Содержание к диссертации
Введение
2. Обзор литературы
2.1. Окислительно-восстановительные реакции гемсодержащих белков с ионами и комплексами металлов 9
2.1.1. Редокс-реакции гемсодержащих белков с комплексами железа
а) Цитохром С 12
б)ЦитохромЬ5 16
в) Белки - переносчики кислорода: гемоглобин, миоглобин 19
г) Леггемоглобин 25
2.1.2. Окисление гемсодержащих белков ионами и комплексами меди
а) Цитохром С 27
б) Цитохром Ьз 30
в) Белки - переносчики кислорода: гемоглобин, миоглобин 30
г) Леггемоглобин 38
3. Материалы и методы
3.1. Получение интактных, химически модифицированных и мутантных белков 41
3.2. Изоэлектрофокусирование 42
3.3. Спектрофотометрическое титрование 42
3.4. Кинетические измерения 42
3.5. Изучение локализации меди методом ЯМР высокого разрешения 43
3.6. Расчет распределения электростатического потенциала и впадин и полостей в миоглобиновой молекуле 44
4. Результаты и их обсуждение
4.1. Механизм окисления МЬОг ионами и комплексами меди: миоглобины, карбоксиметилированный и карбоксиамидированный по гистидину 45
4.2. Окисление оксимиоглобина, катализируемое ферроцианидом: нативные оксимиоглобины кашалота, лошади и свиньи, карбоксиметилированный по остаткам гистидина и мутантный (Hisl 19-»Asp) оксимиоглобины кашалота 59
5. Выводы 76
6. Список литературы 78
- Белки - переносчики кислорода: гемоглобин, миоглобин
- Окисление гемсодержащих белков ионами и комплексами меди
- Кинетические измерения
- Окисление оксимиоглобина, катализируемое ферроцианидом: нативные оксимиоглобины кашалота, лошади и свиньи, карбоксиметилированный по остаткам гистидина и мутантный (Hisl 19-»Asp) оксимиоглобины кашалота
Белки - переносчики кислорода: гемоглобин, миоглобин
Переносчики кислорода - гемоглобин (НЬ) и миоглобин (Mb) также являются хорошо изученными белками с известной пространственной структурой. Молекула НЬ состоит из четырех субъединиц, две альфа и две бета, каждая из которых имеет высокоспиральную третичную структуру, близкую к структуре миоглобина. Миоглобин (153 аминокислотных остатка, 17.8 кДа) обладает более высоким сродством к кислороду, чем НЬ, и способен связывать Ог при его низком парциальном давлении у стенок капилляров и транспортировать его к митохондриям. Гемовая группа локализована в гидрофобном "кармане", но в отличие от Cyt С ориентирована таким образом, что оба пропионовокислых остатка направлены в растворитель (Рис. 2.5). Из двух аксиальных лигандов Fe гема только проксимальный His93 (5-ый лиганд), принадлежит белку, а 6-ое координационное место либо свободно (дезокси-МЪ), либо занято молекулой ( или другим внешним лигандом. При физиологических значениях рН молекулы НЬ и Mb практически нейтральны или имеют небольшой суммарный заряд (pi 7) и дипольный момент (1.2 D). Восстановительные потенциалы Mb и бета-цепей НЬ одинаковы (+55 mV), у альфа-цепей - +110 mV.
Помимо способности обратимо связывать кислород, НЬ и Mb могут также вступать в редокс-реакции с солями и комплексами металлов. Впервые окисление феррицианидом дезокси- и оксипроизводных НЬ человека и Mb лошади изучали Antonini и др. методом стоп 20 флоу [Antonini и др., 1965]. Показано, что один эквивалент [Fe(CN)e]3 окисляет один эквивалент белка (в расчете на субъединицу). Кинетика окисления дезокси-НЬ не соответствует простой бимолекулярной реакции. Константа скорости сильно зависит от рН, составляя 7-Ю4 М сек"" при рН б и 0.8-104 М сек 1 при рН 9.2. Скорость окисления НЬОг феррицианидом в присутствии избытка реагента соответствует реакции первого порядка. Она увеличивается в кислых рН и линейно возрастает с уменьшением концентрации ( в растворе. Как отмечают авторы, анализ экспериментальных данных для тетрамерного НЬ представляет сложную задачу, что связано с неоднородностью его а- и р-субъединиц (Ео равны, соответственно, 110 и 55 raV), а также с наличием рН- и лиганд-индуцированных конформационных изменений в тетрамере [Brunori и др., 1971].
Окисление феррицианидом дезокси-Mb в отличие от дезокси-НЪ соответствует простой бимолекулярной реакции [Antonini и др., 1965]. Константа скорости второго порядка слабо зависит от рН, составляя 2-Ю6 и 1,4 106 М сек"1 при рН 6 и 9.2, и в 100 раз больше, чем для дезокси-Hb в тех же условиях в соответствии с различиями в их редокс-потенциалах. Окисление МЬОг избытком [Fe(CN)6]3 соответствует реакции первого порядка, скорость которой зависит от концентрации Ог. При экстраполяции к нулевой концентрации кислорода константа скорости соответствует константе связывания Ог с белком. Из этого по аналогии с взаимодействием дезокси-Mb и НЬ с различными лигандами и замещением Ог на СО сделан вывод о внутрисферном механизме переноса электрона в реакциях этих белков с [FefCN ] ". Однако позднее показано [Hegetschweiler и др., 1987], что в действительности результаты Antonini и др. свидетельствуют о том, что окисление разных лигандных ферропроизводных Mb и НЬ феррицианидом происходит через безлигандную форму белка. Несмотря на малую концентрацию дезокси-Mb в растворе ( и L\, равны, соответственно, 10 М s и 10 s"), он должен реагировать в -1000 раз быстрее, чем МЬОг, в связи с тем, что редокс-потенциал пары МЬ(2) / мет-МЬ равен 55 mV, а для пары МЬОг / мет-Mb составляет не менее 400 mV, так как высокое сродство дезоксимиоглобина к Ог стабилизирует оксиформу белка [Augustm и Yandell, 1979]. Механизм же переноса электрона - простой внедгаесферный через экспонированный в раствор край гема, как и в реакции окисления феррицианидом ферроцитохрома С.
Схема реакции может быть записана следующим образом: МЬ02 - МЬ(2) + 02 (1) МЪ(2) + [Fe(CN)6f — Mb(3)H20 + [Fe(CN)6]4 (2) Реакция (2) протекает очень быстро (кг составляет 2.76-106 М- 1сек"1 при рН 5.7 ), а стадией, лимитирующей скорость процесса, является диссоциация лигандированного кислорода (реакция 1). В интервале рН 5.7 - 9, как показано [Zhang и др., 1992, а], скорость реакции (2), рассчитанная по вышеприведенной схеме, слабо зависит от рН, увеличиваясь при рН 7 (рКЭфф 6.2). Эффект рН на кг, возможно, обусловлен протонированием одного или обоих гемовых пропионатов, для которых рК5 5.3 и которые в Mb в отличие от Cyt С ориентированы в растворитель (Рис. 2.6).
Пространственная модель участка поверхности Mb вблизи края гема [Takano, 1977]. Показаны гем, проксимальный His93 и дистальный His64, гемовые пропионаты и поверхностные аминокислотные остатки. Стрелкой показана точка поверхности, ближайшая к Fe гема (3.8 А).
Деионизация гемовых пропионатов при рН 7 должна способствовать реакции Mb с анионом [Fe(CN)6] . Следует отметить, что такой же эффект рН может быть обусловлен, кроме того, и протонированием остатка His97 (рК 5.6), расположенного рядом с гемом.
В реакциях феррицианида с МЬОг и НЬОг, как и с Cyt С, также очевидно могут иметь место электростатические эффекты, хотя зависимость скорости окисления этих белков от ионной силы не изучали. Об этом свидетельствуют данные по окислению с помощью [Fe(CN)e]3 димерного НЬ моллюска Scapharca innaequivalvis [Colony G. и др., 1994]. Оказалось, что образующийся в реакции анион ферроцианида остается прочно связанным с белком. Найденный сайт связывания близок к Cys 92 и, по-видимому, сформирован кластером положительно заряженных аминокислот Lys 96, Arg 53, Lys 65 и Arg 67 на белковой поверхности. Роль НЪС 2 (и возможно МЬОг) как аэробного биологического восстановителя трехвалентного железа была предположена из наблюдения, что он опосредует его перенос от трансферрина к 2.2 -бипиридину, хелатирующему Fe2+ [Egyed et al„ 1980]. Эта гипотеза была подтверждена на эритроцитах и ретикулоцитах кролика, где внутриклеточный уровень восстановленного железа поддерживался только в присутствии оксигемоглобина [Eguchi, Saltman, 1984]. Авторы предположили новую роль белков-переносчиков Ог в качестве мощных восстановительных реагентов и новую хелатирующую Fe функцию АТР, который ранее рассматривался только как биоэнергетический интермедиат.
Способность НЬС 2 человека восстанавливать комплексы трехвалентного железа с NT A, EDTA, АТР, цитратом, 2.3- DPG и пирофосфатом PPj была изучена при разных соотношениях Fe / хелат как в присутствии бипиридина, так и без него [Eguchi L.A., Saltman P., 1984; Eguchi L.A., Saltman P., 1987; Harrington J.P., Hicks R.L., 1994]. Скорость реакции регистрировали по спектру мет-формы белка, а также по спектру комплекса восстановленного Fe с bipy. Реакция не ингибируется супероксид-дисмутазой, указывая на то, что в ней Ог", который может служить редуктантом, не образуется [Eguchi L.A., Saltman P., 1984]. Скорость окисления НЬОг уменьшается в следующем порядке: FeNTA FeATP FeEDTA FeCit. Для FeNTA и FeEDTA скорости реакции в присутствии Ыру и без него практически не отличались, в остальных же случаях без пиперидина скорость снижалась в 3 раза. В отсутствие Ог скорость окисления дезоксигемоглобина FeNTA комплексом (2.2x103 Мисек 1) на 3 порядка выше, чем НЬОг, то-есть, скорость-лимитирующей стадией является диссоциация лигандно-связанного О;- Энергии активации окисления НЬОг указанными комплексами Fe , определенные из температурных зависимостей, лежат в пределах от 22.1 до 33.4 kcal/mol, при этом они выше в случае комплексов с EDTA и АТР.
Окисление гемсодержащих белков ионами и комплексами меди
При соотношениях же Cu2f : гем 0.5 наблюдается двухфазная кинетика: начальная быстрая фаза, в течение которой восстанавливается вся добавленная Си , и на порядок более медленная стадия, которая продолжается до окисления 50% белка и лимитируется скоростью реокисления Си+ (катализ). С увеличением концентрации 02 скорость быстрой фазы уменьшается, а медленной увеличивается. В отсутствие же 02 наблюдается только быстрая фаза реакции. Скорость окисления разных лигандированных гемоглобинов уменьшается в ряду дезокси-НЬ НЪ02» НЬСО, что предполагает протекание реакции через безлигаидную форму белка.
Различные по скорости процессы, участвующие в этой реакции, исследованы при сравнении кинетики окисления НЬ лошади и человека. Найдено, что при одинаковой концентрации меди (0.5 Си2+ на гем) быстро (за 3 мин) окисляется 50% НЬ02 лошади и только 8% НЬОг человека. В отличие от НЬ лошади, где методом равновесного диализа найдено только одно место связывания Си2+, в НЬ человека обнаружены два таких места. Так как дополнительное место обладает более высоким сродством к меди, оно, вероятно, не участвует в переносе электрона, но успешно конкурирует за связывание Си +, за счет чего в НЬ человека уменьшается количество белка, окисляющегося в быструю фазу.
Как показано разными методами, в связывании Си2+ нативным белком участвуют в основном локализованные на поверхности остатки гистидина [Rifkind и др., 1976; Rifkind, 1981]. Высокое сродство какого-либо места к Си объясняется тем, что образуется хелатный комплекс, в котором лигандами металла наряду с His могут быть и другие остатки, Lys, Asp, Glu, находящиеся рядом с His и обладающие подходящей пространственной ориентацией [Banaszak, 1965]. Одинаковое для НЬ лошади и человека место связывания иона Си2+, ответственное за быструю фазу, по-видимому, локализовано недалеко от Cys93 на проксимальной стороне гема. Химическая модификация SH-группы Cys93 йодацетамидом или N-этилмалеимидом приводит к ингибированию окисления НЬОг, однако только на 20% снижает связывание меди. Согласно этим данным остаток Cys93, по-видимому, не играет большой роли в связывании Си2+ с нативным белком, но участвует в переносе электрона с Fe гема на связанную где-то поблизости медь. Анализ показывает, что дополнительное место в НЬ человека (и кролика) с более высоким сродством к меди может включать His2 или Hisl 16 р-цепи, отсутствующие в НЬ лошади (первый замещен на Glu, а второй на Arg). В результате изучения мутантного НЬАг человека, где His 116 (З-цепи заменен на Arg, авторы делают выбор в пользу His р-2, так как скорость окисления этого белка при различных концентрациях меди и ее связывание не отличались от интактного НЬ человека (и кролика).
В присутствии Zn2+ скорость окисления НЬОг лошади ионами меди по данным Рифкинда заметно уменьшается, а также в 4 - 5 раз снижается количество НЪОг человека, окисляемого в быструю фазу [Rifkind и др., 1976]. Однако другими авторами позднее не обнаружено влияния Zn2+ на скорость окисления НЬОг в присутствии меди [Winterboum и Carrell, 1977]. Согласно данным ЭПР и равновесного диализа [Rifkind и др., 1976; Rifkind, 1979], ионы меди и цинка связываются с НЬ с примерно одинаковым сродством, но в разных участках поверхности белка.
Комплексы CuEDTA(l:l), CuNTA(l:l), CuCit(l:2), CuATP(l:10) и CuHis(l:2), как и ионы Cu2+, окисляют только р-субъединицы НЪОг человека [Eguchi L.A., Saltman P., 1987 б]. Для них скорости образования мет-Hb располагаются в следующем порядке: aquo = Cit = ATP Phen His = NTA » EDTA. Комплексы меди, слабо связывающие лиганды, такие как биологическими хелаторы цитрат и АТР, обнаруживают такие же скорости, как ион меди, а более стабильные реагируют медленнее (Таблица 2.3). Это согласуется с протеканием реакции преимущественно по сайт-специфическому механизму аналогично тому, как это было описано в работах Рифкинда. На это указывает и тот факт, что окисление гемоглобина CuNTA полностью ингбируется модификацией N-этилмалеимидом (NEM) SH-группы Cys93 р-субъединицы.
Имеется также 6 мест связывания Zn в мет-МЪ [Breslow Е., Gurd F. R. N., 1963]. Редокс-неактивные ионы Zn2+, очевидно, комплексируют с мет-Mb в тех же участках, что и Сц2+, однако их сродство к Mb меньше, так как даже в присутствии 20-кратного избытка Zn2+, когда все б мест заняты, цинк легко вытесняется из трех мест уже при добавлении 1 - 4 эквивалентов Cu2+ [Breslow и Gurd, 1963]. Разное сродство ионов Си2+ и Zn2+ к одним и тем же участкам в Mb может объясняться разной структурой образуемых ими комплексов, плоско-квадратичные для Си и тетраэдрические для Zn [Jameson, 1981]. Только один ион цинка остается связанным с Mb даже в присутствии 10-кратного избытка Си2+, т.е. конкурирует за это место с медью. В Mb кашалота при соотношениях [Zn2+j: [Mb] до 5:1, рН 6, насыщается одно место (KOTC составляет 4.4-10s М 1), в районе Hisl 19 [Постникова и Целикова, 1987].
Рентгеноструктурные данные по локализации Си2+ и Zn2+ в кристаллах мет-МЬ кашалота [Banaszak и др., 1965] согласуются с приведенными выше данными для цинка, но противоречат результатам равновесного диализа и ЯМР высокого разрешения для меди. Кристаллы Mb выдерживали при рН 6 в присутствии 3-х - 4-х - кратного молярного избытка Zn(CH3COO)2 или 80-кратного (!) избытка CuCh и анализировали методом разностного синтеза Фурье. Сделан вывод, что в обоих случаях имеется только одно место связывания: в районе Htsl2(AW) для меди и Hisl 19(GH1) - для цинка. Предполагается, что в обоих случаях с ионом металла дополнительно координируют функциональные группы одних и то же близко расположенных остатков Lysl6(A14) и Aspl22(GH4), что объясняет высокое сродство этого места к Си2+ и Zn2+ и конкуренцию между этими ионами за связывание.
Кинетические измерения
Скорость окисления оксимиоглобина исследовали спектрофотометрическн по изменению поглощения на полосе 543 или 581 нм на двухлучевом спектрофотометре Specord UV-VIS (Германия) с термостатированным кюветодержателем. Все эксперименты проводились при 20С. Белок растворяли в трис-малатном буфере, 1:1, требуемой молярности и значения рН. Начальная концентрация миоглобина составляла 2.25-10 5 М. Для получения необходимых молярных соотношений МЬОг с реагентом в реакционную смесь добавляли 10 мкл концентрированного раствора СиС12, (CuGIy, Cu(Gly)2 или K4[Fe(CN)e]) с помощью микрошприца HAMILTON. Значение рН регистрировали до и после эксперимента с точностью ± 0.05 ед. рН. Ионную силу от 0 до 0.03 варьировали изменением концентрации соответствующего буфера, а далее добавлением КС1. Кинетические кривые регистрировали в интервале времени, в котором амплитуда изменялась на 15 - 20% и который обычно охватывал начальный линейный участок. Скорость реакции характеризовали начальной скоростью (Uo) или константой скорости (к). Ошибка составляла 5-10%, для построения зависимостей на рисунках использовали среднее Do из 5-10 опытов. Эта ошибка одинакова для всех зависимостей, но на рисунке указана, как правило, только для одной из нескольких кривых, чтобы не затруднять зрительное восприятие.
Оксимиоглобин получали непосредственно перед экспериментом восстановлением мет-Mb дитионитом натрия и отделением последнего гель-фильтрацией на колонке с сефадексом G-25 в ЮмМ КС1, рН 7.5, в аэробных условиях. Для определения концентрации мет-Mb использовали коэффициенты экстинкции (мМ"1 см 1): 409=158, 505=9-5 и Еб34=3.5, а концентрации МЬОг, соответственно, Е54З=13.6 И Є5ЇІ=14.2. Комплексы CuGly и Cu(Gly)2 получали смешиванием СиСЬ с глицином в нужных молярных соотношениях. Комплекс МЪОг с Zn2+ получали, смешивая раствор белка с концентрированным раствором ZnCb (10 мкл). Все кинетические эксперименты проводились в трис-малатном буфере, рН 6-7.5, в котором в отличие от фосфатного буфера не образуется нерастворимых солей цинка и меди [Постникова Г.Б., Целикова СВ., 1987]. Реактивы: трис-буфер фирмы «Serva» (Германия), глицин («Reanab, Венгрия), хлористый цинк (х.ч.), малеиновый ангидрид (х.ч.), КС1 (ох.ч.) и K4[Fe(CN)6] (о.с.ч.) использовали без дополнительной очистки. Фосфатные буферы перекристаллизовывали дважды из водно-спиртовой смеси.
Спектры ЯМР высокого разрешения регистрировали в лаборатории ЯМР-исследований биосистем ИТЭБ РАН (рук. д.ф-м.н. В.П. Кутышенко) на спектрометре Bruker WM-400 и Bruker AV-600 при комнатной температуре с использованием ячейки памяти 16К и 256 циклов накоплений для каждого эксперимента. Образцы готовили инкубацией мет-Mb кашалота и лошади в НгО в течение 12 часов при 4С в 10 мМ ацетатном буфере, рН 5.2 или 10 мМ трис-HCl буфере, рН 7.1-7.5. При рН 7.1-7.5 в измерительную ампулу с 500 мкл раствора белка с концентрацией 6 мг/мл (0.3 мМ) добавляли 5 мкл исходного концентрированного раствора Cu(Gly)2 таким образом, чтобы концентрация комплекса составила 0.1 мМ (30% по отношению к белку). При рН 5.2 удавалось добавить Cu(Gly)2 только до концентрации комплекса 8% по отношению к белку (0.024 мМ), так как при 0.1 мМ концентрации комплекса наблюдалось неспецифическое уширение всего спектра ЯМР из-за аггрегации белка.
Расчет распределения электростатического потенциала (ЭП) вокруг молекулы Mb на разных расстояниях от поверхности белка при совместном учете геометрической формы белковой молекулы и ионного состава растворителя выполняли с помощью разработаноЙ оригинальной программы [Sivozhelezov V.S., 1993; Polozov R.V. и др., 1999]. Время расчета ЭП с помощью этой программы на IBM-совместимом компьютере с рабочей частотой 1300 МГц составляет около 3 мин. Координаты атомов Mb кашалота взяты из Protein Data Bank. Для мутантного Mb(Hisl 19 Asp) кашалота использованы те же координаты, но с помощью программы Swiss PDB Viewer 3,7Ь2 [Guex N., 1999] произведена замена His И 9 на Asp с подбором наиболее энергетически выгодного ротамера, В соответствии со значениями рК ионизации функциональных групп миоглобнна кашалота [Bashford и др., 1993] атомам азота остатков Lys и Vail (N-конец) в интервале рН 5-8 присваивали заряд +1, а атомам азота Arg -по +0.5; атомам кислорода Glu, Asp и СОО"-группам гема присваивали заряд по -0.5, a Fe гема присваивали заряд +1 либо 0 в зависимости от валентного ферри/ферро-состояния. Так как рК ионизации доступных растворителю гистидинов в среднем равен 6, их заряд варьировали от 0 (при рН 7.5) до +1 (при рН 5). Визуальные изображения распределения электростатического потенциала в различных участках миоглобнна при рН 5 и 7.5 на расстоянии 5.5 А от поверхности белка совместно с пространственной структурой этих участков получены с помощью программы MOLMOL [Koradi R. и др., 1996].
Расчеты впадин и полостей в Mb кашалота проводили с помощью программы CastP [Liang J. и др., 1998]. Для моделирования ситуации в растворе его структура была оптимизирована методами молекулярной механики (HyperChem). Все расчеты распределения электростатического потенциала, а также впадин и полостей в молекуле миоглобнна были проведены Е.В. Гораевым (лаб. структуры и функции редокс-белков, ИБК РАН).
Окисление оксимиоглобина, катализируемое ферроцианидом: нативные оксимиоглобины кашалота, лошади и свиньи, карбоксиметилированный по остаткам гистидина и мутантный (Hisl 19-»Asp) оксимиоглобины кашалота
До последнего времени было известно только окисление дыхательных белков МЬОг (а также НЬОг и ЬЬОг), которое катализируется соединениями двухвалентной меди со средним редокс-потенциалом и протекает по сайт-специфическому механизму (медный катализ). Соединения других металлов, как со средними, так и тем более с высокими потенциалами, как отмечалось выше, не способны быть катализаторами и окисляют эти белки через взаимодействие с гемом по простому внешнесферному механизму (См. Лит. обзор, стр. 35,36). Однако нами недавно было обнаружено, что эффективным катализатором процесса окисления МЬОг кашалота является ферри цианид калия [Моисеева С. А. и др., 2000, 2001, б]. Помимо того, что это комплекс железа, это еще и сильный окислитель, тогда как считалось, что эффективно ускорять окисление МЬОг (и НЪОг) могут только соединения металла с невысоким, как у меди, редокс-потенциалом (Е0 порядка 100-150 mV). Сильные же окислители, которые реагируют непосредственно с гемовой группой по простому внешнесферному механизму переноса электрона, не могут быть эффективными катализаторами, так как восстановленные формы этих соединений по термодинамическим соображениям должны плохо окисляться кислородом.
При малых концентрациях феррицианида (5- 20% от концентрации белка) одновременно имеют место два разных процесса: быстрое окисление соответствующего количества МЬОг феррицианидом путем взаимодействия [Fe(CN)6] " с гемом по простому внешнесферному механизму и более медленное превращение остального МЬОг в мет-МЪ по каталитическому пути. Показано, что причиной катализа является специфическое связывание с белком аниона [Fe(CN)s]4 , который образуется в первом процессе. Комплексирование ферроцианида имеет место в районе Hisll9(GHl) на расстоянии около 0.2 нм от гема с последующим переносом электрона от атома Fe гема (сайт-специфический внешиесферный механизм). В этом участке поверхности Mb кашалота локализованы также остатки Hisl2(A10), Hisll3(G14) и Hisl 16(G17), протонирование которых должно облегчать связывание аниона [Fe(CN)6]4" за счет создания более высокого локального положительного потенциала. Только связанный с миоглобином [Fe(CN)6]4 в отличие от того же аниона в растворе приобретает способность быстро реокисляться кислородом (реакция идет с участием протонов), что необходимо для замыкания каталитического цикла.
В продолжение исследования физического механизма этой реакции в данной работе проведено сравнительное изучение кинетики катализируемого ферроцианидом окисления МЬОг лошади и свиньи, которые гомологичны по пространственной структуре Mb кашалота, имеют одинаковые с ним редокс-потенциалы, но отличаются по количеству локализованных на поверхности остатков гистидина и по суммарному заряду молекулы белка, а также химически модифицированного миоглобина кашалота, в котором все доступные остатки гистидина алкилированы бромацетатом натрия (СМ-МЬСЬ), и мутантного белка с заменой Hisll9 на аспарапшовую кислоту, MbOi(Hisl I9-»Asp). Исследовано влияние на скорость реакции рН среды в интервале рН 5 - 8, ионной силы от 0 до 0.1, концентрации катализатора и комплексирования миоглобинов с редокс-неактивным ионом цинка. Проанализированы распределения электростатического потенциала вокруг исследованных Mb в сайте связывания [Fe(CN)e]4 , а также стерические особенности поверхности белка на наличие полостей и впадин, способных включить анион такого размера.
Сравнительная характеристика исследованных миоглобинов По сравнению с Mb кашалота в Mb лошади отсутствует доступный растворителю остаток HisI2(A10), который замещен на Gin, а в Mb свиньи три остатка, Hisl2(A10), Hisll3(G14) и Hisll6(G17), также замещены на Gin. Во всех трех белках аминокислотные остатки, образующие гемовую полость, строго инвариантны. Помимо гистидинов, в Mb лошади и свиньи по сравнению с Mb кашалота имеются аминокислотные замены еще в 19 позициях [Rousseaux и др., 1976; Carver и Bradbury, 1984], однако все замены строго одинаковы или гомологичны по характеру, кроме замены положительно заряженного Lys87(F2) в Mb кашалота и лошади на неполярный Thr87 в Mb свиньи далеко от места связывания катализатора. В отличие от Mb кашалота (pi 8.3), который в исследуемом интервале рН все время заряжен положительно, общий заряд Mb лошади (pi 7.4) и Mb свиньи (pi 7.2) изменяется от положительного до отрицательного.
Свойства модифицированного по доступным гистидинам CM-Mb (pi 5.2) подробно описаны выше (Стр. 45). Его основное отличие от интактного белка состоит в изменении как общего заряда молекулы, так и локального зарядового состояния отдельных ее участков в связи с увеличением анионного характера белка при карбоксилировании поверхностных гистидинов. Сохранение основных физико-химических параметров СМ-Mb свидетельствует о том, что модификация не влияет на конформацию гемовой полости и миоглобиновой молекулы в целом.
Как можно было ожидать, одиночная замена Hisl 19 на Asp в мутантном Mb кашалота также не изменяет структуры гемовой полости и общей конформации молекулы. Как видно из Табл. 4.3, отличия в спектрах поглощения нативного и мутантного белков в УФ и видимой области, значениях рК мет-гидрокси-перехода и стабильности в интервале рН б - 12.5 находятся в пределах аппаратной погрешности. Несущественно меняется и общий заряд молекулы белка (по данным изофокусирования в полиакриламидном геле значение pi мутантного мет-МЬ равно 8.2).
Увеличение ионной силы в интервале от 0 до 0.55 сильно ингибирует окисление МЬОг кашалота и лошади, катализируемое [Fe(CN)6]4\ особенно в интервале I от 0 до 0.1 (Рис.4.14, кривые 1 и 2), указывая на важную роль электростатических взаимодействий в механизме реакции. При высокой ионной силе, I 0.1, скорость реакции в присутствии МЬОг кашалота и лошади мала при всех значениях рН в интервале 5-8. Скорость окисления МЬОї свиньи в присутствии 5% ферроцианида очень мала и не зависит от ионной силы (на Рис.4.14, не приведена). Низкая скорость окисления СМ-МЬОг слабо зависит от ионной силы (Рис.4.14, кривая 3). Незначительное увеличение скорости окисления СМ-МЬОг при высоких I может объясняться тем, что в этом случае и реагент, и белок заряжены отрицательно, а экранирование зарядов облегчает их взаимодействие. Скорость окисления мутантного Mb02(Hisl 19—» Asp) в области низких ионных сил, I 0.1, уменьшается с увеличением ионной силы, но зависимость существенно менее выражена, чем в случае нативного белка (Рис.4.14, кривая 4).
