Содержание к диссертации
Введение
2. Обзор литературы 14
2.1. Общие сведения о сфингомиелиновом цикле
2.1.1. Метаболизм сфингомиелина 14
2.1.2. Изоформы сфингомиелиназ 18
2.1.3. Механизмы регуляции сфингомиелиназ в клетке 21
2.1.3.1. Регуляция липидами 22
2.1.3.2. Регуляция протеинкиназой С 23
2.1.3.3. Регуляция протеазами 24
2.1.3.4. Регуляция Вс12 25
2.1.3.5. Регуляция р53 25
2.1.3.6. Регуляция другими белками 26
2.1.3.7. Регуляция глутатионом 26
2.2. Сфипгомиелиновый цикл как сигнальная система 27
2.2.1. Участие сфингомиелиназы в передаче внеклеточных сигналов 28
2.2.2. Участие церамида в передаче внеклеточных сигналов 30
2.2.3. Участие сфиигозина в передаче внеклеточных сигналов 33
2.2.4. Участие сфингозин-1-фосфата в передаче внеклеточных сигналов 35
2.3. Сигнальные системы окислительного стресса 38
2.3.1. Пути генерации активных форм кислорода в .„ клетках
2.3.2. Оксидаиты регулируют клеточные сигнальные системы
2.3.2.1. Протеинтирозинкиназы и фосфатазы... 40
2.3.2.2. Серин/треонинкиназы и фосфатазы 41
2.3.2.3. Липидный метаболизм 43
2.3.2.4. Транскрипционные факторы
2.3.2.4.1. АР-1 45
2.3.2.4.2. NFkB 45
2.3.2.4.3. Myb 46
2.4. Взаимосвязь сигнальных систем сфингомиелинового цик ла и окислительного стресса
2.4.1. Общие активаторы и ингибиторы 46
2.4.2. АФК активируют образование церамида 47
2.4.3. Митохондриальная электронная транспортная
цепь - мишень церамида 48
2.4.4. Церамид и N0 при проведении сигнала апоптоза 50
2.4.5. Роль антиоксидантов в регуляции образования церамида 51
2.4.6. Церамид, другие сфинголипиды и окислительный стресс 53
3. Объекты, материалы и методы исследования
3.1. Биофизические и биохимические методы 55
3.2. Работа с животными 58
3.3. Статистическая обработка результатов 59
4. Результаты исследования
4.1. Изучение взаимосвязи между активностью нейтральной сфингомиелиназы и интенсивностью процесса пероксидного окисления липидов в печени мышей при действии глутатиона в восстановленной и окисленной формах 60
4.1.1. Изменение активности нейтральной сфингомие линазы и содержания сфингомиелина в печени мышей при внутрибрюшинном введении восстановленного и окисленного глутатиона 62
4.1.2 Влияние восстановленного и окисленного глута тиона на содержание продуктов пероксидного окисления липидов в печени мышей 66
4.2. Изучение взаимосвязи между активностью нейтральной сфингомиелиназы и интенсивностью процесса пероксидного окисления липидов в печени и сердце мышей при действии билирубина 71
4.2.1. Изменение активности нейтральной сфингомиелиназы в печени и сердце мышей при внутрибрюшинном введении билирубина 71
4.2.2. Влияние билирубина на содержание продуктов пероксидного окисления липидов в печени и сердце мышей 73
4.3. Влияние церамида на интенсивность пероксидного окисления липидов в печени мышей 77
4.4. Изучение взаимосвязи между активностью нейтральной сфингомиелиназы и интенсивностью процесса пероксидного окисления липидов в печени мышей при действии гепатоток-сина а-нафтилизотиоцианата 80
4.4.1. Изменение активности нейтральной сфингомиелиназы в печени мышей при внутрибрюшинном введении а-нафтилизотиоцианата 81
4.4.2. Влияние а-нафтилизотиоцианата на содержание продуктов пероксидного окисления липидов в печени мышей 82
4.5. Изучение взаимосвязи между активностью нейтральной сфингомиелиназы, уровнем ФНО-а и интенсивностью процес са пероксидного окисления липидов в печени крыс при перевязке общего желчного протока с последующим восстановле нием оттока желчи 84
4.5.1. Изменение активности нейтральной сфингомиелиназы в печени крыс при перевязке общего желчного протока 86
4.5.2. Изменение содержания ФНО-а в печени крыс при перевязке общего желчного протока 89
4.5.3. Влияние перевязки общего желчного протока на интенсивность пероксидного окисления липидов в печени крыс 92
4.5.4. Изменение активности нейтральной сфингомиелиназы в печени крыс при восстановлении оттока желчи после перевязки общего желчного протока 97
4.5.5. Изменение содержания ФНО-а в печени крыс при восстановлении оттока желчи после перевязки общего желчного протока 100
4.5.6. Влияние восстановления оттока желчи после перевязки общего желчного протока на интенсивность пероксидного окисления липидов в печени крыс 102
5. Обсуждение результатов исследования 1 ю
6. Выводы U8
7. Список аббревиатур
- Механизмы регуляции сфингомиелиназ в клетке
- Участие церамида в передаче внеклеточных сигналов
- Работа с животными
- Изменение активности нейтральной сфингомие линазы и содержания сфингомиелина в печени мышей при внутрибрюшинном введении восстановленного и окисленного глутатиона
Введение к работе
Сфингомиелиназа (ЕС 3.1.4.12. сфингомие-лингидролаза) является ключевым ферментом сфингомиелинового (СФМ) цикла - источника липидных вторичных мессенджеров, участвующих в проведении сигналов от различных внешних агентов внутрь клетки. Она гидролизует фосфоэфириую связь сфингомиелина с образованием церамида (ЦБР) и фосфохолина. Из церамида затем последовательно образуются сфингозин и сфингозин-1 -фосфат.
Активация сфингомиелиназы может являться начальной точкой ферментного каскада, который приводит к образованию целого ряда биоактивных липидов и представляет собой один из ключевых моментов в передаче сигнала от множества факторов, реализующих свое действие через рецепторы, расположенные на плазматической мембране. Существующая в настоящее время гипотеза о сфингомиелиновом цикле как пути передачи сигнала с помощью липидных вторичных мессенджеров заключается в том, что внеклеточные агенты, связываясь со своими рецепторами на поверхности мембран, активируют сфингомиелиназу, которая катализирует гидролиз сфингомиелина и накопление церамида и сфипгозина (СФЗ). Последние, воздействуя на внутриклеточные мишени, вызывают клеточный ответ. Сфингомиелиновый цикл завершается ресинтезом сфингомиелина и восстановлением прежнего уровня ЦБР и СФЗ.
Сфингомиелиназа (СФМаза) обнаружена практически во всех клетках, но наибольшее ее количество содержится в клетках мозга (миелине). На данный момент известно по меньшей мере 5 различных изоформ сфингомиелиназ, отличающихся внутриклеточной локализацией, оптимальным рН, зависимостью от катионов и ролью в клеточной регуляции: лизосомальная кислая, нейтральная Mg -зависимая, Zn 2+-зависимая ли-зосомальная кислая, Mg2+ -независимая нейтральная и щелочная СФМазы. Большинство литературных сведений показывают, что наиболее значимыми в процессах передачи внеклеточных сигналов являются две изо-формы фермента - Ъ 2+-зависимая нейтральная мембраносвязанная СФМаза и кислая лизосомальная сфингомиелиназа.
Механизм, контролирующий активацию сфингомиелиназ в клетке, на настоящий момент до конца не изучен. На основании литературных данных наиболее вероятной, на наш взгляд, представляется гипотеза о регуляции активности СФМазы окислительно-восстановительным состоянием клетки.
В последние годы появляется все больше фактов, свидетельствующих о пересечении двух сигнальных систем — сфингомиелииового цикла и окислительных процессов, происходящих в клетке при развитии окислительного стресса. Обе эти системы являются генераторами вторичных посредников, передающих внеклеточные сигналы с цитоплазматической мембраны в ядро, модулирующих физиологическое состояние клеток и влияющих на пролиферацию, дифференцировку и апоптоз. Ряд факторов, способных индуцировать окислительный стресс, в то же время активируют СФМ цикл. Такие воспалительные цитокины как ФНО-а способствуют генерации активных форм кислорода в клетках [Li J. et al., 2001] и также являются индукторами образования продуктов СФМ-цикла [Liu B.et al., 1998b]. Многие антиоксиданты (АО) ингибируют производство активных форм кислорода (АФК) в клетках, и некоторые из них проявляют инакти-вирующее действие в отношении сфингомиелиназы.
Высокие концентрации АФК и продуктов пероксидного окисления липидов (ПОЛ) в клетке обладают выраженным повреждающим действием и вызывают не только нарушение структуры биологических мембран, но и изменение активности мембраносвязанных ферментов. В связи с этим через регуляцию пероксидного окисления липидов представляется вероятным оказывать влияние на активность сфингомиелиназы и интенсивность сфингомиелинового цикла, а значит, воздействовать на важнейшие клеточные процессы в организме - дифференцировку, пролиферацию и апоптоз. В настоящее время в этом аспекте активно исследуется роль природных и синтетических соединений, обладающих антиокислительными свойствами.
Участие таких природных антиоксидантов как глутатион (ГЛ) и билирубин (БР) в процессах пероксидного окисления липидов в настоящее время уже является вполне определенным, а вот сведения о том, что глутатион способен оказывать влияние на активность ключевого фермента сфингомиелинового цикла - сфингомиелиназы были получены ш vitro сравнительно недавно [Liu В., Hannun Y.A., 1997; Lui В. et al, 1998; Lui В. et al, 1998b]. Ho in vivo связи между содержанием глутатиона и активностью сфингомиелинового цикла в клетке могут быть значительно более сложными. Влияние природного антиоксиданта билирубина на активность сфингомиелиназы вообще не исследовалось, а между тем, имеются данные, что он способен при взаимодействии с клеточной поверхностью избирательно связываться со сфинголипидами мембран [Nagaoka, Cowger, 1978; Vazquez et al., 1988; Yang et al., 1991], причем константа его связывания со сфингомиелином, субстратом сфингомиелиназы, в 5-25 раз выше, чем с другими фосфолипидами [Eriksen et ah, 1981]. Вполне вероятно, что такое взаимодействие может оказывать влияние на активность данного фермента. Кроме того, данные о влиянии на активность сфингомиелиназы иных (помимо глутатиона) антиоксидантов, полученные in vitro, весьма противоречивы [Mansat-de Mas V., et al., 1999; Lopez-Lluch G. et al., 1999; Yoshimura S. et al., 1999], а сведения об экспериментах in vivo отсутствуют. Связь активности сфингомиелиназы с уровнем реакций пероксидного окисления липидов (ПОЛ) мембран in vivo в литературе нами также не обнаружена.
Исследование активности СФМазы в условиях изменения интенсивности ПОЛ в организме животных при действии антиоксидантов глу-татиона и билирубина, представляется нам весьма актуальным, поскольку позволяет определить влияние природных АО и продуктов пероксидного окисления липидов на активность сфингомиелиназы и характер изменения активности данного фермента в условиях ингибирования ПОЛ.
В то же время уровень пероксидного окисления липидов возможно также регулировать воздействием на организм животного различными токсическими агентами и моделированием заболеваний, связанных с интенсификацией ПОЛ. В качестве моделей, при которых происходит активация процессов ПОЛ, мы использовали модель токсического поражения печени гепатотоксином а-нафтилизотиоцианатом и модель нарушения желчетока, создаваемую путем перевязки общего желчного протока с последующим восстановлением оттока желчи у животных.
Гибель клеток печени при действии а-нафтилизотиоцианата и при нарушении желчетока преимущественно происходит по механизму апоп-тоза, индуцированному продуктами пероксидного окисления липидов. Однако изменение активности СФМазы под влиянием данных факторов до настоящего времени не изучалось.
Также в нашей работе было исследовано влияние природного церамида - продукта гидролиза сфингомиелина - на интенсивность процесса ПОЛ in vivo. В литературе имеются сведения об экспериментах, выполненных на клеточных культурах с использованием синтетического аналога церамида с укороченной жирнокислотнои цепью, который может быть для клетки гораздо более токсичным, чем природный аналог.
Таким образом, данное исследование дает представление об изменении активности ключевого фермента сфингомиелинового цикла — СФМазы в результате ингибирования пероксидного окисления липидов природными антиоксидантами и интенсификации данных процессов вследствие токсического поражения печени и нарушения желчетока, и может указывать на пересечение сигнальных систем СФМ цикла и окислительно-восстановительной системы при развитии различных патологий. Результаты работы могут быть полезными для понимания патогенеза и разработки новых методов терапии ряда распространенных заболеваний, а также способствовать созданию новых лекарственных средств из класса антиоксидантов.
Механизмы регуляции сфингомиелиназ в клетке
Сигналы, активирующие различные сфингомиелиназы, распространяются от факторов роста и цитокинов до нейромедиаторов, гормонов и активных форм кислорода [Hannun Y.A. et aL, 1996; Marchesini N., Hannun Y.A., 2004; Mathias S. et al., 1998].
Нейтральная СФМаза связана с плазматическими мембранами и активируется в ответ на действие ряда стимулов, включая ФНО-а, Fas-лиганды, IL-1, ингибиторы протеинкиназы С и удаление сыворотки [Marchesini N. and Hannun Y.A. 2004]. Предполагается, что в индуцированной с помощью ФНО-а активации нейтральной СФМазы важную роль играет цитозольная фосфолипаза А2, поскольку в клетках , имеющих недостаток данного фермента, не наблюдается гидролиз сфингомиелина в ответ на действие ФНО-а, но этот эффект проявляется при экспрессии ци-тозольной фосфолипазы А2 [Jayadev S. ct al, 1997].
Кислая СФМаза активируется в ответ на ФНО-а, Fas-лиганд и ионизирующее облучение, а также после воздействия aiiTH-CD28, который способствует созреванию Т-клеток и пролиферации [Mathias S. et al, 1998]. В связи с отсутствием кислой СФМазы лимфобласты пациентов с болезнью Нимана-Пика и эндотелиальные клетки легких у нокаутных мышей являются устойчивыми к апоптозу, индуцированному ионизирующей радиацией. Хотя другие типы клеток, например тимоциты, оставались восприимчивыми к данному типу воздействия [Otterbach В., Stoffel W. 1995; Horinouchi К et al. 1995].
Сведения о роли кислой СФМазы в Fas-индуцированном апоптозе на данный момент остаются противоречивыми. В одних экспериментах показано, что лимфобласты пациентов с болезнью Нимана-Пика не проявляли устойчивости к апоптозу, индуцированному Fas [Boesen-de-Cock J.G.R, et al, 1998], в других продемонстрировано, что кислая СФМаза участвует в защите клеток от Fas-индуцированной программируемой гибели клеток [Brenner В. et al, 1998].
Механизм, контролирующий активацию сфингомиелиназ в клетке, до конца не изучен. Ниже представлено несколько факторов, играющих роль в регуляции фермента, помимо катионов, о которых речь шла выше.
Первый липид, описанный как возможный регулятор лиганд-индуцированной генерации церамида, был диацилглицерин (ДАГ). При индукции сфингомиелинового цикла ФНО-а этот липидный мессенджер контролирует процесс благодаря гидролизу фосфатидилхолина специфической фосфолипазой С [Schutze S. et al., 1992], являясь продуктом этой реакции. После активации клетки ФНО-а, IL-1, Fas-рецепторами или введения гоноккоков, ДАГ активирует кислую сфингомиелиназу через независимый от протеинкиназы С механизм. Этот факт был установлен при использовании D-609 ксантогената, который специфически ингибирует действие фосфолипазы С [Kolesnick R.N., 1987; Schutze S. et al., 1992].
В ряде других исследований был описан гидролиз сфингомиелина и фосфатидилхолина с образованием церамида и диацилглицерина в клетках, где была активирована нейтральная сфингомиелиназа [Levade Т., Jaffrezou J. P. 1999]. С другой стороны, экзогенный короткоцепочечный ДАГ или диацилглицерин, образованный в результате обработки клеток бактериальной фосфолипазой С, ингибировал апоптотическую активность церамида [Jarvis W.D. et al., 1994].
Из фосфолипидов наибольшим активирующим действием на мем-браносвязанную нейтральную СФМазу обладает фосфатидилсерии, несколько меньшим - фосфатидная кислота и фосфатид ил инозит. Фосфати-дилэтаноламин оказывает слабое активирующее действие, а фосфатидил-холин вообще не влияет на активность нейтральной СФМазы.
Арахидоновая кислота (АК) также регулирует распад сфингомиелина. После активации ФНО-а именно АК способствует гидролизу сфингомиелина в HL-60 клетках [Jayadev S. et aL, 1994]. Экзогенная АК также может активировать сфингомиелиновый цикл в интактных клетках и стимулировать активацию нейтральной, но не кислой формы сфингомиелина-зы в клеточных экстрактах. Мелитин, активатор фосфолипазы А2, в результате активации которого генерируется АК, имитирует ее эффект на сфингомиелиновом уровне. Другие жирные кислоты также активируют нейтральную, но не кислую сфингомиелиназу и вызывают увеличение уровня церамида в нейтрофилах [Levade Т., Jaffrezou J. P., 1999]. В последней работе, кроме того, показана, взаимосвязь между АК и производным КоА, также приводящая к активации нейтральной сфингомиелиназы.
Участие церамида в передаче внеклеточных сигналов
Церамид образуется путем гидролиза сфингомиелина под действием сфингомиелиназы. Изменения в концентрации ЦЕР важны для осуществления регуляции множества клеточных процессов.
Во многих выполняемых экспериментах, описанных в литературе, использовалось добавление в среду культивирования экзогенных церами-дов с укороченной жирнокислотной цепью. В ряде работ показано, что С2-и С6-церамиды ингибируют пролиферацию клеток [Jung Е.М. et al., 1998], вызывают остановку клеточного цикла [Lopez-Marure R. et al., 2000], способствуют дифференцировке [Pillal S. et al., 1999], индуцируют апоптоз [Harficld P.J. et al., 1997].
В человеческих диплоидных фибробластах церамиды воспроизводили большинство признаков клеточного старения, включая необратимую задержку клеточного цикла в Go-Gi-фазе, активацию Rb, ингибирование митогенетических ответов, инактивацию развития сигнальных каскадов, связанных с фосфолипазой D и протеинкиназой С._Показано, что во время входа клеток в фазу старения уровни церамида повышаются в 3-4 раза, указывая на роль церамида в регуляции этого процесса [Obeid L.M. et al., 1997].
Церамид регулирует многие клеточные процессы благодаря своей способности активировать протеинкиназы и фосфатазы [Dobrowsky et al., 1993; Liu J. et al., 1994; Mathias S. et al.,1998]. Взаимодействие церамида с протеинкиназой С может ингибировать транслокацию киназы к плазматической мембране и ингибировать её каталитическую активность [Jones M.J. et al., 1995]. Обработка церамидом вызывает повышение активности C-Jun-N-концевой протеин киназы (стрес с-активируемой протеи нкиназы), серин-треонин - фосфатазы [Dobrowsky R.T. et al., 1993], повышает ДНК-связывающую активность АР-1 [Sawai Н. et al., 1995; Rebecchi M.S. et al., 2000; Mansat-de Mas V. et al., 1999]. Церамид также активирует транскрипционный фактор NFkB [Schutze S. et al., 1992; Mattson M.P. et al., 1997].
Имеются достаточно противоречивые сведения о влиянии ЦЕР на активность киназ из семейства МАР-киназ: есть сведения об активации ERK1, ERK2 [Raines М.А. et al., 1993] и об ингибировании их церамидом [Westwick J.K, etal., 1995].
Выявлена двойственная функция церамида в регуляции клеточного цикла и апоптоза. ЦЕР активирует каспазы, которые опосредуют его действие в апоптозе, и белок ретинобластомы (Rb), опосредующий его эффекты в ходе клеточного цикла. Эксперименты показали, что в тех клетках, где наблюдается сверхэкспрессия Вс1-2 или активирована ПК С [Hannun Y.A., 1996] церамид не способен длительное время активировать каспазы и индуцировать апоптоз, но он сохраняет способность активировать Rb и вызывать задержку клеточного цикла. Напротив, в клетках с отсутствующим или неактивным белком ретинобластомы церамид недолго может индуцировать задержку клеточного цикла в G0-Gi фазе, но он остается способным индуцировать апоптоз [Hannun Y.A., 1996]. Таким образом, регуляция апоптоза или задержки клеточного цикла церамидом осуществляется независимым образом.
Ключевой мишенью церамидной регуляции при подавлении роста клеток является ЦЕР-активируемая протеинфосфатаза (САРР). Церамид активирует серии-треониновые протеи нфосфатазы РР1 и РР2А семейств (in vitro). Индуцированные церамидом дефосфорилирование и инактивация ПКС-а и Вс1-2 блокируются ингибиторами РР2А [Ruvolo P.P. et al., 1999]. Кроме того, РР2А опосредует эффекты церамида на с-Мус, c-Jun, стерол-зависимый белок OSBP и кардиолипинсинтазу. Как уже упоминалось, ЦБР также вызывает дефосфорилирование Rb. Этот белок избирательно ингибируется ингибиторами РР1, которые, таким образом, ограничивают действие ЦБР на регуляцию клеточного цикла. Эксперименты показали, что, по-видимому, РР2А является медиатором действия церамида на задержку клеточного цикла [Nickels J.T., Broach J.R., 1996].
Другой предполагаемой мишенью церамида считают ЦЕР-активируемую протеинкиназу (САРК), которая является киназным су-прессором белка Ras [Zhang Y.H. et al., 1997].
Во многих типах клеток церамиды вызывают дифференцировку и в большинстве опухолевых клеток индуцируют апоптоз [Hannun Y.A., 1996; Jung Е.М., 1998]. В биохимческих концентрациях короткоцепочечные церамиды воспроизводят многие, но не все эффекты ФНО-а и других цито-кинов, которые связаны с апоптозом и задержкой клеточного цикла: активацию каспаз, ДНК-фрагментацию, выход цитохрома С, дефосфорилирование и активацию белка ретинобластомы и инактивацию протеинкина-зыС-apbaiboG.S. etal., 1998; Hannun Y.A., 1996].
Работа с животными
В работе использовали мышей линии Balb/c, а также крыс линии Wistar, содержавшихся в виварии при естественном освещении и свободном доступе к воде и пище.
Эксперименты по определению влияния глутатиона, билирубина и а-нафтилизотиоцианата на активность сфингомиелинового цикла и интенсивность ПОЛ в органах животных проводили на мышах линии Batb/c.
Глутатиоп в окисленной и восстановленной формах («Sigma», США) вводили животным внутрибрюшинно в дозе 18 мг/мышь (720 мг/кг), контрольным животным вводили Tris-HCl буфер. Исследования проводили на печени мышей.
Билирубин («Fluka», Швейцария) вводили животным внутрибрю-шинно в дозе 1,25 мг/мышь (50 мг/кг), контрольным животным вводили Tris-HCl буфер. Исследования проводили на печени и сердце мышей.
Церамид («Sigma», США) растворяли в 5% растворе этанола и вводили животным внутрибрюшинно в дозах 50 мкг/мышь (2 мг/кг веса) и 100 мкг/мышь (4 мг/кг веса), контрольным животным вводили 5% раствор этанола. Исследования проводили на печени мышей. а-Нафтилизотиоцианат («Sigma», США), растворенный в 1% водном растворе неионного детергента твин-80, вводили животным внутрибрюшинно в дозе 3 мг/мышь (120 мг/кг), в качестве контроля использовали 1% водный раствор твин-80. Исследования проводили на печени мышей.
Нарушение желчетока вызывали у крыс линии Wistar с помощью перевязки участка общего желчного протока с предварительным введением в него полиэтиленового катетера с запаяным концом. Продолжительность перевязки составляла 3-18 суток. Последующее восстановление оттока желчи осуществляли дренированием (декомпрессией) желчевыводя-щих путей путём отсечения кончика катетера. Исследования проводили на печени крыс, в качестве контроля использовали печень интактных и ложнооперированных животных.
Статистическую обработку результатов проводили методами вариационной статистики с использованием t-критерия Стыодента [Плохин-ский Н.А., 1978] и с помощью компьютерных программ Microsoft Excel и Origin Pro. Достоверными считали различия при Р 0,05. На рисунках и в таблицах приведены среднеарифметические значения показателей, в качестве разброса экспериментальных данных указаны среднеарифметические ошибки.
В связи с важностью сфингомиелинового цикла в жизни клетки чрезвычайно возрос интерес к исследованию регуляции активности ключевых ферментов этой сигнальной системы. Несмотря на длительную историю изучения свойств сфингомиелиназ, влияния различных факторов на их активность, лишь в последние годы установлено, что активность некоторых изоформ сфингомиелиназы находится под влиянием окислительно-восстановительной системы клетки [Garcia-Ruiz С. et al, 2000b; Denisova N. et al, 1999; Lui B. et al, 1998b; Marchesini N. and Hannun Y.A., 2004]. В немногочисленных исследованиях, выполненных на клеточном уровне или изолированных ферментах, было показано, что активность нейтральной сфингомиелиназы зависит от содержания природного антиоксиданти глутатиона, который присутствует в клетке в восстановленной (ВГ) и окисленной (ОГ) формах [Liu В., Hannun Y.A., 1997; Lui В. et al, 1998; Lui В. et al, 1998b].
Клеточный уровень глутатиона, физиологическая концентрация которого составляет 1-20 мМ, настолько важен для функционирования организма, что соотношение концентраций его восстановленной и окисленной форм рассматривается как регулятор развития клетки [Sies Н., 1999]. Содержание восстановленного глутатиона в различных типах клеток превышает содержание окисленного глутатиона в 100-500 раз. Изменение состояния системы ВГ-ОГ в клетках может быть обратимым или необратимым. Обратимые изменения в соотношении компонентов системы глутатион-глутатиондисульфид, как правило, обусловлены реакцией с ВГ-пероксидазой (ферментативное окисление восстановленного глутатиона), с диазенами (неферментативное окисление ВГ), с различными дисульфидами. При некоторых условиях эти изменения связаны с нарушениями в реакциях образования восстановленного глутатиона из его окисленной формы с помощью ОГ-редуктазы. Необратимые изменения в соотношении компонентов системы ВГ-ОГ в клетках могут быть вызваны подавлением синтеза глутатиона [Sies Н., 1999].
Восстановленная форма глутатиона проявляет антиоксидантиые свойства, взаимодействуя со свободными радикалами, а также подвергается действию ВГ S-трансферазы и служит субстратом для ВГ-пероксидазы [Sies Н., 1999]. Воздействие на клетки соединений, подавляющих синтез ГЛ, приводит к активации пероксидного окисления липи-дов. Поддержание состояния системы глутатион-глутатионд и сульфид на определенном уровне необходимо для нормального функционирования клетки и организма в целом.
В настоящий момент установлено влияние сфингомиелиназ на уровень глутатиона в клетке. Добавление к культивируемым гепатоцитам экзогенной нейтральной сфингомиелиназы из Bacillus cereas увеличивает содержание восстановленного глутатиона в клетке, в то время как кислая сфингомиелиназа из плаценты человека, гидролизующая сфингомиелин в той же степени, что и нейтральная сфингомиелиназа, уменьшает депо ВГ [Garcia-Ruiz С. et al, 2000b]. Интересно отметить, что, несмотря на различный эффект, оказываемый этими изоформами на содержание ВГ, обе сфингомиелиназы увеличивали уровень мРНК тяжелой цепи у-глутамилцистеинсинтазы. Кроме того, установлено, что кислая сфингомиелиназа вызывает деполяризацию митохондрий и активацию каспазы-3, что может приводить к окислительному стрессу и развитию апоптоза [Garcia-Ruiz С. et al, 2000b].
Изменение активности нейтральной сфингомие линазы и содержания сфингомиелина в печени мышей при внутрибрюшинном введении восстановленного и окисленного глутатиона
Продукт гидролиза сфингомиелина сфингомиелиназой — церамид способен индуцировать гибель клеток по апоптотическому типу, вызывая межнуклеосомную деградацию ДНК и характерные морфологические изменения в структуре клетки. Изучение свойств церамида показало, что он способен активировать отдельные ферменты или быть участником каскадных ферментативных реакций, характерных для апоптоза. Кроме того, в ряде работ продемонстрировано, что ЦБР способен активировать образование активных форм кислорода. Однако в большинстве экспериментов, выполненных на клеточных культурах, использовался синтетический аналог церамида, имеющий укороченную жирнокислотную цепь (С-2- или С-6- церамид), который может быть для клетки значительно более токсичным, чем природный аналог.
В наших экспериментах использовался природный церамид, который вводился мышам внутрибрюшинно. Эксперименты по изучению влияния ЦЕР на интенсивность пероксидного окисления липидов в органах животных проводились совместно с М.А. Шупик. На рис.15 представлены изменения содержания диеновых конъюгатов (А) и диенкетонов (Б) в печени мышей в относительных единицах по сравнению с соответствующим контролем при внутрибрюшинном введении церамида в дозе 50 мкг/мышь (кривая 1) и в дозе 100 мкг/мышь (кривая 2). Абсолютные значения показателей приведены в таблице 5.
При введении ЦБР в дозе 50 мкг/мышь (2 мг/кг веса) уровень диеновых конъюгатов и диенкетонов в печени животных через 8 часов после инъекции находился в пределах контрольных значений, а через 18 часов содержание продуктов ПОЛ превышало показатели интактного контроля в 1,3 и 1,4 раза для диеновых коньюгатов (рис. 15 А, кривая 1) и диенкетонов (рис. 15Б, кривая 1) соответственно.
Церамид в дозе 100 мкг/мышь (4 мг/кг веса) вызывал повышение содержания продуктов ПОЛ в печени животных, которое через 8 часов после введения препарата превышало показатели интактного контроля в 1,3 раза и продолжало возрастать, достигая через 18 часов значений, превышающих контрольные в 1,6 и 1,4 раза для диеновых конъюгатов(рис. 15А, кривая 2) и диенкетонов (рис. 15Б, кривая 2) соответственно.
Таким образом, в нашей работе продемонстрировано, что церамид способен самостоятельно индуцировать пероксидное окисление липидов. а-Нафтилизотиоцианат в экспериментальных условиях широко используется для моделирования токсического поражения печени у подопытных животных. Однократное применение АНИТ вызывает холангио-литический гепатит [Plaa G.L., Priestly B.G., 1977; Zimmerman H.J., 1978; KossorD.C, 3993].
Механизм АНИТ - индуцированного повреждения печени был предложен, но окончательно не установлен. Предполагается, что АНИТ способен активировать нейтрофилы, и токсическое действие АНИТ проявляется только в присутствии нейтрофилов [Roth R.A., Hewett J.А. 1990; Damn L.J.et al„ 1991; Hill D.A., Roth R.A., 1998].
Рядом исследователей показаны выраженные повышение уровня продуктов пероксидного окисления липидов и снижение активности антиоксидантних ферментов в печени и сыворотке крови животных при действии АНИТ. Авторы многих работ ведущую роль в патогенезе заболеваний печени, экспериментальным аналогом которых является воздействие а-нафтилизотиоцианата, отводят именно интенсификации процессов ПОЛ [Kongo М. et al., 1999; Ohta Y. et a!., 2003]. В связи с этим в настоящей работе нами была использована данная модель поражения печени с целью исследования изменения активности сфингомиелиназы в условиях интенсификации пероксидного окисления липидов, вызываемой действием АНИТ.
В данной работе было изучено изменение активности сфингомиелиназы в гомогенате печени мышей введении АНИТ в дозе 3 мг/мышь (120 мг/ кг). В результате эксперимента было установлено, что активность сфингомиелиназы возрастала, превышая контрольные значения в 3 раза на 3 день эксперимента и в 4 раза на 5 день после инъекции (табл. 6, рис. 16).
Поскольку нейтральная сфингомиелиназа является ферментом, регулируемым окислительно-восстановительными процессами в клетке, на наш взгляд, наиболее вероятно, что активирующее действие АНИТ в отношении данного фермента может быть связано именно с интенсификацией процессов ПОЛ и действием кислородных радикалов, производимых нейтрофилами, инфильтруемыми в ткань печени крыс, интоксицирован-ных АНИТ, и происходящим в результате этого повреждением печени и уменьшением содержания антиоксидантов.
Содержание диеновых конъюгатов на 3 сутки после введения а-нафтилизотиоцианата превышало контрольные значения в 1,2 раза и в дальнейшем продолжало увеличиваться, достигая на 5 сутки величин, в 1,7 раза больших, чем в контроле. Уровень диенкетонов также постепенно возрастал, превышая контрольные показатели в 1,6 на 5 день эксперимента (табл.7, рис.17).
Полученные нами результаты находятся в соответствии с литературными данными. У крыс, интоксицированных АНИТ, резко выраженная нейтрофильная инфильтрация предшествовала наступлению холестаза [Goldfarb S. et al., 1962] и повышалось содержание продуктов пероксидно-го окисления липидов в сыворотке крови [Kongo М. et al., 1999]. Кроме того, показано, что нейтрофилы опосредуют ПОЛ путем производства супероксидного аниона с помощью активированной НАДФН-оксидредуктазы в клетках [Zimmerman H.J. et al., 1997].
В наших исследованиях характер изменения активности нейтральной сфингомиелиназы повторял характер изменения содержания диеновых конъюгатов и диенкетонов в печени мышей при действии АНИТ. На рис.18 продемонстрирована коррелятивная взаимосвязь между этими параметрами с высокими коэффициентами линейной корреляции.
