Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 8
1.1. Основные методические подходы к изучению ПОЛ в мембранных структурах 8
1.1.1. Общая схема процессов цепного свободнорадикального окисления ШК в липидной фазе мембран.. 8
1.1.2. Экспериментальные исследования кинетики ПОЛ в мембранах. 14
1.1.2.1. Реакции инициирования цепей 14
1.1.2.2. Реакции разветвления цепей 29
1.1.2.3. Реакции продолжения цепей 32
1.1.2.4. Реакции обрыва цепей 33
1.1.3. Математическое моделирование кинетики ПОЛ в биомембранах 36
1.2. ХЛ как метод изучения кинетики ПОЛ в мембранных системах 43
1.2.1. Свободнорадикальные механизмы ХЛ при ПОЛ в биологических системах 43
1.2.2. Химические активаторы ХЛ. 66
1.2.3. Физические активаторы в исследовании механизмов ХЛ 78
1.2.4. Информативность хемилюминесцентного метода изучения свободнорадикальных реакций ПОЛ 87
2. Объекты и методы исследования 94
2.1. Выделение митохондриальных мембран 94
2.2. Приготовление липосом из яичных фосфолипидов 94
2.З. Получение "уфасом" из линоленовой кислоты 96
2.4. Индукция ПОЛ в суспензии биомембран ионами 96
2.5. Индукция ПОЛ в суспензии биомембран УФ-облучением или под действием видимого света 97
2.6. Ферментативные системы, продуцирующие свободные радикалы 97
2.7. Приготовление активаторов ХЛ 98
2.8. Измерение ХЛ 99
2.9. Непрерывное измерение концентрации Fe 102
2.10. Спектральные измерения 104
2.11. Полярографическое измерение концентрации кислорода 104
2.12. Определение Продуктов ПОЛ 106
2.13. Облучение суспензии липосом СШ-излучением мил лиметрового диапазона длин волн 107
2.14. Математическое моделирование кинетики ПОЛ в биомембранах 109
2.15. Статистическая обработка экспериментальных результатов 109
3. Результаты и их обсуждение 111
3.1. Математическое моделирование хемилюминесцентных реакций ПОЛ в биомембранах 111
3.1.1. Уточнение и дополнение математической модели кинетики ПОЛ для гомогенной системы 111
3.1.2. Влияние гетерогенности системы на параметры кинетической модели процессов ПОЛ 127
3.2. Изучение роли липидных и водных радикалов в процес сах ПОЛ методом ХЛ 134
3.2.1. Исследование вклада липидных и водных радикалов в хемилюминесценцию при ПОЛ биомембран с помощью активаторов ХЛ 134
3.2.2. Изучение роли водных радикалов в кинетике ХЛ при ПОЛ биомембран с помощью ингибиторов свободнорадикальных реакций 173
3.3. Влияние СВЧ излучения низкой интенсивности на ПОЛ в суспензии мембран 185
3.3.1. Обоснование задачи исследования 185
3.3.2. Влияние СВЧ излучения миллиметрового диапазона длин волн на скорость накопления продуктов ПОЛ в суспензии липосом при различных способах инициирования 186
3.3.3. Роль перемешивания в протекании процессов ПОЛ... 192
З.4. Конвекционный механизм действия СВЧ излучения на ПОЛ в суспензии биомембран. 195
Выводы 201
- ХЛ как метод изучения кинетики ПОЛ в мембранных системах
- Приготовление липосом из яичных фосфолипидов
- Математическое моделирование кинетики ПОЛ в биомембранах
- Изучение роли липидных и водных радикалов в процес сах ПОЛ методом ХЛ
Введение к работе
Перекисное окисление липидов (ПОЛ) в настоящее время считают одним из ведущих механизмов молекулярной патологии мембран. Повреждения структуры и функций различных мембранных систем при протекании процессов ПОЛ были изучены в многочисленных экспериментальных исследованиях.
Скорость окислительной деструкции липидов - основного строительного материала биологических мембран - представляет интерес при изучении самых различных процессов в биологических системах и физико-химических воздействий на них. Но количественный анализ кинетики ПОЛ в биологических системах до сих пор остается нерешенной проблемой. Дело в том, что традиционные экспериментальные и теоретические методы химической кинетики непригодны для изучения кинетики реакций в сложных гетерогенных системах, к которым относятся биологические мембраны в водном окружении и другие натив-ные липид-содержащие системы.
Ситуация изменилась с появлением в арсенале биологов метода измерения хемилюминесценции (ХЛ) - сверхслабого свечения, сопровождающего реакции окисления органических соединений молекулярным кислородом. Наряду с высокой чувствительностью и малоинерционностью, этот метод обладает уникальными свойствами: применение его не требует деструкции изучаемых объектов (даже при исследовании целых органов) и процесс измерения не вносит никаких возмущений в изучаемые процессы. Перечисленные достси*инства, а также относительная простота метода обусловили его широкое применение в медико-биологических исследованиях и в практической медицине (для клинической диагностики и судебно-медицинской экспертизы).
Однако механизмы ХЛ в биологических системах до сих пор остаются неясными. Измеряемые величины интенсивности свечения зависят не только от скорости изучаемых хемилюминесцентных реакций, но и от ряда факторов, не поддающихся точному учету. Кроме того, во многих системах при физиологических условиях уровень ХЛ очень низок. Все это ограничивало применение метода для изучения кинетики ПОЛ в мембранах.
Одним из наиболее перспективных путей повышения информативности хемилюминесцентного метода и расширения возможностей его практического использования, по всей видимости, является применение активаторов ХЛ, способных избирательно усиливать свечение отдельных хемилюминесцентных реакций в гетерогенных системах. Этот методический подход впервые был использован в нашей работе для изучения механизмов ХЛ при ГОЛ, для экспериментального исследования кинетики ГОЛ в мембранах и анализа кинетических особенностей протекания процессов ПОЛ в гетерогенных системах (мембранах митохондрий и липосомах).
В работе экспериментально и с помощью математического моделирования были получены константы скоростей элементарных реакций ПОЛ в митохондриальных мембранах. Впервые проведена оценка роли гетерогенности системы в кинетике ПОЛ; предложены соотношения, связывающие константы скоростей реакций в липидной фазе мембран и эффективные константы для всей суспензии (измеренные в эксперименте). Исследован механизм ХЛ при ПОЛ в мембранах и проведена оценка вклада хемилюминесцентных реакций липидных и водных радикалов в интегральную ХЛ мембранных систем. Обнаружено ускорение ПОЛ в суспензии липосом под действием СВЧ излучения низкой интенсивности. Изучен физико-химический механизм этого эффекта, основанный на ускорении переноса кислорода в гетерогенной системе к реакционным центрам в мембранах.
Полученные в диссертации результаты говорят о важности учета гетерогенности системы при анализе особенностей протекания процессов ПОЛ и сопровождающей его ХЛ в биологических мембранах.
ХЛ как метод изучения кинетики ПОЛ в мембранных системах
С тех пор, как в конце 50-х годов в СССР и за рубежом было обнаружено сверхслабое свечение в различных химических процессах и биологических системах (см.обзоры [21,135,219] ), изучение сво-боднорадикальных реакций и механизмов возбуждения ХЛ происходило параллельно, и эти два направления исследований стимулировали развитие друг друга. Метод ХЛ, преимущества которого состоят в рекордной чувствительности безынерционности и отсутствии возмущений в объектах при измерениях, внес большой вклад в изучение кинетики процессов ПОЛ в мембранах. С другой стороны, были установлены с определенной степенью достоверности механизмы химического возбуждения люминесценции при жидкофазном свободнорадикальном окислении органических соединений [12,16] ; основные закономерности этого явления нашли применение для описания механизмов ХЛ при ПОЛ в биологических системах \22t 24l] . Однако ввиду крайне сложного состава и гетерогенности структуры механизмы ХЛ в биомембранах во многом остаются еще неясными. При изучении механизма ХЛ необходимо решить 2 задачи: I) обнаружить реакцию (или последовательность реакций), приводящую к образованию возбужденных продуктов, т.е. установить механизм возбуждения ХЛ; 2) идентифицировать соединения, с возбужденного уровня которых происходит излучение фотонов, т.е. установить механизм эмиссии ХЛ. Связь ХЛ с цепным свободнорадикальным ПОД в биологических системах Гипотеза Б.Н.Тарусова и соавт. о том, что ХЛ в биологических объектах, особенно после воздействия ионизирующего излучения, обусловлена цепным свободнорадикальным ПОЛ [90-92] , впоследствии была подтверждена многими работами, в которых прослеживались корреляции между различными проявлениями процесса ЛОЛ, с одной стороны, и ХЛ, с другой: 1. ХЛ систем, в которых протекает ЮЛ, сопровождается накоп лением химических продуктов перекисного окисления (ЩА, гидропере киси липидов), хотя кинетические корреляции не всегда имеют место [31,32,86] . 2. И ПОЛ, и ХЛ зависят от присутствия кислорода [25,87] и субстратов окисления (ШК [58,124] ) в системе. Показано, что ХЛ липосом в присутствии цитохрома с линейно зависит от степени ненасыщенности липидов [124] . 3. ХЛ усиливается при действии in vitro каких-либо агентов, ускоряющих процесс ПОЛ в препаратах. Это было показано для Fe2+ в суспензии митохондрий и растворах олеиновой кислоты [33,77,85-88], суспензии эритроцитарных мембран [214] , плазме крови [ 34,93] и многих других системах.
Накопление или добавление экзогенных гидроперекисей липидов [77,95,121,124] , а также Нг 0г , органических перекисей [42І , соединений, индуцирующих микросомальное окисление [ I] , также существенно ускоряло ПОЛ и повышало уровень ХЛ. Липо-ксигеназная реакция перекисного окисления НЖК, катализируемая ферментом, - тоже очень эффективный источник ХЛ [60,64,121,203] . 4. Ингибиторы ПОЛ снижают также и интенсивность ХЛ. Таким действием обладают липидные антиоксиданти ( оС - токоферол, стероидные гормоны и др.) [39,43,75] и соединения, блокирующие проок-сидантное действие Fe , например, ЭДТА [85] . 5. В некоторых работах показана связь между ХЛ и реакциями свободных радикалов, определяемых прямым методом электронного парамагнитного резонанса. В работе [240] показано, что низкотемпературная ХЛ при размораживании УФ-облученного при 77К метиллинолеа-та связана с рекомбинацией свободных радикалов НЖК аллильного и алкильного типа, образованных в процессе фотолиза. При температурах выше П7К происходит взаимодействие первичных радикалов с Og (реакция 2), и рекомбинируют радикалы преимущественно перекисного типа. При физиологических температурах с помощью ЭПР-метода остановленного потока в сочетании с ХЛ регистрацией удалось обнаружить корреляцию между концентрацией пероксирадикалов (получаемых в реакции разложения церием гидроперекиси линоленовой кислоты - р. 25 ) и корнем квадратным из интенсивности ХЛ [73] . Это позволяет предположить, что возбуждение ХЛ происходит в реакции рекомбинации пероксирадикалов - реакции 6. Кинетика перекисных радикалов изучалась методом ЭПР и в более сложных системах: при ПОЛ в суспензии митохондрий печени крыс, катализируемом гемопротеидами, и при окислении НЖК, катализируемом липоксигеназой. Интенсивность ХЛ в этом последнем случае была пропорциональна квадрату концентрации перекисных радикалов, что также подтверждает механизм возбуждения ХЛ в реакции 6 [64] . Таким образом, свободнорадикальный механизм ХЛ при ПОЛ в биологических системах достаточно надежно обоснован. Химическое возбуждение свечения происходит в реакции рекомбинации радикалов, по всей вероятности, перекисного типа. Однако до сих пор не решен вопрос о эмиттере ХД, и это связано прежде всего со сложностью и гетерогенностью мембранных систем. Поэтому целесообразно рассмотреть механизмы ХЛ в более простых, гомогенных системах, а затем попытаться синтезировать полученные результаты на уровне реальных гетерогенных систем - биологических мембран и их моделей.
Механизмы эмиссии ХЛ при жидкофазном окислении органических соединений Для понимания процессов, протекающих в липидной фазе мембран, наибольший интерес представляют исследования механизмов эмиссии ХЛ в реакциях жидкофазного окисления углеводородов ( RH2 ). Уже в ранних работах Васильева и соавторов было обнаружено, что квантовый выход ХЛ в свободнорадикальных реакциях, инициированных неустойчивыми соединениями, распадающимися при нагреве на свободные —Я то радикалы, очень низок в отсутствие кислорода (10 -10 ). Присутствие кислорода резко (примерно на 2 порядка) усиливало ХЛ при той же скорости инициирования свободнорадикальных процессов [17,20] . Поэтому из трех сильно эндотермичных реакций, которые могут привести к образованию продуктов в возбужденном состоянии: 26. HR + HR — HRRH + 60 ккаль/моль, 27. HR + HROg — HROORH + 70 ккал/моль, 28. HRO2 + HROA, — R=O + нон +cu + ЮО ккал/моль наиболее вероятной оказывается последняя реакция (диспропорциони-рование перекисных радикалов) [17,96] . Энергии реакции ( 100 ккал/моль) достаточно для возбуждения не только триплетного (Tj), но и синглетного ( s1 ) уровня кетона, а также для возбуждения синглетного кислорода ( 1 л g и 1 Z g+ уровни; 22,5 и 37 ккал/моль, соответственно) [7] . Образование возбужденных продуктов должно происходить при распаде промежуточного продукта - чет- вертичной перекиси (тетроксида) - по механизму Руссела за счет циклического перехода в этой молекуле [і 62, 218) : 29 Ч / 0 /TVX Л" Ключевой структурой для возбуждения предполагается бирадикал J C - 0 - 0 - 0 , образующийся после отделения продукта, содержащего спиртову группу [16] . По правилам спинового отбора в реакции может выходить: I) кислород в синглетном возбужденном состоянии и синглетный кетон ( SQ , образование s1 маловероятно по энергетическим соображениям); 2) кетон в триплетном возбужденном состоянии (Tj) и триплетний невозбужденный кислород [7,162] Химические данные (изучение превращения 9,10-ДФА в 9,10-эндо-перекись ДФА) показывают, что в некоторых системах выход 0% при диспропорционировании перекисных радикалов может быть порядка 30 % [162] Рассмотрим его, как возможный эмиттер ХД. 0о является очень стабильной частицей из-за спинового ограничения на переход в основное триплетное состояние ( s—-т ). Поэтому излучатель-ная способность его невысока. Но, в принципе, можно ожидать следующие излучательные переходы молекулы О;? [173,177] : AQ -- / +(1% , - =1270/7/7 Второй переход маловероятен из-за нестабильности LQ, состоя- ния, которое быстро переходит в более энергетически выгодное, Л О. Синглетный возбужденный кислород способен образовывать димеры: 30. о + 0 — ( о )z , которые могут давать следующие излучательные переходы в видимой области спектра, обнаруженные в газовой фазе [173,229] : 2 ty] —i Z/ .f+k% , xr 633 нп ; ME/1—Г/" f л= 7 »п Очевидно, последние два перехода крайне маловероятны из-за малых количеств Yl Q -возбужденного кислорода. Реально следует учитывать возможность излучения возбужденных димеров только 2 [ А 0\ В красной области спектра ( Л бЗЗ нм).
Приготовление липосом из яичных фосфолипидов
Митохондрии печени белых крыс выделяли по методике, описанной В.П.Скулачевым [83] , с некоторыми модификациями. Гомогенат печени в 10-кратном объеме среды выделения (250 мМ сахарозы, 2,5 мМ трис-HCl буфера, рН=7,5; 20С), центрифугировали 10 мин при 450 g в охлажденном роторе центрифуги ЦЯР-І (при 0-i4oC). Супернатант центрифугировали еще 10 мин при 450 g, а затем 20 мин при 4000 g . Митохондриальные мембраны получали путем разведения полученного осадка митохондрий бидистиллированной водой в 50 раз (чтобы получить 5-Ю миллиосмомолей/литр 230 ). Полученную смесь центрифугировали 40 мин при 4000 g , осадок разводили водой до конечной концентрации митохондриального белка 35-45 мг/мл Белок определяли микробиуретовым методом [167] . Оптическая плотность окрашенного комплекса измерялась при 330 нм на спектрофотометре "Спектромом". Калибровочную кривую строили по стандартным концентрациям ЧСА "Реанал". В экспериментах использовалась суспензия митохондриальных мембран (МхМ) 0,67 мг/мл белка в инкубационной среде: 105 мМ КС1 , 20 мМ трис-НСі буфера, рН=7,45. Такая концентрация обеспечивает достаточную интенсивность ХЛ при относительно низкой величине светорассеяния суспензии. П.2. Приготовление липосом из яичных сЬос олипидов Фосфолипиды для приготовления липосом выделялись из желтков куриных яиц по методу Блайя и Дайера [lI7] , с последующей очисткой от нейтральных липидов преципитацией в охлажденном обезвоженном ацетоне [54] . Процедура выделения сводилась к следующему. Гомогенизирование желтков куриных яиц производилось в смеси хлороформа и метанола в соотношении 0,8 I : 2 по объему. Затем к смеси добавляли I объемную часть хлороформа и I часть воды. После 20 минутной инкубации в холодильнике смесь разделяли на две фазы; нижнюю, хлороформную фракцию экстракта отбирали в круглодонную колбу и выпаривали на роторном испарителе. Нейтральные липиды и частично пигменты удалялись из полученного экстракта путем 5-кратного осаждения из. охлажденного ацетона [54] , обезвлженного прокаленным Са С12 и перегнанного непосредственно перед использованием. Осадок фосфо-липидов растворяли в хлороформе (100 мг/мл) и использовали для приготовления липосом или последующего хроматографического разделения [65] . Тонкослойную хроматографию проводили на стеклянных пластинках (15 х 20) см с закрепленным слоем силикагеля " Ъ S -5/40" (ЧССР- "Chemapol" ), содержащим 13% гипса. На каждую пластинку наносили 8,5 г силикагеля, тщательно перемешанного с 18 мл воды. Толщина слоя после высушивания была около 0,8 мм. После часовой активации пластинок в сушильном шкафу (при П0С) на горячие пластинки наносился хлороформ-метанольный (1:1) концентрированный раствор фосфолипидов.
Пластинки помещали в хро-матографическую камеру в хроматографическую смесь хлороформ-метанол-вода (65:5 25:4 по объему ). После разгонки снятую с пластинок фракцию лецитина собирали в колбу со смесью хлороформа и метанола (1:1) для элюирования. Силикагель осаждали центрифугированием (2000 є , 10 мин). Супер-натент выпаривали на роторном испарителе при комнатной температуре и растворяли сухую пленку в метаноле. Выход лецитина составлял около 200 мг на один желток. Концентрация липидов определялась гравиметрически (по весу сухих остатков после выпаривания определенного объема растворов). Липосомы получали по методу Бэнгхема [112,113 путем ручного диспергирования в буферном растворе (105 мМ к С1 » 20 мМ трис-НС рН=7,5 при 20С) сухой пленки фосфолипидов после выпаривания под вакуумом на роторном испарителе соответствующего хлороформного раствора. После часовой инкубации при комнатной температуре липосомыдиспергировали путем многократного (5-Ю раз) замораживания в жидком азоте и последующего оттаивания 84] . П.З. Получение "уфасом" из линоленовой кислоты Суспензию мицелл линоленовой кислоты ("уфасом") получали из линоленовой кислоты (очищенной хроматографически на колонке с си-ликагелем [54] ). Для этого интенсивно перемешивали на магнитной мешалке линоленовую кислоту (2 мг/мл) в буферном растворе (105 мМ К сі ,20 мМ трис) при рН-10, затем рН суспензии постепенно доводили до 7,5 (20С), добавляя 0,1 и HCi . 2+ Л.4. Индукция ПОД в суспензии биомембран ионами Fe Для измерения кинетики ХЛ, индуцированной добавлением ферро-ионов, приготовляли 4,5 мл инкубационной смеси,, содержащей 105 мМ КС1, , 20 мМ трис- Н С1 (рН=7,5 при 20С) и 2 мг/мл липосом или 0,67 мг/мл (по белку) митохондриальных мембран. Реакции ЛОЛ и сопровождающая его ХЛ запускались в интенсивно перемешиваемой инкубационной смеси добавлением в кювету 0,5 мл раствора Fe so. до конечной концентрации 50 300 мМ, как описано в работе [22j . В некоторых экспериментах для инициирования ПОЛ использовалась Ре + -аскорбатная смесь (конечная концентрация Fe составляла 2,4 мМ, а аскорбиновой кислоты 200 мМ). При этом способе инициирования ПОЛ происходит постоянное регенерирование Ре из Ре восстановлением в реакции с аскорбиновой кислотой, что обеспечивает постоянную концентрацию инициатора реакций. Для остановки реакций в суспензию добавлялся раствор ЭДТА (до конечной концентрации I мМ) [85 П.5. Индукция ПОЛ в суспензии биомембран УФ-облучением или под действием видимого света УФ облучение суспензии липосом (5 мг/мл) производили с помощью ксеноновой лампы облучателя Toshiba S Н L - 100 и V » снабженного тепловым водным фильтром и абсорбционным светофильтром БС-І2, который не пропускает свет с длиной волны короче 250 нм. Это позволяет избежать прямого фотолиза первичных продуктов ПОЛ, содержание которых определяло степень окисления препаратов в наших экспериментах. Фотосенсибилизированное ПОЛ под действием видимого света производилось с помощью облучателя 0И-І9 в присутствии метиленового синего (в концентрации 2,5 мМ). Л.б. Ферментативные системы, продуцирующие свободные радикалы Ксантиноксидазная система в наших экспериментах представляла собой суспензию ксантиноксидазы сливок ("Реахим") 100 мкг/мл в стандартном буферном раствере (105 мМ КС1 , 20 мМ трис-НСі , рН=7,5).
Ферментативная реакция, сопровождающаяся хемилюминесцен-цией, запускалась после добавления субстрата - гипоксантина - до конечной концентрации 10 М. (при интенсивном перемешивании). Липоксигеназная система включала в себя суспензию мицелл ли-ноленовой кислоты ("уфасом) 2 мг/мл в стандартном буфере и 20 мкг/мл липоксигензы " Sigma ". Реакция запускалась добавлением фермента к перемешиваемой суспензии. Супероксиддисмутаза (СОД), которая катализирует реакцию диспропорционирования супероксидных анион-радикалов без образования активной формы кислорода (0«?), добавлялась в некоторых экспериментах в виде водного раствора до конечной концентрации 5-50 мкг/мл. Использовался кристаллический препарат супероксиддисмутазы " Serva ". В качестве модельной системы для генерации радикалов воды та 2+ и перекиси водорода в присутствии Ре использовалась система 2+ Фентона: 400 мМ 0 и 10 мкМ Fe в стандартном буферном растворе. II.7. Приготовление активаторов ХД Люминол ("ЧДА", "Реахим") очищали перекристаллизацией из о этанола. Исходный раствор I0"fc М получали в области высоких рН . (ІІ-Ї-І2) при нагревании, затем титровали до нейтрального рН в стандартном буферном растворе. Для приготовления редкоземельных активаторов использовали соль европия Еи2 (со ) и окись тербия ТЬ4 оj квалификации "хч". Навески, необходимые для приготовления исходных раст-воров (10 М}, растворяли в 0,1 н НС1 (с добавлением 1-2 капель HgOg в случае ТЬд 0 ) и кипятили до полного растворения. В таком виде растворы солей РЗ элементов хранятся неограниченно долго. Непосредственно перед измерениями растворы добавляли в инкубационную смесь и рН доводили до необходимой величины.
Математическое моделирование кинетики ПОЛ в биомембранах
Суспензия липосом (5 мг/мл) приготавливалась, как описано выше. ПОЛ в данных экспериментах инициировалось тремя способами (как описано выше). Скорость ПОЛ оценивалась по накоплению в липо-сомах продуктов реакций, которые регистрировались тремя методиками, как описано в разделе П.12. П.14. Математическое моделирование кинетики ПОЛ в биомембранах Процесс ПОЛ в биомембранах был описан системой дифференциальных уравнений на основании полной схемы реакций, как описано в работах Ю.А.Владимирова и сотр. [24,67,241] . Эти уравнения были решены методом численного интегрирования Рунге-Кутта с помощью ЭЦВМ АСВТ М-4030. 11.15. Статистическая обработка полученных экспериментальных результатов Статистическую обработку результатов проводили при измерении констант реакций ПОЛ с использованием -критерия Стьюдента-Фишера: Я где X — L - среднее арифметическое полученных /с» экспериментальных величин X. , J1 истинное среднее значение изучаемого параметра, около которого случайным образом распределяются измеряемые величины JC/ , S? = г—; хЛ уд средняя ошибка для среднего арифметического (характеризует его отклонение от JUL ), о - среднее квадратичное отклонение от Д (практически и от / ) - вычислялось по формуле: - no - ft- во всех случаях означает объем выборки, то есть количество Jf. В конечном итоге значение константы представляется в виде доверительного интервала значений или, иначе J 0,05 J ) где t s - величина критерия Стыодента-Фишера для уровня значимости Р = 0,05. Это означает, что доверительная вероятность нахождения измеряемой константы в данном интервале составляет 95 % [ 80] . В то же время следует принять во внимание, что стационарное свечение также вносит вклад в измеряемую интенсивность ХЛ ( і ); уровень этой ХЛ примем для простоты постоянным ( і ). Если учесть величину lgT , зависимость 1 /І/І І5І от t представляет собой прямую линию (рис.5,С), и можно легко опреде лить к6/% Гораздо сложнее определить квантовый выход Обычно его принимают равным площади под кривой ХЛ (светосумме), отнесенной к молярному количеству продукта, образованного при ре комбинации RC 2 радикалов. К сожалению, неизвестно, сколько молей ROg участвовало в реакции 9. М&ксималвное количество Щ может образоваться, если в течение всей стадии "медленной вспьшки" все ионы Ре + реагируют только с гидроперекисями, образуя один радикал RO в каждом химическом акте, и все ROA исчезают исключительно в реакции б. Тогда общее количество возбужденного продукта, образовавшегося в литре суспензии, будет [fe ]3/ значением, принятым в расчетах.
Однако даже с учетом заниженности величины константы к 6 , измеренной в наших экспериментах, она оказалась почти на порядок ниже, чем ранее определенная по кинетике "быстрой вспышки" в работе [67] . Определение "критической концентрации" железа - foe2 ] К Как уже говорилось в литературном обзоре, нарастание концентрации свободных радикалов и увеличение ХЛ начинается при концентрации [ре +] = [Ре2+. я , которая была названа "критической". Эта концентрация соответствует самому началу "медленной вспышки" ХЛ в суспензии митохондриальных мембран, к которой добавлен из-быток Ре т . Этот момент на кривой кинетики ХЛ может быть определен, хотя и не очень точно, как точка пересечения восходящей ветви "медленной вспышки" с продолжением уровня стационарного све- 2+ чения. Концентрацию Ре определяли оптическим методом, как описано выше. Величина критической концентрации Ре2+ при различных начальных концентрациях [Ре J ранее была определена этим методом в нашей лаборатории В.И.Оленевым [67] в идентичных условиях и составляла примерно 55 jflM; зависимость от количества добавленного железа была незначительной. где In+1 и I интенсивности ХЛ, измеренные в моменты времени tn+1 и tn График lg ( і / і ) как [ О і] Fe ] (рис.5 В ) отсекает сегмент на оси абцисс, соответствующий [Ре +] х . После 26 измерений таким способом была вычислена средняя величина (при Ре2+ = 100 мкМ): [ре2+]я = 63 і ІЗ мкМ (Р = 0,05) Эта величина очень важна для определения констант частных реакций ПОЛ, так как она определяет отношение к [/?//] /kg (см. ур. (9) ). Можно считать, что полученное нами значение согласуется с данными В.И.Оленева (55 WM ) [67] . Проверка значения константы скорости окисления FR2 « приводящего к инициированию ПОЛ От скорости окисления ферроионов в системе зависит величина латентного периода в развитии ПОЛ и ХЛ. Эту зависимость можно использовать для проверки адекватности определения величин к [о ] и . [Ре2+]х . Теоретически величина латентного периода может быть опреде- 2+ лена как время, необходимое для спонтанного окисления Ре от начальной концентрации ( [Fe 10 ) Д критической - we J [27] . В предыдущем разделе описано, как можно приблизительно оп ределить это время ( 7$ ). Величина Т9 , полученная для различных , в таблице 2 сравнивается со значениями, полученными из уравнения (32):
Изучение роли липидных и водных радикалов в процес сах ПОЛ методом ХЛ
Для выявления роли свободных радикалов в водной и липидной фазах мембран нами использована активация ХЛ различивши активаторами. Как уже стало ясно из предыдущей главы, ПОЛ включает в себя целую систему реакций, часть из которых протекает в мембранах, а часть - в водной фазе. Интегральная интенсивность ХЛ дает далеко не однозначную характеристики скорости ПОЛ по ряду причин: Во-первых, не только реакции ш -радикалов, но и реакции свободных радикалов воды и перекиси водорода также могут сопровождаться свечением, в ряде случаев довольно интенсивным 102 . Во-вторых, хемилюминесценция, сопровождающая ПОЛ в мембранах, сильно зависит не только от выхода возбужденных состояний (в реакции б), но и от квантового выхода свечения, определяемого присутствием эндогенных активаторов и тушителей ХЯ 67,209 . По этой причине в своей работе мы использовали трис-буфер вместо фосфатного (где особенно сильно происходит накопление активаторов в процессе ПОЛ), использовали отмытые мембраны, а не органеллы, чтобы исключить выход тушителей и активаторов матрикса при окислительной деструкции мембран [67] и, наконец, измеряли ХЛ в присутствии экзогенных активаторов с высоким квантовым выходом и в достаточно большой концентрации, чтобы "перекрыть" возможное действие эндогенных активаторов и тушителей. Применение активаторов ХЛ может иметь, однако, и другое, еще более важное значение. Разные активаторы ХЛ характеризуются разным механизмом действия и локализуются в разных участках водно-мембранной системы. Поэтому применение определенного набора активаторов может помочь разобраться в природе свободных радикалов, генерируемых в системе, и оценить их вклад в ХЛ, а также их значение для регуляции скорости процесса ПОЛ. В качестве активаторов ХЛ были изучены следующие соединения: I) люминол; 2) органические красители (люминофоры); 3) редкоземельные ионы Еи?+ и ть3+ и их комплексы с органическими лигандами.
Для изучения механизма действия активаторов использовались различные модельные системы. Характеристика собственной (неактивированной ) ХЛ суспензии липосом Введение ферроионов в суспензию липосом сопровождается, как и в случае суспензии митохондрий, кинетикой ХЛ, состоящей из нескольких стадий: "быстрой вспышки", латентного периода, "медленной вспышки" и стационарного свечения (см.рис.19, кривая I и рис. 20, кривые I и 2). Повторное введение ферроионов, инициирующих ПОЛ, вызывает вторую "быструю вспышку" ХЛ и все последующие стадии кинетики. Спектральное распределение ХЛ суспензии липосом на разных стадиях кинетики процесса ПОЛ, вызванного введением ферроионов, представлено на рис.13. Видно, что несмотря на некоторые различия в деталях, спектры ХЛ на стадии "быстрой", "медленной" и второй "быстрой" вспышек (А,В и С на рис.13) оказались довольно сходными: положение максимума спектров оставалось неизменным (530-550 нм). Таким образом, в данной системе "красный сдвиг" спектра ХЛ при протекании ПОЛ не обнаружен, в отличие от результатов, полу- ченных ранее другими авторами в суспензии митохондрий [209]и некоторых липидных препаратах [47,209] . Можно думать, что в исследованной нами системе механизм ХЛ и условия протекания хемилю-минесцентных реакций примерно одинаковы во время всей кинетики и почти не зависят от скорости свободно-радикальных процессов. Наиболее удобным параметром для изучения спектрального состава и степени активации ХЛ различными соединениями оказалась величина максимальной интенсивности ХЛ на стадии "медленной вспышки": воспроизводимость результатов была наиболее высока. На стадии "быстрой вспышки" разброс величины максимальной-интенсивности достигал 10 %\ это объясняется зависимостью параметра от скорости введения железа и перемешивания, а также относительно большой постоянной времени самописца. Поэтому в дальнейшем измерения ХЛ мы производили на стадии "медленной вспышки". Спектр ХЛ (рис.13,В) содержит несколько максимумов, положение которых достаточно хорошо соответствует литературным данным. Природа этих эмиттеров ХЛ в настоящее время точно не установлена. Можно предположить, вслед за авторами работы [119] , что основной максимум при 530-Б50 нм соответствует эмиссии триплетного кегона, а максимум в районе 450-480 нм - эмиссии синглетного возбужденного кетона, образующихся в реакции 23. Максимум в красной области спектра (610-630 нм), вероятно, следует отнести к эмиссии возбужденных димеров синглетного кислорода, который также образуется в реакции 23 при рекомбинации пероксирадикалов НЖК. Однако нельзя исключить и другую интерпретацию наших экспериментальных данных. В частности, максимум в спектре ХЛ суспензии липосом при 450-480 нм может быть связан с реакциями водных радикалов, приводящих к эмиссии "возбужденного карбоната". Об этом может свидетельствовать тот факт, что положение максимума в спект- 2+ ре ХЛ реактива Фентона (%0g + Fe \ измеренном в наших экспериментах, оказалось точно таким же (450-480 нм), как показано на рис.16,А. Все это еще раз подтверждает необходимость изучения вклада различных хемилюминесцентных реакций в интегральную ХЛ мембранных систем. Использование же спектрального анализа собственной (неактивированной) ХЛ для решения этого вопроса пока не представляется возможным из-за недостатка экспериментальных данных о природе первичных эмиттеров. Активация ХЛ люминолом Действие этого известного активатора ХЛ основано на химическом процессе окислительного диоксигенирования люминола, подробно рассмотренном в обзоре литературы; образовавшийся возбужденный продукт реакций дает люминесценцию с максимумом в синей области Известно, что люминол на 3-4 порядка усиливает свечение в реактиве Фентона и других системах, продуцирующих радикалы «ОН и 0 . Окисление люминола, по всей вероятности, лимитируется скоростью реакции с гидроксильным радикалом, поэтому ХЛ люминола иногда применяется для обнаружения этой "активной формы" кислорода в различных системах [33, 203] .
В липид - содержащих системах (митохондрии, растворы НЖК) в 2+ присутствии Fe люминол способен в больших концентрациях усиливать ХЛ на 1-2 порядка; однако не исключена возможность окисления люминола в хемилюминесцентнои реакции с липидными радикалами Гзз] . Поэтому не было выяснено, какой вклад в ХЛ на стадии "медленной вспышки" вносят реакции воднь&радикалов, На рис.14 приведена концентрационная зависимость активации ХЛ люминолом в суспензии мембран митохондрий. Видно, что степень усиления ХЛ (на стадии "медленной вспышки") может достигать 20 при концентрации активатора около 2.10 М. Для проверки гипотезы о возможности хемилюминесцентной реакции люминола с липидными радикалами была исследована эффективность активации ХЛ в нескольких модельных системах. На рис.15 представлены концентрационные зависимости степени активации ХЛ люминолом в системах с различным содержанием липид-ных и водных радикалов. Видно, что в согласии с литературными данными, люминол очень значительно усиливает ХЛ в системах, продуцирующих ОН и 0 радикал (I и 2 на рис.15); сравнительно эффективен в Ре2+ -индуцируемом ПОЛ в липосомах (3 на рис.15) и практически не активирует ХЛ в реакциях, связанных с ферментативной генерацией ROA (кривая 4). Таким образом, люминол, по-видимому, высокоспецифичный активатор ХЛ реакций с участием ОН и 0g радикалов и не активирует ХЛ реакций с участием пере-кисных радикалов НЖК (по крайней мере, в липидной фазе мембран). На рис.16 представлено спектральное распределение ХЛ, активированной люминолом в системе Фентона (В) и в суспензии липосом (С). Сходство спектров свидетельствует, по-видимому, об общности механизма основной хемилюминесцентной реакции в обеих системах в присутствии люминола, т.е. окисления люминола "активными формами" кислорода.
