому углерода- присоединена фосфатная группа, с которой в свою очередь связана полярная группа фосфолипида. Жирная кислота в Р-положении часто бывает ненасыщена {Рис, Стернберг, 1988).
Фосфолипидный спектр наружного и внутреннего слоев мембраны неодинаков. Установлено, что доля фосфатидилхолина (ФХ) и сфингомиелина (СМ) в составе фосфолипидов выше в наружном слое, а фосфатидилэтаноламина (ФЭ), фосфатидилсерина (ФС) и фосфатидилинозита (ФИ) - во внутреннем {Климов, Никульчева, 1995; Ohvo-Rekila et al, 2002).
Основным структурным компонентом большинства клеточных мембран эукариотов является фосфатидилхолин. Он имеет большое значение в регуляции проницаемости мембран, влияет на метаболизм холестерина {Климов, Никульчева, 1995; Ohvo - Rekila et al., 2002). По сравнению с другими фосфолипидами ФХ значительно более устойчив к окислению {Крепе, 1981).
Обязательным компонентом клеточных мембран является сфингомиелин. Увеличение его количества способствует повышению вязкости мембран за счет высокой насыщенности его жирнокислотного состава {Ohvo - Rekila et al, 2002). Доказано участие СМ в передаче регуляторного сигнала внутрь клетки {Алесенко, 1995). Метаболиты СМ - церамид и сфингозин, играют важную роль в регуляции роста, дифференцировки, деления и апоптоза различного вида клеток, а также действуют в качестве внеклеточных сигналов активации (Алесенко, 1998; Осташкин и др., 2000). Предполагается, что первичная функциональная роль ФХ и СМ заключается в сохранении бислойной организации биологических мембран (Баллы и др., 1989; Ohvo - Rekila et al, 2002).
Другой важнейшей структурной составляющей мембран служит фосфатидилэтаноламин (ФЭ). Он участвует в иммунных реакциях, повышении резистентности организма, является эффектором ряда ферментов, имеет значение для структурно-функциональной целостности мембран (Бурлакова, 1980; Тюрин и др., 1996).
Одним из основных продуктов превращения ФЛ являются их лизоформы (ЛФХ), которые образуются в органах млекопитающих в результате действия различных фосфолипаз. В составе лизоформ ФЛ преобладают лизоформы ФХ, поскольку он является доминирующей фракцией в составе ФЛ. Кроме того фосфолипаза Аг обнаружена именно в печени и головном мозге (Климов, Никульчева, 1995). Лизоформы ФХ и их производные являются эффекторами протеинкиназы С: в низких концентрациях они активируют, а в высоких -ингибируют фермент (Berdel et al, 1985; Sekiguch et al, 1987). Избыточное количество продуктов гидролиза ФХ - свободных жирных кислот, как и лизоформ ФЛ - мощный фактор модификации свойств липидного бислоя и интегральных мембранных белков (Грибанов, 1991; Сергеева, Варфоломеева, 2006; Торховская и др., 2007). Отклонения в содержании ЛФХ могут изменить проницаемость и микровязкость липидного бислоя, в частности при адаптационных изменениях к условиям внешней среды (Грибанов, 1991; Тюрин и др., 1996).
Использование параметров физико-химической системы регуляции перекутого окисления липидов для оценку биологическую последствий воздействия ионизирующего излучения и других повреждающих факуюров
Роль липидов в лучевом поражении стала привлекать пристальное внимание радиобиологов вскоре" после открытия усиливающего действия кислорода на глубину лучевого эффекта. Способность липидов к перекисному окислению по цепному свободнорадикальному механизму, высокая биологическая активность липидных пероксидов, регуляция ПОЛ антиоксидантами и физико-химические свойства липидов послужили отправными точками для возникновения и развития ряда направлений, тесно связанных с именами проф. Б.Н. Тарусова и акад. Н.М. Эмануэля.
Результаты исследований по влиянию ионизирующих излучений на параметры системы регуляции ПОЛ в клетках и тканях лабораторных животных систематизированы в обзорах и монографиях (например: Бурлакова и др., 1975; Гончаренко и др., 1980; Фоменко, Акоев, 1984; Чеботарев и др., 1986; Коломищева, 1989; Поливода и др., 1990; Барабой и др., 1991; Burlakova et al, 1991; Шишкина, Бурлакова, 1996, 2005)
При изучении последствий действия ионизирующей радиации в экспериментах на животных обнаружены изменения состава липидов органов (Коломищева, 1989; Урнышева и др., 2002; Шишкина 2003) и клеточных органелл (Burlakova et al, 1975; Рыскулова и др., 1985; Burlakova et al, 1991), изменение конформации мембран (Бурлакова и др., 1975; Бурлакова, Шишкина, 1983; Фоменко, Акоев, 1984; Поливода и др., 1990), образование разного рода сшивок, появление новых, несвойственных данному типу мембран фосфолипидов (Burlakova et al., 1975; Richter, 1987).
Факторы, модифицирующие липидный обмен в организме, оказывают влияние на радиорезистентность, воздействуя на различные звенья метаболизма липидов в органах животных. Было установлено, что именно существование физико-химической системы регуляции ПОЛ играет важную роль в репарации мембран после радиационного воздействия (Бурлакова, Шишкина, 1983). В связи с этим при анализе последствий воздействия различных повреждающих агентов на сложные биологические организмы необходимо учитывать следующие факторы (Шишкина, Бурлакова, 1996): 1. однотипность в изменении показателей состояния и функционировании мембран при различных воздействиях на организм (Шишкина, 2003); 2. невозможность, особенно в условиях in vivo, произвольно изменять любой из параметров системы, не затронув остальные (Бурлакова и др., 1982а); 3. необходимость учета временных факторов при рассмотрении изменения параметров системы после повреждающего воздействия (Шишкина и др., 1974; Бурлакова и др., 1975; Kolomiytseva et al, 1999).
Кроме того, при анализе последствий лучевого поражения возникает необходимость учитывать изменения протекающих в организме процессов после действия повреждающих факторов, относительно их развития в норме. При анализе последствий представляется важным вопрос радиационных нарушений метаболизма липидов в печени облученных животных, так как печень является одним из главных органов биосинтеза липидов в организме. В ранние сроки после облучения крыс в диапазоне доз, вызывающих кишечную, форму гибели животных, подробные исследования состава липидов печени проведены в работах И.К. Коломийцевой с сотрудниками (Коломийцева, 1989).
Было показано, что наиболее значительным эффектом радиации на метаболизм мембранных фосфолипидов является замедление их распада, который частично протекает в ткани печени, а частично фосфолипиды выводятся из печени в составе липопротеидов. Облучение задерживает выведение СМ, ФХ и ФЭ из биоструктур печени. Причем активация синтеза фосфолипидов в ранние сроки после облучения затем сменяется некоторым торможением синтеза и отчетливым угнетением распада. Радиационные изменения синтеза и распада СМ, ФХ и ФЭ при воздействии летальных доз автор рассматривает как компенсаторные, направленные на поддержание повышенного образования фосфолипидов в гепатоцитах за счет усиленного синтеза в ранний период и угнетения их выведения в последующие сроки в составе липопротеидов.
Рост числа техногенных катастроф вызывает острую необходимость изучения биофизических механизмов совместного действия повреждающих факторов разной природы и исследования взаимосвязей в тканях и баланса функций в организме для оценки биологических последствий их воздействия. Оценка биологических последствий совместного действия ионизирующей радиации и химических агентов затруднена вследствие непредсказуемости эффектов, вызванных совместным действием разных факторов. Особую опасность представляет вероятность появления синергического эффекта различных химических и физических факторов в биологических объектах (Комаров, 1989; Петин и др., 1995; Канапацкая и др., 1998). Это вызывает необходимость поиска тестов, позволяющих объективно оценить степень воздействия и судить об изменении всей системы метаболизма после воздействия повреждающих факторов.
Перспективность использования параметров системы реіуляции ПОЛ в тканях животных для оценки состояния организма при длительном действии техногенньк агентов была экспериментально выявлена при изучении роли окислительных процессов в формировании биологических последствий для популяций мышевидных грызунов, отловленных в зоне аварии на Чернобыльской АЭС и на территориях с повышенным уровнем естественной радиоактивности (Кудяшева и др., 1997, 2004; Шишкина и др., 2006).
Последствиям воздействия химических токсикантов на процессы ПОЛ уделяется пристальное внимание. При этом, работ посвященных изучению действия малотоксичных агентов и их совместного действия с другими факторами, до сих пор недостаточно. Одни из наиболее распространенных техногенных неблагоприятных факторов - поверхностно-активные вещества (ПАВ). Их роль в формировании биологических последствий совместного действия разных агентов возрастает вследствие свойств ПАВ способствовать проникновению в клетки гидрофобных соединений. Эту особенность ПАВ обычно используют на практике для профилактического или терапевтического введения жирорастворимых препаратов в организм. Для этих целей часто используют полиоксиэтиленсорбитанмоноолеат (твин-80) {Бурлакова и др., 1975; Франкфурт 1975). Однако в ряде работ на клеточном и организменном уровнях выявлена биологическая активность как самого твина-80, так и его сочетания с различными агентами {Brubaker et al, 1982; Varma et al, 1985; Dib, Falchi, 1996).
Фадиобиологическуе эксперименты
Для выделения липидов из печени в работе использовали наиболее широко применяемый метод Блая и Дайера в модификации Кейтса (Кейтс, 1975). Для этого печень взвешивали и гомогенизировали в 6.3 мл дистиллированной воды в стеклянном гомогенизаторе Поттера. После отбора аликвот суспензии гомогената на необходимые анализы, гомогенат переносили в колбу и добавляли 25 мл смеси хлороформ - метанол (1:2 по объему). Для полноты экстракции пробы оставляли на сутки в холодильнике. На следующий день пробы отфильтровывали, промывали смесью хлороформ-метанол-вода (1:2:0.8) и к измеренному объему фильтрата добавляли хлороформ и дистиллированную воду из расчета: по 2.5 мл хлороформа и воды на каждые 9 мл фильтрата. Для расслаивания пробы помещали в холодильник, не менее чем на 10 - 12 часов. Затем отбирали хлороформный слой, содержащий липиды, и высушивали его безводным сернокислым натрием. Для последующих опытов после отфильтровывания осушителя растворитель отгоняли на водоструйном насосе до постоянной массы липидов.
Анализ содержания продуктов, реагирующих с 2-тиобарбитуровой кислотой (ТБК - активные продукты, ТБК-АП), осуществляли в плазме крови, суспензии гомогенатов печени и селезенки.
Анализ ТБК - активных продуктов проводили с добавлением в среду инкубации 10 мкл 0.01%-ного спиртового раствора ионола (Asakawa, Matsushita, 1980). Перед началом анализа печень гомогенизировали в 6.3 - 8: мл дистиллированной воды, селезенку в 2 мл дистиллированной воды. Все измерения проведены по три параллели на каждую пробу.
По 0.25 мл суспензии гомогената печени и селезенки, плазмы крови - по 0.2 - 0.25 мл вносили в 1.0 мл 20% ТХУ, к которому было добавлено по 0.01мл. 0.01% раствора ионола в спирте. После этого объем суспензии гомогената тканей или плазмы крови доводили до 1.0 мл добавлением соответствующего объема дистиллированной воды и в пробу приливали по 1.0 мл 0.7% раствора 2 - тиобарбитуровой кислоты.
Количество белка определяли с помощью микробиуретового метода {Itzhaki, Gill, 1964). Для анализа количества белка 0.1 мл плазмы крови, гомогената печени или селезенки растворяли в 1.0 мл; 3.0 мл и 1.5 мл дистиллированной воды, соответственно. В пробирки отбирали по 0.2 мл полученной суспензии печени, по 0.25 мл суспензии селезенки, по 0.3 мл плазмы крови и добавляли дистиллированной воды до 1.0 мл и по 0.5 мл 0.21% раствора CuS04 в 30% растворе NaOH. После этого измеряли поглощение раствора при длине волны 540 нм на фотоэлектрическом фотометре КФК - 3. Каждое измерение проводили в трех параллельных повторностях.
Для построения соответствующей калибровочной прямой использовали яичный альбумин. Концентрацию белка рассчитывали по формуле: Сбелка (мг/мл) = KxD54o нм где К - коэффициент, учитывающий разбавление и tg угла наклона калибровочной прямой, D54o Нм - оптическая плотность при X = 540 нм.
Состав фосфолипидов (ФЛ) определяли методом тонкослойной хроматографии, описанным в работе {Биол. мембраны. Методы., 1990). Для хроматографии фосфолипидов использовали силикагель типа G, стеклянные пластинки размером 9 X 12 см. 1.5 г силикагеля размешивали в 5 мл раствора безводного карбоната натрия (6.8 мг Ыа2С0з на 100 мл воды). Полученную суспензию выливали на пластинку и быстро разравнивали стеклянной палочкой. Пластинки высушивали на воздухе на горизонтальной поверхности. Активирование пластинок проводили нагреванием в сушильном шкафу.
Использованные концентрации липидов в хлороформе 5 и 10 мг/мл. Хлороформный раствор липидов наносили на пластинку микрошприцем в виде пятен по 100 — 200 мкг общих липидов на пятно.
В качестве системы растворителей для разгонки использовали смесь хлороформ — метанол — ледяная уксусная кислота — вода в соотношении 12.5:7.5:2:1 по объему. Хроматографическая камера предварительно насыщалась парами растворителей в течение 20-30 минут. После "прогонки" в системе растворителей пластинки высушивали на воздухе до исчезновения запаха уксусной кислоты и проявляли в парах йода, хроматограммы зарисовывали, быстро и аккуратно "обкалывали" иглой. Для определения количественного содержания отдельных фракций ФЛ, пятна снимали специальной лопаточкой, сделанной из лезвия бритвы, и переносили в маркированные пробирки по одному пятну для анализа основных фракций ФЛ (ФХ и ФЭ), а для анализа минорных фракций по 2 -3 пятна с параллельных дорожек.
Определение фосфора производили следующим образом. В каждую пробирку добавляли 0.1 мл 42%-ной НСЮ4, после чего нагревали на плитке в вытяжном шкафу до полного "сгорания" ФЛ до неорганического фосфата. После охлаждения в пробирки добавляли смесь (0.96 мл воды + 0.34 мл 65%-ной HCIO4 + 0.4 мл 1.25%-ного молибдата аммония + 0.4 мл 5%-ной аскорбиновой кислоты). Затем нагревали в кипящей водяной бане в течение 5 мин. Для определения количества образовавшегося в присутствии аскорбиновой кислоты фосфорно-молибденового комплекса после охлаждения и осаждения силикагеля измеряли оптическую плотность при длине волны 800 нм на фотоэлектрическом фотометре КФК — 3. Соответствующая калибровочная прямая была получена, используя раствор однозамещенного фосфорнокислого калия марки ос. ч.
Помимо анализа количественного соотношения отдельных фракций фосфолипидов оценивали и обобщенные показатели состава липидов: содержание фосфолипидов в составе общих липидов (%ФЛ), соотношение суммарного содержания более легкоокисляемых и более трудноокисляемых фракций (ХЛОФЛ/ЕТОФЛ) и отношения фосфатидилхолин/фосфатидил-этаноламин (ФХ/ФЭ) в фосфолипидах. Соотношение ЕЛОФЛ/ЕТОФЛ вычисляли по формуле {Кудяшева и др., 1997):
Для определения количества пероксидов в липидах печени мышей линии Balb/c использовали стандартную методику ГОСТ 26593. К взвешенному количеству липидов (0.02-0.05 г) добавляли 4 мл смеси ледяной уксусной кислоты и хлороформа (1:1 по объему) и приливали избыток (1 мл) насыщенного водного раствора йодистого калия марки ос. ч. Пробу закрывали, перемешивали и выдерживали 3 минуты. Перед титрованием в каждую колбу добавляли не менее 10 мл дистиллированной воды и выделившийся по реакции йод титровали 0.0 IN раствором тиосульфата натрия.
Анализ количества стеринов (ХС) в липидах печени проводили по методу (Sperry, Webb, 1950). Поскольку стерины в липидах печени лабораторных животных представлены преимущественно холестерином, то для построения калибровочной прямой использовали холестерин фирмы Serva (Германия). Взвешенное количество липидов растворяли в 1 мл хлороформа, после чего одновременно добавляли 50 мкл концентрированной серной кислоты и 0.5 мл уксусного ангидрида. Для образования комплекса стеринов с уксусным ангидридом пробы выдерживали в темноте в течение 30 мин. Оптическую плотность раствора определяли на фотоэлектрическом фотометре КФК-3 при длине волны 625 нм.
Сезонная вариабельность показателей физико-химический системы регуляции угол
Выше нами было показано, что большинство среднегрупповых значений показателей системы регуляции ПОЛ, а также характер и масштаб некоторых взаимосвязей между данными показателями существенно зависят от величины АОА и степени окисленности липидов. Однако, как уже говорилось в п.1.1, обеспеченность липидов тканей антиоксидантами, о которой можно судить по величине АОА липидов, подвержена выраженным сезонным, индивидуальным и возрастным колебаниям как у лабораторных животных, так и у мышевидных грызунов, обитающих в природной среде (Шишкина и др., 1974; Бурлакоеа и др., 1976, 19826, 1985). Показано, в частности, что величина АОА липидов печени мышей линии Balb/c в мае и ноябре достоверно выше, чем в феврале (Шишкина и др., 1974). Поскольку в работе (Shishkina et al. 2001) была обнаружена обратная линейная корреляция между величиной АОА липидов и количеством ТБК - активных продуктов в гомогенате печени мышей SHK, то можно было предположить, что количество продуктов окисления в гомогенате печени мышей линии Balb/c также будет варьировать при проведении экспериментов в разные сезоны.
В работе был проведен анализ сезонных колебаний основных биохимических показателей в печени мышей линии Balb/c (список экспериментов представлен в таблице 3.1). Результаты анализа состава липидов печени мышей, забитых в разные сезоны и годы исследований, представлены в таб. 3.3, а содержания пероксидов в липидах и ТБК - активных продуктов в гомогенате печени на рис. 3.5.
Из представленных данных следует что, наиболее лабильными являются параметры интенсивности процессов ПОЛ, а именно: содержание ТБК-активных продуктов в гомогенате печени и количество пероксидов в липидах (рис. 3.5).
Так, количество пероксидов в липидах печени мышей летом (0.114 ± 0.038) в 22.8 раза больше аналогичного показателя липидов печени мышей, забитых в ноябре 2003г (0.005 ± 0.001 ммоль/г липидов). Это согласуется и с данными, представленными в работе (Бурлакова и др., 1982е), в которой было обнаружено, что АОА липидов печени крыс у разных индивидуумов может различаться на порядок. Необходимо отметить, что для экспериментов, проведенных в поздний осенний период, значения параметров интенсивности процессов ПОЛ существенно различаются и в зависимости от года исследования (рис. 3.5).
Состав липидов печени мышей линии Balb/c существенно зависит от степени окисленности липидов (п. 3.1). Поэтому необходимо отметить, что в экспериментах, проведенных в феврале - марте и летом, липиды печени всех особей в группах содержали пероксиды, а в экспериментах, проведенных в ноябре в разные годы исследования, липиды печени одних особей содержали пероксиды, а других обладали антипероксидной активностью. В связи с этим для сравнительного анализа в таблице 3.3 представлен состав липидов печени тех особей, липиды которых содержали пероксиды.
Из данных таблицы 3.3 видно, что сезонным колебаниям подвержено и соотношение фракций ФЛ, причем наиболее выраженные изменения были обнаружены для относительного содержания лизоформ: в зимний период доля лизоформ в составе ФЛ более чем в три раза (Р 0,001) меньше, чем в осенний период. Более стабильными показателями в течение года являются относительное содержание основных фракций ФЛ (ФХ и ФЭ) и обобщенные показатели состава ФЛ. Таким образом, все исследованные нами параметры физико-химической системы регуляции ПОЛ печени мышей линии Balb/c (интенсивность ПОЛ, степень окисленности липидов, состав ФЛ) в той или иной мере подвержены сезонным колебаниям.
Интересно отметить, что такое изменение интенсивности процессов ПОЛ в среднем по группе в зависимости от сезона существенно влияет и на морфофизиологические показатели у индивидуумов внутри группы.
Как известно, у более крупных животных и большая масса печени. Закономерное изменение массы органов при различных экспериментальных условиях дало возможность использовать эти показатели в качестве критерия активности органа для различных видов животных {Хмельницкий, Быков, 1986). При анализе взаимосвязи между массами печени и тела мыши линии Balb/c в группах возрастного контроля также обнаружена прямая линейная корреляция (рис. 3.6). Однако анализ зависимостей между массой печени и массой мыши для опытов, проведенных в разные сезоны свидетельствует о том, что коэффициент линейной регрессии корреляции между массами печени и тела мыши существенно зависит от интенсивности ПОЛ в гомогенате печени. При проведении экспериментов в летний период коэффициент линейной регрессии данной корреляции (рис. 3.6, прямая 1) равен 0.056 + 0.011 при среднегрупповом значении содержания ТБК - активных продуктов в гомогенате печени 0.057 ± 0.0075 нмоль/мг белка. В осенний период (рис. 3.6, прямая 2) содержание продуктов окисления в печени составляет 0.114 ± 0.01 нмоль/мг белка, при этом коэффициент линейной регрессии между массой тела и массой печени мыши также увеличивается и равен 0.119 ± 0.015.
Как уже отмечалось, для экспериментов, проведенных в один и тот же сезон, но в разные годы значения параметров интенсивности процессов ПОЛ существенно различаются (рис. 3.6). Этот факт позволяет сделать вывод, что основной вклад в сезонные изменения значений параметров системы регуляции ПОЛ в тканях мышей линии Balb/c вносят условия окружающей среды. В связи с этим можно предположить, что на параметры системы регуляции ПОЛ будет также оказывать влияние и изменение условий окружающей среды, вызванное антропогенными факторами. Наиболее распространенными из таких антропогенных факторов являются промышленное и бытовое загрязнение.
Поэтому, для проверки данного предположения, следующим этапом работы явилось изучение последствий воздействия малотоксичных химических агентов в малых дозах на параметры системы регуляции ПОЛ.
