Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Физико-химические свойства флавоноидов и их биологическое действие 9
Глава 2. Структурно-фунщюнальные свойства сократительных белков 18
2.1. Миофибриллы мышечного волокна 18
2.2. Актомиозин. 20
2.3. Миозин 24
Глава 3. Методы исследования и материалы 37
1. Спектральные методы исследования 37
1.1. Флуоресцентный метод 37
1.2. Спектрофотометрія 40
2. Определение АТФазной активности сократительных белков 42
3. Материалы 42
Глава 4. Влияние флавоноидов на стрлстурно-функщональнбее свойства сократительных белков 45
1. Влияние флавоноидов на АТФазную активность акто-миозина и миозина 45
2. Влияние флавоноидов на суперпреципитацию актомио-зина и сокращение миофибрилл 52
3. Спектроскопическое исследование взаимодействия флавоноидов с сократительными белками 60
Глава 5. Спектральше свойства 3-фшжумарша в разных растворителях и при связывании с белками 79
1. Спектральные свойства 3-фурилкумарина в растворителях с разной полярностью 80
2. Исследование взаимодействия 3-фурилкумарина с белками 85
Заключение 102
Выводы 105
Литература 108
- Физико-химические свойства флавоноидов и их биологическое действие
- Определение АТФазной активности сократительных белков
- Влияние флавоноидов на суперпреципитацию актомио-зина и сокращение миофибрилл
- Исследование взаимодействия 3-фурилкумарина с белками
Введение к работе
Актуальность проблемы. Природные флавоноиды, которые впервые інли выделены в начале XIX столетия, обладают широким спектром био-югического действия. В 1936 году Сент-Дьерди обнаружил, что еум-іарная фракция флавоноидов, полученная из корня лимона, обладает Р-китшинной активностью. За последующий период подробно изучено фи-иологическое действие флавоноидов. Они участвуют в процессе биоло-їіческого окисления, регулируют процесс роста, развития и иммуните-а биологических объектов, защищают организм от неблагоприятных ус-:овий и являются энергетическим материалом растений.(Мартин, 1957; амородова-Бианки, 1965; Запрометов, 1970S McClure ,1975). многие лавоноиды проявляют фармакологическое действие. Они понижают про-ицаемость капилляров и тонус гладкой мускулатуры, расширяют сосу-ы, благоприятно влияют на сократительную функцию миокарда, способ-ы замедлять ритм сердечных сокращении и увеличивать их амплитуду, меньшают содержание липидов при атеросклерозе (Бейер, 1957; Лисе-ицкая, 1976; Беликов, Точкова, 1973; Родионов, Морозова, 1973;Мс-,luve,I975). Углубленное изучение биологических и фармакологических войств флавоноидов создает определенные предпосылки для их клини-эского использования. Флавоноиды часто применяют в качестве капил-троукрепляющих, сердечных, противоопухолевых, желчегонных средств, ія профилактики и лечения многих заболеваний ( Минаева, 1978; Му-звьева, 1981).
Однако механизм действия флавоноидных соединений на клеточные юцессы еще изучен недостаточно. В последнее время изучено взаимо-зйствиедвух природных флавоноидов - кверцетина и рутина - с белко-вли молекулами и мембранными структурами. Показано, что флавоноиды 5разуют комплексы с белковыми молекулами (Родионов, Журавлева, 1967; дионов, Морозова, 1973), вызывая конформационные изменения белка, юрцетин и рутин ингибируют АНазные системы из разных животных
- 5 -объектов (Lo/n/j , koucM&r , 1974; FWfcreJI , Gcnm^&Ax $ 1977) и тем самым ингибируют биоэнергетические процессы.
Флавоноидные соединения оказывают влияние на деятельность мышечных систем, но механизм этого действия не изучен, Молеку -лярные аспекты мышечного сокращения были заложены в 1939 г. Эн-гельгардтом и Любимовой, установившими, что миозин является АТФ-азой и, следовательно, может быть ключевьті элементом глышцы, где химическая энергия АТФ преобразуется в механическую работу глышцы. В дальнейшем использование данных электронной микроскопии , рентгеноструктурного анализа, биохимических исследований позволило установить структурную организацию сократительного аппарата и участие различных белков в регуляции, сокращении и расслаблении мышечных систем (Бендолл, 1970). Процесс активации и сокращения скелетных мышц включает: возникновение потенциала дей -ствия на сарколемме, распространение его по Т-каналам и индуци-
_ О л.
рование освооождения ионов Са из саркоплазматического ретику-лума, взаимодействие ионов Са + с регуляторной тропин-тропомио-зиновой системой, запускающей скольжение толстых и тонких про -тофибрилл (Huutky Н., Haw-son, 1954; A. , WwU^erke , 1954; Ebo-skj, 1973). Действие флавоноидов возможно на различных этапах сложного процесса - сокращения-расслабления мышц. В настоянеє время установлено, что кверцетин ингибирует АТФазную систему саркоплазматического ретикулума скелетных мышц (sk&sLcwbetcJ, Е980, 1981). Однако до сих пор не изучено действие флавоноидов за АЇФазу миозина и сократительный аппарат мышц.
В настоящее время проводятся интенсивные поиски соединений, способных выступать в качестве флуоресцентных зондов при исследовании структуры и конформационных перестроек белков и мембран ', \*]в)о<гх , Yovi, 1964; S-tryer, 1968; Владимиров, Добрецов 1980;
Rosowslcy d. al, 1982). Большой интерес представляют соединения -аналоги природных биологически активных веществ, обладающие собственной флуоресценцией, чувствительной к изменению условий внешней среды. К ним принадлежат кумарины, обладающие биологической активностью (Кузнецов, 1967) и являющиеся структурными изомерами изофлавоноидов. Они широко представлены среди веществ растительного происхождения и многие из них используются как лекарственные средства. Поэтому применение таких веществ в качестве флуоресцентных зондов позволит получать информацию как о структурных особенностях белков, так и о связывании белков с этими веществами, то есть позволит лучше понять механизм их физиологического действия. Однако, пока не было попыток использовать кумарины в качестве флуоресцентных зондов при исследовании структурных и конформационных перестроек белков.
Цель работы состояла в исследовании влияния флавоноидов на сократительные системы скелетных мышц и в поиске новых кумари -новых соединений, выступающих в качестве флуоресцентных зондов.
Главные задачи:
Исследовать влияние флавоноидов на АТФазную активность миозина, сулерпреципитацию актомиозина и сокращение миофибрилл.
Провести исследование конформацинных перестроек сократительных белков под действием флавоноидов. Выяснить природу взаимодействия флавоноидов с сократительными белками.
Изучить спектральные характеристики изофлавоноидного соединения 3-(5-этоксикарбонил-2-фурил)-4-окси-6-этил-7-метоксикума-рина (3-фурилкумарина) в растворах с разной полярностью и при связывании с белками.
Научная новизна. Впервые подробно изучены изменения АТФазной активности и конформационные перестройки миозина, а также супер-
_ 7 -преципитация актомиозина и сокращение миофибрилл под действием флавоноидов. Обнаружено, что при небольших концентрациях ( до 20 мкмолей) флавоноиды вызывают конформационные изменения миозина, сопровождающиеся активацией ферментативной активности.При больших концентрациях (более 20 мкмолей) флавоноидов наблюдается ингибирование АТФазной активности миозина, суперпреципитации актомиозина и сокращения миофибрилл. Ингибирующее действие флавоноидов наиболее сильно проявляется для миофибрилл. Сделано заключение, что конформационные изменения обусловлены связыванием флавоноидных соединений с регуляторной частью вблизи активного центра головки миозина.
Впервые экспериментально доказано, что 3-фурилкумарин является хорошим флуоресцентным зондом при изучении конформационных перестроек белковых молекул. Установлено, что :его спектры поглощения и флуоресценции существенно изменяются в растворах с разной полярностью и при связывании с белками (сывороточный альбумин, миозин, актомиозин).
Практическое значение работы. Полученные результаты тлеют теоретическое значение для понимания молекулярных механизмов взаимодействия флавоноидных соединений с белковыми структурами, а также определенное практическое значение, поскольку флавоноиды используются в качестве лекарственных средств.
Изученный наїли новый флуоресцентный зонд, 3-фурилкумарин .может использоваться при исследовании конформационных перестроек белковых молекул.
Результаты исследований использованы при чтении спецкурса "Биофизика мышечного сокращения и клеточной подвижности" на кафедре биофизики Киевского государственного университета им. Т.Г. Шевченко.
В диссертации использованы следующие сокращения: АНС - І-шилшюнаюталин-8-еульфонат АТФ - аденозинтрифосфат ДІНБ - датиобис-2-нитробензойная кислота ПМБ - пара-хлормеркурий-бензоат ЛШ - легкий меромиозин ИМ - тяжелый меромиозин С-І - субфрагмент-1 С-2 - субфрагмент-2 Трис - трисгидроксилметилашшометан М - молекулярная масса Фн - фосфор неорганически! С - концентрация СИЛ - суперпреципитация Ц - оптическая плотность I - интенсивность флуоресценции t - время
v- скорость АНазной реакции /V- длина волны У>- квантовый выход флуоресценции
Физико-химические свойства флавоноидов и их биологическое действие
Изучение флавоноидов относится к началу XIX столетия, когда Шевроле в 1814 году выделил из коры я%5 zfcrveztbuTa кристаллическое вещество, названное кверцетином. В 1842 Вайс сообщил о выделении рутина из fliztev &г ,іге & л. ,. Интерес к флавоноидам особенно возрос, когда в 1936 году Сент-Дьерди обнаружил, что функция флавоноидов, полученных из корней лимона, обладает Р-витаминной активностью. В течение последних 15 лет природные флавоноиды привлекают возрастающее внимание исследователей в связи с их важной ролью в организмах растений, животных и человека. Физико-химические свойства флавоноидов. Флавоноиды представляют собой кислородсодержащие гетероциклические соединения, в основе которых лежит дифенилпропановый углеродный скелет Cg-C3-Cg . Большинство этих веществ относится к фенилпроизводным бензо- "f -пирона (флавон), в кольцах которого различные водородные атомы замещены на фенольные гидроксильные группы. В природных флавоноидах это замещение чаще всего происходит в положениях 3, 5, 3 , 4 (Бей-ер, 1957): Когда атом водорода замещается на гидроксильную группу в по- южении 3 пиронового кольца, флавон называется флавонолом. Если в доходном флавоне двойная связь у этого положения насыщается водо- юдными атомами, то он превращается в флаванон. Энергичное восста-ювление карбонила пиронового кольца приводит к образованию анто -даанина, а послудеющее насыщение водородом этого кольца дает кате-:ин. Кроме этих, существуют и другие флавоноидные соединения.
Под агликоновыми формами флавоноидов понимают флавоноиды, не зодержащие сахарных остатков, тогда как термин "гликозид" применя-от в тех случаях, когда в молекуле присоединен остаток сахара.Наи-5олее часто флавоноиды встречаются в виде гликозидов. В качестве углеводной части могут быть моно-, ди-, три-сахариды (Муравьева, Е98І). Моносахаридами являются сахара: 0 -глюкоза, р-галактоза, L -рамноза и L-арабиноза. Известно не менее десяти дисахаридов з флавоноидных гликозидах. Рассмотрим структурные особенности кверцетина и рутина, которые использовались в диссертационной работе. Кверцетин (3.5.7.3. 4-пента оксифлавон, CJ H-J-QOIJ, 3 0, М = 342,29) представляет собой яимонно-желтые иглоподобные кристаллы. Кверцетин плохо растворя-зтся в воде, но хорошо растворяется в этаноле, уксусной кислоте и целочных средах. Т = 316 - 317С. Рутин (3-рамно-глюкозид кверцетина, С24Н30016 3 Н20, М = 632,55, Тш = 180 - 190С) представляет собой светло-желтые иглоподобные кристаллы. Растворяется лучне, чем кверцетин (Калинин и др., 1971). Спектры поглощения большинства флавоноидов состоят из двух полос: первая полоса - в диапозоне от 300 до 400 нм, вторая полоса -от 240 до 285 нм. Происхождение первой полосы связано с кольцом Б, второй полосы - с кольцом A (Svein , I965;Grottl]eb , 1975; Mavkhoyu, Mabry, 1975). Полосы поглощения флавонолов расположены в диапазоне 328-385 нм и 240-280 нм, соответственно.
В флавоноидных соединениях при ионизации фенольной оксигруппы и образовании хелатного комплекса с металлами сильно изменяется их спектральные свойства. Проведено широкое исследование по установлению констант ионизации и протонизацйи на модельных флавоноидных сое-циенениях. Установлено, что по силе кислотности фенольных оксигрупп спектры поглощения флавоноидных соединений размещаются в следующем порядке: 7-0Н 4 -ОН 3-ОН 5-ОН (Литвиненко и др. 1976). Фенольные сидроксильные группы ионизируются при рН больше 9 ( $лл/аД я. , 1965). В процессе комплексообразования флавоноидов с сахарами наблюдаются здвиги положения максимума поглощения и уменьшение оптической плот-зости (Кочет, 1974). При комплексообразовании флавоноидов с белковыми молекулами гакже обнаруживается изменение спектров поглощения этих соединений. Збнаружено смещение спектра поглощения кверцетина при его связыва-ши с сывороточным альбумином человека (Родионов, 1979). Кверцетин значительно снижает интенсивность флуоресценции комплекса АНС с белками, образуя комплекс с белковыми молекулами- (Салгіїеу, Hcamne$,»976). Биологическое действие флавоноидов. Флавоноиды обладают широким спектром биологического действия и имеют фармакологическое зна-іение. Флавоноиды обладают Р-витаминной активностью, они являются штиоксидантами и антибиотиками, а также регуляторами роста и раз-зития растений (Мартин, 1957; Запреметов, 1970; McClure ,1975). В литературе имеется значительное количество работ, посвящен- ных изучению Р-витаминной активности флавоноидов (Бейер, 1957; Тау-сие и др., 1961; Минаева, 1978). Впервые Р-витаминные свойства фла-воноидов обнаружил в 1936 году Сент-Дьерди. Основной эффект витамина Р заключатеся в уменьшении проницаемости и ломкости капилля -ров и увеличении их прочности. При недостатке этого витамина наб -людается снижение резистентности капилляров. Витамин Р, усиливая действие аскорбиновой кислоты, вместе с ней участвует в окислительно-восстановительных процессах организма. Анализируя многие данные по Р-витаминным свойствам, сделано заключение, что флавоноиды, тлеющие ОН-группы в положениях з и4 оказывают полезное физиологическое действие на капилляры ( McCluve. , 1975). Кверцетин расширяет сосуды, понижает тонус гладкой мускулатуры и благоприятно влияет на сократительную функцию миокарда (Родионов, Морозова, 1973).
Определение АТФазной активности сократительных белков
Для вы деления миофибрилл из скелетных мышц были использованы методики, описанные в литературе (Ве-псЫ! » 1961; Ko-min? » 1970). Мышцы очищали от жировой и соединительной ткани, охлавдали и пропуска ли дважды через мясорубку. Фарш заливали десятикратным объемом раствора 0,05 М Трис-НСІ, 0,048 М КСІ, рН 7,5. Полученную мышеч ную кашицу гомогенизировали в течение 5 мин и далее фильтровали через один слой марли. Центрифугировали при 400 о 5 мин..Затем супернатант центрифугировали при 2000 g в течение 40 мин. Оса док, содержащий миофибриллы ресуспендировали в том же буфере и опять центрифугировали 30 мин при 2000 д. Повторяли эту опера цию два раза. б. Миозин, актоміозин и другие белки. В работе использо - вата препараты миозина и акгомиозина скелетных мышц кролика,вы деленные и очищенные В.М.Даниловой и сотрудниками в отделе био физики Института физиологии Киевского государственного универ- ситета. В работе использовался коммерческий препарат сывороточного альбумина человека (САЧ) (фирма "ВелпдЛ ", Венгрия). в.
Приготовление растворов фдавоноидов и фурилкумаринов. В работе использованы кверцетин и рутин производства "Реахим"(СССР). Кверцетин и рутин растворяли в 96 % этиловом спирте и вносили в реакционную смесь в таких количествах, чтобы концентрация спирта в кювете не превышала 3 %. На рис. 4 приведены структурные формулы кверцетина и рутина. В работе использовали фурилкумарины ( 3-(5-этокси-карбонил-2-фурил)-4-окси-6-эт1ш-7-метокоикумарин и 3-(5-этоксикарбонил-2-фурил)-4-ацетокси-6-этил-7члетоксикумарин) (рис.4), синтезиро -ванные на кафедре органической хиглии Киевского госуниверситета. Фурилкумарины растворяли так же в 96 % этиловом спирте. В экспериментах использовали: кТФ ( фирма " Keanal ", Венгрия), АНС (фирма " Сигма ", США), Трис ( фирма "ReanaX", Венгрия), Рабочие и буферные растворы готовились с использованием реактивов квшшфикации ЧДА и ХЧ, выпускаемых заводами "БИАП" и "РЕАХИМ".
Все растворы готовились на дистилляте. В настоящее время проявляется интерес к фенольним соединениям, в том числе к флавоноидам, которые способны взаимодействовать с белковыми молекулами и влиять на их функциональные характеристики. Биофлавоноиды, кверцетин и рутин, ингибируїот АТФ-азные системы мембран из различных источников - растительных и животных организмов (LCLU , Rocker, 1974; Fevufcrell ,Q-mpe».ts , 1977; SKoskan, McLennoRt 1981). Однако, пока нет данных о влиянии флавоноидов на АТФазную систему сократительного аішара.та мышц. В данной главе рассмотрены исследования по изучению влияния кверцетина и рутина на структурно-функциональные свойства сократительных белков скелетных мышц,
Влияние флавоноидов на суперпреципитацию актомио-зина и сокращение миофибрилл
В диссертационной работе изучено влияние флавоноидов на функциональные характеристики модельных сократительных систем -актомиозин и шофибриллы. Процесс сокращения происходит при физиологической ионной силе, примерно 0,1. В связи с этим модельные исследования на актомиозине и миофибриллах проводились в буферных растворах с 0,1 М КСІ. При добавлении в раствор акто -миозина АТФ и двухвалентных ионов происходит суперпреципитация актомиозина, сопровождающаяся возрастанием оптической плотности раствора. Суперпреципитация - это процесс межмолекулярных взаимодействий миозина с актином с быстрым образованием плотных агрегатов. Ряд авторов предполагает (Ebccski» 1963; Кофман, 1978), что суперпреципитация актомиозина, сопровождаемая гидролизом АТФ, является упрощенной моделью мышечного сокращения. На рис. 9 представлено изменение во времени оптической плотности при сулерпреципитации актомиозина скелетных мышц в отсутствие кверцетина и при добавке различных концентраций этого фла-воноида. Из кинетических кривых суперпреципитации отпределяется две важные характеристики - степень суперпреципитации актомио зина, Д Д = Дод - Д0 и скорость суперпреципитации, Д Д/д-fc , где Д Д - изменение оптической плотности, Д - конечная опти -ческая плотность, регистрируемая на плато кривой суперпреципитации, Д0 - оптическая плотность раствора актоглиозина перед добавлением ЛТФ и ддухъялентных ионов, Д-fc - іштервал времени между началом супертфеципитадии и достижением Дм. Как видно из рисунка,- в отсутствии кверцетина актошозин скелетных мышц характеризуется высокой степенью суперпреципитапии и большой скоростью суперпреципитации (наклон д Д/ді: составляет примерно 0,15 ед.оптич. плотности за I мин). Добавление кверцетина ингибирует суперпреципитацию актоглиозина. С увеличением концентрации кверцетина наблюдается уменьшение степени и скорости супер-преципитации актоглиозина (рис. 9). Рутин также ингибирует суперпреципитацию актоглиозина (рис. 10), но его действие более слабое по сравнению с кверцетином. На рис. II показано влияние кверцетина и рутина на степень суперпреципитации актомиозина скелетных мюпц (за 100 t принята степень суперпреципитации актоглиозина в отсутствие кверцетина и рутина). Введение в раствор актоглиозина небольших концентраций кверцетина (до 10 мкМ) вызывает небольшое уменьшение степени суперпреципитации актоглиозина. В интервале концентраций от 10 до 50 мкМ кверцетин вызывает значительное ингибиторное действие на суперпреципитацию актоглиозина. При введении в раствор 50 мкМ кверцетина степень суперпреципитации уменьшается больше чем в 4 раза и составляет всего 23 процента. Дальнейшее увеличение концентрации кверцетина незначительно уменьшает степень суперпреципитации актоглиозина,- при 100 мкМ кверцетина степень суперпреципитации составляет 16 %.
Небольшие концентрации рутина (до 10 мкМ) оказывают активирующее влияние на суперпреципитацию и АТФазную активность актомиозина. Рутин, при концентрациях больше 10 мм, вызывает незначительное ингибиторное действие на суперпреципитацию актомио-зина (рис. II). При добавлении в раствор 100 мкМ рутина происходит уменьшение степени суперпреципитации на 20 %.
Мы изучили влияние флавоноидов на сокращение миофибрилл. Миофибриллы являются более сложной сократительной модельной системой по сравнению с актоміозином, так как в миофибриллах акти-но:?ые и миозиновые филаменты находятся в наиболее естественном состоянии, приближающемся к интактным мышцам (Бендолл, 1970). Степень сокращения миофибрилл легко регистрировать по измене -нию оптической плотности суспензии миофибрилл после добавления АТФ и двухвалентных ионов. На рис. 12 и 13 приведены кривые изменения во времени оптической плотности суспензии миофибрилл. В отсутствии флавоноидов дооавление АТФ и ионов Мд и Са вызывает уменьшение оптической плотности суспензии миофибрилл примерно за 2 мин, а затем оптическая плотность остается на постоянном уровне. Уменьшение оптической плотности указьюает на уменьшение размеров рассеивающих частиц и, таким образом, позволяет качественно оценивать степень сокращения миофибрилл. Мы не наблюдали активирующего действия небольших концентраций (до 10 мкМ) флавоноидов на сокращение миофибрилл. С увеличением концентрации кверцетина и рутина степень сокращения миофибрилл уменьшается. Кверцетин по сравнению с рутином более эффективно ингибирует сокращение миофибрилл.
Исследование взаимодействия 3-фурилкумарина с белками
Нами изучено взаимодействие 3-фурилкумарина с миозином и сывороточным альбумином человека (САЧ). При взаимодействии раствора миозина скелетных мышц (Явозб = 296 нм) наблюдается спектр ультрафиолетовой флуо- ресценции миозина с максимумом 335 нм (рис. 25). Ультрафиолетовая флуоресценция обусловлена триптофановыми остатками миозина. Возбуждение при этой же длине волны растворенного в буфере 3-фурилкумарина (10-) вызывает спектр флуоресценции 3-фурилкумарина с максимумом 440 нм. После добавления 3-фурилкумарина в раствор миозина наблвдается два спектра - спектр ультрафиолетовой флуоресценции миозина и спектр флуоресценции 3-фурилкумарина. В растворе миозина интен -сивность флуоресценции 3-фурилкумарина увеличивается в 2,4 раза, максимум спектра флуоресценции 3-фурилкумарина смещается в коротковолновую область и имеет положение 431 юл. Увеличение интенсивности флуоресценции 3-фурилкумарина и смещение спектра флуоресценции на 9 нм в коротковолновую область свидетельствуют о том, что при связывании 3-фурилкумарина с миозином флуоресцентный зонд адсорбируется гидрофобным участком молекулы миозина. Учитывая не -которое структурное сходство 3-фурилкумарина с флавоноид-ными соединениями (рис. 4), можно предполагать, что подобно флавоноидам 3-фурилкумарин связывается на головке мо -лекулы миозина вблизи активного центра. Связывание 3-фурилкумарина миозином вызывает изменения спектра собственной флуоресценции миозина: интенсив -ность флуоресценции уменьшается на 60 %, максимум спектра ультрафиолетовой флуоресценции смещается в коротковолно -вую область на 2 нм. Уменьшение интенсивности флуоресценции не связано с эффектом экранирования света 3-фурилку -марином, так как для используемой концентрации 3-фурилку- марина поглощение было меньше 0,1. Наблюдаемые изменения в спектре флуоресценции шюзина объясняются переносом энергии электронного возбуждения от триптофановых остатков на связанный 3-фурилкумарин. Мы определили эффективность передачи энергии возбуждения (Е) от триптофановых остатков на связанный 3-фурилкумарин по формуле (Скемл , 1969) : где 296 й 365 квантовыи выход флуоресценции связанного 3-фурилкумарина при возбуждении 296 и 365 нм, соот - ветственно, Д - Д - оптическая плотность 3-фурил - 296 и 365 б кумарина на 296 и 365 нм, соответственно, Д - оптичес- 296 кая плотность миозина на 296 нм. Мы нашли для комплекса миозин-3-фурилкумарин Е = 11,1 %, В растворе САЧ интенсивность флуоресценции 3-фурилкумарина увеличивается в 4,8 раза; максимум спектра флуоресценции смещается в коротковолновую область на 14 нм и имеет положение 426 нм (рис. 26).
Связывание 3- фурилкумарина САЧ вызывает значительно большее по сравнению с миозином изменение спектра собственной флуоресценции САЧ: интенсивность флуоресценіщи уменьшается в 2,7 раза, максимум спектра ультрафиолетовой флуоресценции смещается в коротковолновую область на 4 нм. Мы оценили эффективность передачи энергий возбувдения для комплекса САЧ-3-фурилкумарин: Е= 24,4 %, Таким образом, значительное возрастание флуоресценции 3 фурилкумарина при связывании с САЧ обусловлено болыдой гидрофобностью микроокружения зонда в центрах связывания на белковой молекуле и передачей энергии возбуждения от единственного триптофанила САЧ на связанный 3-фурил-кумарин. Для определения параметров связывания (константы связывания и количество центров связывания) 3-фурилкумарина с миозином и САЧ мы использовали теорию Клотца ( IClo - » 1947). Простая реакция взаимодействия белка Р с лигандом Z запишется, как: где Р - концентрация свободного белка, [_ - концентрация свободного лиганда, Р - концентрация комплекса, П -количество тождественных, не взаимодействующих между собой центров связывания. Уравнение Клотца имеет следующий вид: где X - доля связанного лиганда, К - константа связывания лиганда. Из реакции ( 5-3 ), согласно формуле Тэнфорда среднее число молекул лиганда $ , связанных с макромолекулой, равно: Так как интенсивность флуоресценции связанного 3-фурилкумарина в несколько раз больше чем свободного зонда, с определенным приближением можно считать, что флуоресценция 3- фурилкумарина равна: где а - постоянная, которая учитывает квантовый выход и интенсивность возбуждающего света. Подставив в формулу ( 5-6) выражение для V и переписав его в обратных величинах, получим
Похожие диссертации на Исследование влияний флавоноидов на структурно-функциональные характеристики сократительных белков
