Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 9
1.1. Регуляторные белки, биологически активные в сверхмалых дозах 9
1.2. Анатомическое и клеточное строение молочной и предстательной желез 16
Молочная железа 16
Структура ВКМ молочной железы 18
Предстательная железа 23
Структура ВКМ предстательной железы в норме и при патологии 26
1.3. Состав и свойства секретов молочной и предстательной желез 26
Молоко 26 Молоко как коллоидная система 38 Транспорт компонентов молока в клетках молочной железы 46 Состав секрета предстательной железы 52
Глава 2. Экспериментальная часть 57
2.1. Используемые реактивы и оборудование 57
2.2. Получение тканевых экстрактов 58
2.3. Высаливание тканевых экстрактов сернокислым аммонием 58
2.4. Получение фракций супернатантов молока, а также препаратов сухого молока и детского питания 59
2.5. Изоэлектрофокусирование фракций супернатантов 59
2.6. Высокоэффективная жидкостная хроматография 59
2.7. Исследование препаратов регуляторных белков с помощью метода кругового дихроизма 60
2.8. Электрофорез белков в полиакриламидном геле 60
2.9. Определение концентрации белка во фракциях регуляторных белков 61
2.10. Определение влияния исследуемых гликопротеинов на вязкоупругие свойства мембран гепатоцитов мыши при кратковременном органном культивировании in vitro 62
2.11. Получение поликлональной кроличьей антисыворотки 63
2.12. Иммуноферментный анализ антител (ELISA) 63
2.13. Роллерное органное культивирование предстательной железы мыши in vitro 64
2.14. Гистологическое исследование органных культур простат мышей после воздействия регуляторных белков, выделенных из предстательных желез быков 64
2.15. Исследование локализации регуляторных белков в тканях иммуногистохимическим методом 65
2.16. Атомно-силовая микроскопия (АСМ) исследуемых РБ 65
2.17. Определение гидродинамического радиуса частиц РБ в водном растворе 66
2.18. Исследование РБ с помощью ядерного магнитного резонанса (ЯМР) 67
Глава 3. Результаты и их обсуждение 68
3.1. Регуляторные белки молока, молочной и предстательной желез крупного рогатого скота: выделение и очистка 68
3.2. Локализация слабокислого РБ молока и слабокислого РБ предстательной железы в тканях молочной и предстательной желез, соответственно 80
3.3. Исследование влияния в СМД кислого и слабокислого регуляторных белков, выделенных из предстательных желез КРС, на состояние предстательных желез мышей в условиях роллерного культивирования in vitro 82
3.4. Исследование РБ с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии 87
3.5. Исследование гидродинамического радиуса частиц РБ в водных растворах 92
3.6. Исследование состояния РБ с помощью атомной силовой микроскопии 97
3.7. Исследование РБ с помощью электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ) 100
3.8. Исследование вторичной структуры пептидных фракций слабокислого РБ
предстательной железы и слабокислого РБ молока с помощью кругового дихроизма 101
3.9. Исследование РБ с помощью ядерного магнитного резонанса 103
Заключение 112
Выводы 113
Список литературы
- Структура ВКМ молочной железы
- Высаливание тканевых экстрактов сернокислым аммонием
- Определение влияния исследуемых гликопротеинов на вязкоупругие свойства мембран гепатоцитов мыши при кратковременном органном культивировании in vitro
- Исследование влияния в СМД кислого и слабокислого регуляторных белков, выделенных из предстательных желез КРС, на состояние предстательных желез мышей в условиях роллерного культивирования in vitro
Введение к работе
Жизнедеятельность высших животных, в частности, млекопитающих, возможна благодаря функционированию в их организмах нескольких систем, а именно: нервной, пищеварительной, дыхательной, кровеносной, выделительной, репродуктивной, иммунной и эндокринной. Слаженная работа этих систем возможна благодаря деятельности особых биологически активных веществ: гормонов, медиаторов, нейротрансмиттеров и др. В большинстве своем данные вещества представляют собой молекулы белковой природы, способные действовать в разных концентрациях, опосредуя межклеточные сигналы, и инициируя внутриклеточные каскады реакций, стимулируя или ингибируя, в конечном итоге, экспрессию определенного гена (ов) (Miller, Cuatrecasas, 1978; Nicola, 1994; Gagnoux-Palacios et al., 2001). Следует отметить, что ряд регуляторных молекул может «передавать» сигнал в клетку, взаимодействуя не только с рецепторами, расположенными на плазматической мембране, но и с молекулами внеклеточного матрикса (ВКМ) (Bissell et al, 1982). В настоящее время одной из наиболее актуальных задач современной биохимии является поиск и изучение новых эндогенных биорегуляторов, а также исследование механизма их биологического действия. В этом аспекте особое значение занимают исследования, касающиеся функционирования желез внешней и внутренней секреции. Ввиду того, что основной функцией этих органов является секреция, то, несомненно, важно изучить состав секретов желез на предмет наличия в них новых биологически активных веществ.
В системе функционирования таких органов, как молочная и предстательная железа, уже многое изучено. Известно множество факторов действующих в молочной железе, гормонов, медиаторов, факторов роста, молекул ВКМ и т.д. Причем их огромное множество и все они разнообразно модулируют важнейшие клеточные процессы (пролиферациию, миграцию, дифференцировку) в различные периоды функционирования молочной железы: эмбриональный, постнатальный, пубертатный периоды, а также во время беременности, лактации, инволюции. Также многое известно относительно предстательной железы, как в норме, так и патологии (Abrahamsson, Lilja. 1990; Chang et al., 1999; Davis etal., 2001).
Молочная железа во время лактации продуцирует молоко. Молоко, являясь секретом молочной железы, имеет очень сложный, до конца не изученный состав. Усиленно исследуются, в основном, питательные, иммуногенные свойства данной уникальной биологической жидкости (Arnold, et. al. 1977; Bastian et al., 2001; Baumrucker, Erondu, 2000).
Однако о наличии биологически активных регуляторных молекул в составе молока известно не так много. При этом до конца не решена проблема усвоения молочных продуктов как младенцами, находящимися на искусственном вскармливании, так и взрослыми, потребляющими переработанное коровье молоко .(Walker, 2004; Oddy, 2002; Hoppu, et al., 2001; Pourpak, 2004).
Возможно, ключ к пониманию данной проблемы необходимо искать, исследуя РБ, входящие в состав молока.
Основной функцией предстательной железы является поддержание определенного репродуктивного статуса организма. Иными словами, предстательная железа необходима для сохранения жизнеспособности сперматозоидов - носителей генетической информации. Определяющую роль играет состав и свойства секрета предстательной железы. Однако состав секрета, с точки зрения наличия в нем регуляторных белковых факторов, полностью не установлен.
Таким образом, представляется целесообразным исследовать влияние регуляторных белков, выделенных из предстательной, молочной желез и молока на функционирование соответствующих тканей как in vivo, так и in vitro.
Данная работа выполнена с помощью разработанного ранее методического подхода, основу которого составляет комплекс методов исследования тканей взрослых млекопитающих, а также методы выделения и очистки белков, участвующих в модулировании клеточных процессов (Ямскова и др., 1977; Ямскова, Резникова, 1991; Ямсков и др., 1999). С помощью этого экспериментального подхода были обнаружены и исследованы низкомолекулярные, гликозилированные белки клеточного микроокружения многих тканей: печени, легкого, сыворотки крови (Ямскова и др., 1977; Ямскова, Резникова, 1979; Ямскова, Резникова, 1984; Буеверова и др., 1985; Ямскова, Резникова, 1991; Ямсков, Ямскова, 1998). Регуляторные белки (РБ) этой группы обладают целым рядом свойств, отличающих их от уже известных биологически активных РБ и белков ВКМ. Было установлено, что идентифицированные гликозилированные белки участвовали в процессах клеточной адгезии, опосредуя, вероятно, контакты клетка-клетка и клетка-ВКМ, воздействуя на белки межклеточного пространства (Ямскова, Туманова, 1994; Ямскова, Туманова, 1996). Эти гликозилированные белки оказались способными вызывать в сверхмалых дозах (СМД) различные биологические эффекты: регулировать биосинтез белка, клеточное деление, миграцию, жизнеспособность клеток (Ямскова, Резникова, 1991; Ямскова, Туманова, 1994; Ямскова, Туманова, 1996; Ямсков, Ямскова, 1998). Исследование биологической активности и физико-химических свойств этих молекул показало, что они обладают высокой устойчивостью к различным воздействиям:
7 изменениям рН, температуры, действию хелатирующих агентов, протеаз, могут образовывать агрегаты, а также присутствовать в водных растворах в СМД в виде наночастиц (Ямскова, Туманова, 1994; Ямскова, Туманова, 1996). Биологическая активность обнаруженных гликопротеинов проявлялась при использовании их в СМД и только в условиях сохранения целостности адгезивных контактных взаимодействий между клетками в тканях (Ямскова и др., 1994).
На основании данных исследования биологической активности и физико-химических свойств идентифицированных РБ была разработана концепция создания фармакологических препаратов нового поколения (Ямсков, Ямскова, 1998). Цель и задачи исследования.
Целью настоящего исследования явилась идентификация новых РБ из предстательной, молочной желез и молока КРС, действующих в СМД, а также изучение их физико-химических и биологических свойств. В отдельные задачи входили:
1) Идентификация биологически активных в СМД РБ в предстательной и. мол очной
железах, а также в молоке КРС.
2) Исследование физико-химических свойств РБ, выделенных из молочной и
предстательной желез, также молока КРС.
Изучение дозовой зависимости биологической активности исследуемых РБ с помощью метода биотестирования, в основе которого лежит мембранотропное действие РБ данной группы на клетки печени млекопитающих.
Разработка новой экспериментальной модели in vitro для исследования специфической биологической активности РБ, выделенного из предстательной железы быка.
Определение локализации исследуемых РБ в тканях предстательной и молочной желез млекопитающих.
Научная новизна работы.
В результате проведения данного исследования в ткани предстательной и молочной
желез, а также в цельном молоке КРС были идентифицированы ранее не известные белки,
R 17
проявляющие биологическое действие в СМД (10" - 10" мг белка/мл). Из тканей желез данные белки были выделены, соответственно, в виде двух фракций - кислых и слабокислых белков, с молекулярной массой менее 10 кДа, вторичная структура которых представлена, в основном, (3-структурами и статистическим клубком. В растворах данные белки образуют наноструктуры с размером частиц от 100-400 нм. По физико-химическим свойствам данные белки сходны с РБ, которые были идентифицированы в других тканях млекопитающих. Для слабокислых РБ, выделенных из предстательной железы и молока,
8 показана их внеклеточная пристеночная локализация в протоках и секретах соответствующих желез.
Для изучения специфической биологической активности идентифицированных кислого и слабокислого РБ предстательной железы быка была разработана новая экспериментальная модель роллерного органного культивирования ткани предстательной железы мыши in vitro, на которой было продемонстрировано стимулирующее действие на выработку секрета.
Практическая значимость.
Слабокислый РБ молока не был обнаружен в таких молочных продуктах, как сухое молоко и «Нутрилон 1», предназначенный для детского питания. Эти данные показывают, что в процессе переработки молока происходит потеря РБ. Учитывая тот факт, что РБ данной группы способны оказывать влияние на ход и направленность важнейших биологических процессов в тканях и организме млекопитающих, можно заключить, что приготовленные молочные продукты питания не содержат этого эффективного биорегулятора. Представляется актуальной постановка вопроса о возможном использовании слабокислого РБ молока в качестве биологически активной добавки при изготовлении молочных продуктов питания для людей разного возраста. На основе кислого РБ предстательной железы быка разработан фармакологический препарат нового поколения, который может быть использован в андрологии для улучшения репродуктивной функции у мужчин в качестве стимулятора образования секрета простаты, который исключительно важен для поддержания жизнеспособности и сохранения функции сперматозоидов.
Структура ВКМ молочной железы
Структура внеклеточного матрикса и межклеточных контактов молочной железы Эпителиальные клетки молочной железы взаимодействуют со специализированным ВКМ, представленным базальной мембраной (БМ) посредством интегринов - основных рецепторов ВКМ (Hynes, 2002). Ламинин (ЛН) является основным компонентом БМ молочной железы, которая, кроме того, содержит коллаген IV-ro типа, нидоген/энтактин и перлекан (Streuli, 1999). Интегрины связывают внеклеточную БМ с внутриклеточным актиновым цитоскелетом и через взаимодействие с сигнальными молекулами инициируют внутриклеточные каскады, контролирующие форму клеток, миграцию, пролиферацию, дифференцировку и выживаемость клеток (Giancotti, Ruoslahti, 1999). В процессе онтогенеза молочная железа, как и некоторые другие органы, например, легкое, почка, слюнная железа, претерпевает изменения, совокупность которых определяется термином ветвящийся морфогенез. Установлено, что ветвящийся морфогенез молочной железы зависит частично от ВКМ, обеспечивающего проведение морфогенетического сигнала, рецепторов ВКМ, таких как интегрины и других рецепторов ВКМ, и ВКМ-разрушающих ферментов, включая матриксные металлопротеиназы (ММП) и их ингибиторы, тканевые ингибиторы металлопротеиназ (Fata et al, 2004). Непосредственный контакт эпителиальных клеток и ВКМ обеспечивается с помощью базально-расположенных интегринов (Alford, Taylor-Papadimitriou, 1996; Weaver et al., 1997) и неинтегриновых рецепторов ВКМ (Elenius, et al., 1990; Barcellos-Hoff, 1992; Belkin, Smalheiser, 1996; Warfield et al., 1997). Ранее было показано, что рЧ-интегрин играет значительную роль в ветвящемся морфогенезе in vivo и прикреплении к субстрату in vitro. In vivo, эндогенный pi-интегрин обнаружен в различных типах клеток, включая колпачковые клетки ТКЗ, миоэпителиальные клетки и эпителиальные клетки протоков (Klinowskaetal., 1999).
Среди неинтегриновых рецепторов молочной железы выделяют Р-1,4-галактозилтрансферазу, которая участвует как во взаимодействиях «клетка-клетка», так и «клетка-ВКМ» посредством узнавания остатков N-ацетиглюкозамина гликозилированных лигандов. Дистрогликан, другой неинтегриновыи рецептор ВКМ, вероятно, играет ключевую роль в передаче морфогенетических сигналов от ЛН в процессе образования протоков (Muschler et al., 2002).; он может также участвовать в передаче сигналов ветвления, как это наблюдается в случае легкого, почки и слюнной железы (Durbeej, Ekblom, 1997). Рецептор дискоидина 1 активизируется различными типами коллагена, экспрессируемым как эпителием, так и миоэпителием (Vogel, 2001). Галектин, представляющий собой лектин, связывающий Р - галактозидазу в тканях млекопитающих, (Wada, Makino, 2001) также участвует в ветвящемся морфогенезе и его лигандами являются адгезивные белки, такие как ЛН, фибронектин, витронектин и N-ацетиглюкозаминовые остатки гликозилированных молекул адгезии (Warfield et al., 1997). ММП представляют собой обширное семейство 2п2+-зависимых протеаз, которые ответственны за модификацию супрамолекулярной структуры ВКМ (Giannelli et al., 1997; Whitelock et al., 1996). ММП синтезируются в виде зимогенов и в зависимости от структуры, члены этого семейства могут быть разделены на восемь групп. Большинство ММП является секретируемыми белками, и шесть из них являются мембраносвязанными (Sternlicht, Werb, 2001). Эксперименты с галардином, экзогенным ингибитором ММП широкого спектра действия, и тканевым ингибитором ММП-1 показывают, что протеазная активность играет решающую роль в удлинении и ветвлении протоков в период полового созревания. ММП-2 экспрессируется в строме молочной железы и облегчает внедрение в жировую прослойку ТКЗ (Wiseman, et al., 2003; Fata, et al., 1999). В период инволюции молочной железы компонент ВКМ нидоген/энтактин, связанный с коллагеном IV типа и ЛН, а также с интегриновыми рецепторами на поверхности клеток, расщепляется под действием плазмина и ММП-3. Предполагается, что разрушение нидогена/энтактина имеет непосредственное отношение к апоптозу эпителия молочной железы (Kirsty, Leif, 2005). Кадгерины опосредуют адгезию "клетка-клетка" и являются членами большого семейства белков кадгеринов. Они являются трансмембранными белками, внеклеточные домены которых участвуют в адгезионных процессах (Barth, et al., 1997). В молочной железе поляризованные эпителиальные клетки, выстилающие протоки и альвеолы, выходящие в просвет железы и контактирующие с внешней средой, экспрессируют Е-кадгерин и другие адгезионные молекулы. Базальными, по отношению к слою эпителиальных клеток, являются миоэпителиальные клетки, которые появляются в результате дифференцировки так называемых «колпачковых» клеток (cap cells) и играют роль в выделении молока и сохранении протокового фенотипа. Миоэпителиальные клетки взаимодействуют с базальной мембраной и экспрессируют Р-кадгерин, но не Е-кадгерин (Daniel, et al., 1995). Е-кадгерин участвует в адгезии клеток эпителия, в то время как Р-кадгерин опосредует адгезионные взаимодействия миоэпителиальных клеток. Различия в экспрессии Е- и Р-кадгеринов клетками молочной железы обеспечивает создание двух отделов в органе: одного, образованного эпителиальными клетками, смотрящими в просвет протоков и другого, представленного миоэпителиальными клетками, обращенными к базальной мембране (Рис. 1.2.1.). Видимо, классические кадгерины не участвуют в соединении эпителиальных клеток с миоэпителиальными клетками, в отличие от другого подсемейства кадгеринов, десмосомальных кадгеринов, которые являются трансмембранными компонентами десмосом. (Pitelka, et al., 1973). Кадгерины взаимодействуют с другими мембранными белками, катенинами (а-, Р-, у- катенины, р120), которые связаны с компонентами цитоскелета. а- и Р-катенины (альтернативно называемые плакоглобинами) связаны непосредственно и опосредованно с актиновым цитоскелетом. Десмоплакины и плакофилины, белки входящие в состав десмосом, соединяют десмосомальные кадгерины с филаментным цитоскелетом (Zhurinsky, et al., 2000).
Десмосома представляет собой ультраструктуру межклеточных контактов, участвующую в адгезии эпителиальных клеток между собой и с миоэпителиальными клетками (Рис. 1.2.1.). Катенин р120, как полагают, регулирует кластерообразование классических кадгеринов в плоскости мембраны и должен, как положительно, так и отрицательно влиять на прочность кадгериновой клеточной адгезии (Cowin, Burke, 1996). Катенин р120 и Р-катенин взаимодействуют с ядерными транскрипционными факторами специфически влияя на экспрессию генов (Behrens, 1999). В итоге, кадгерин-зависимое действие влияет на такие фундаментальные клеточные процессы, как пролиферация, поляризация, дифференцировка, формообразование, и миграция, которые, в свою очередь, определяют протекание эмбриогенеза, тканеобразования и патогенетических событий, например, рака (Knudsen, Wheelock, 2005). Известно, что в период инволюции молочной железы Е-кадгерин подвергается расщеплению за счет действия ММП (Kirsty, Leif, 2005).
Высаливание тканевых экстрактов сернокислым аммонием
Следуя рекомендациям, указанным на упаковке приготавливали, соответственно, из препарата сухого молока - 4,5 л, а из сухой смеси детского питания «Нутрилон 1» - 2 л жидкого продукта.
К молоку, препаратам, приготовленным из сухого молока и детского питания «Нутрилон 1», соответственно, добавляли при перемешивании сухой сернокислый аммоний (780 г сухой соли на 1л исследуемого препарата) до образования насыщенного раствора соли и оставляли на 7 дней при температуре +4С. Белки осаждали центрифугированием при 10000-12000g, собирали фракцию надосадочной жидкости - супернатант, которую использовали для дальнейшего разделения методом изоэлектрофокусирования. Перед проведением изоэлектрофокусирования для удаления соли фракцию супернатанта длительно диализовали против воды и далее концентрировали до объема 200 мл, используя роторный вакуумный испаритель.
Изоэлектрофокусирование фракций супернатантов Фракции супернатантов, полученные из тканевых экстрактов молочной и предстательной желез, а также из цельного молока, препарата сухого молока и детского питания, разделяли, соответственно, с помощью метода изоэлектрофокусирования в градиенте плотности сахарозы на колонке LKB-440 («LKB», Швеция), используя амфолины диапазона рН 3,5 -10,0 (Остерман, 1983).
Изоэлектрофокусирование проводили при 4С в течение 96 час при напряжении 500-2000 В. Белковые фракции собирали по 5 мл. Детекцию белков осуществляли спектрофотометрически при 280 нм и для каждой фракции определяли значение рН. Согласно полученной картине разделения собирали 3 фракции белков соответственно: в интервале значений рН 1,5-1,8 (кислый РБ); в интервале значений рН 4,5-5,6 (слабокислый РБ), в интервале значений рН 8,2-12,3 (основной РБ). Каждую исследуемую фракцию длительно диализовали против воды и концентрировали при 40-45С, используя роторный вакуумный испаритель.
Высокоэффективная жидкостная хроматография Обращенно-фазовую высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ) проводили на жидкостном хроматографе высокого давления Agilent 1100 Series (США), используя колонку Биохиммак С8-200 (4,6 х 150 мм) На колонку наносили 100 мкл исследуемого образца. В качестве элюента применяли смесь 0,1% трифторуксусная кислота - ацетонитрил, которую подавали на колонку в виде градиента ацетонитрила от 0% до 80% со скоростью 0,8 мл/мин при 25С. Детекцию белковых фракций осуществляли при 280 нм.
Исследование препаратоврегуляторных белков с помощью метода кругового дихроизма Спектры кругового дихроизма в УФ-области (195-260 нм) снимали на КД-спектрометре Jasco 720 (Япония) при 20С в кварцевых кюветах с длиной оптического пути 1 мм. Скорость сканирования 50 нм/мин, шаг 1 нм, накопление каждого шага 2 сек. Концентрация исследуемого белка в водном растворе составляла 20 мкг/мл. Итоговый спектр получали по результатам усреднения данных трех сканирований и вычитания спектра базовой линии (контроля). Содержание элементов вторичной структуры оценивали с помощью программ CDNN (http: ioinformatik.biochemtech.uni-halle.de/cdnn) Hk2d.
Электрофорез белков в полиакриламидном геле Электрофорез изучаемых белковых фракций проводили в 15%-ном полиакриламидном геле с 0,1%-ным содержанием Na-додецилсульфата, по методу Лэмли (Laemmli, 1970), используя прибор для вертикального электрофореза BIO-RAD MINI-PROTEAN III («BIO-RAD» США) (толщина геля - 0,75 мм, размер 8 см х 10 см). Белки идентифицировали путем окрашивания красителем Кумасси G-250 (Wilson, 1983). Разделяющий 15%-ный полиакриламидный гель готовили из следующих компонентов: мономерный раствор (30,8% акриламид, 2,7% бис-акриламид) - 7,5 мл, трис буфер (1,5М трис-HCl, рН 8,8) - 3,8 мл, 10%-ный раствор додецилсульфата натрия - 0,15 мл, вода марки Milli Q - 3,6 мл, 10%-ный раствор персульфата аммония - 75,0 мкл, ТЭМЭД (тетраметилэтилендиамин)- 5,0 мкл. Концентрирующий 4%-ный полиакриламидный гель содержал: мономерный раствор - 0,44 мл, раствор буфера (0,5М Трис-HCl, рН 6,8) - 0,83 мл, 10%-ный раствор додецилсульфата натрия - 33,0 мкл, бидистиллированную воду 2,03 мл, 10%-ный раствор персульфата аммония - 16,7 мкл, ТЭМЭД - 1,7 мкл.
Электродный буфер включал в себя: 0,025М трис, 0,192М глицин, 0,1% додецилсульфат натрия, (рН 8,3). В состав 7,5%-ного разделяющего геля толщиной 0,75 входили: вода марки Milli Q (3,6 мл), 10% раствор додецилсульфата натрия (Serva) 0,15 мл, 10%-ный раствор персульфата аммония (Fluka) 75 мкл, ТЕМЭД - 0,5 мкл, мономерный раствор акриламида 7,5 мл и буфер для разделяющего геля (3,8 мл). Концентрирующий 4% полиакриламидный гель содержал: мономерный раствор - 0,44 мл, раствор буфера (0,5 М Трис - НС1, рН 6,8) -0,83 мл, 10%-ный раствор додецилсульфата натрия - 33 мкл, воду марки Milli Q - 2,03 мл, 10%-ный раствор персульфата аммония - 16,7 мкл, ТЕМЕД - 1,7 мкл. Электродный буфер включал в себя: 0,025 М Трис, 0,192 М глицин, 0,1% додецилсульфат натрия, (рН 8,3).
В качестве маркеров молекулярной массы использовали набор белков фирмы «LKB» (кДа): фосфорилаза Ь-94,0; бычий сывороточный альбумин-67,0; овальбумин-45,0; карбоангидраза-30,0; соевый ингибитор трипсина-20,0; лизоцим куриный-14,4. Для окрашивания белков гели помещали на 10-15 мин в фиксирующий раствор, содержащий 25% изопропанола и 10% уксусной кислоты и воду, а затем в водный раствор Кумасси (10%) уксусная кислота, 0,06% Кумасси G-250) до появления окраски. Для снятия фонового окрашивания использовали фиксирующий раствор, содержащий 5% метанола и 7% уксусной кислоты и воду.
Для получения фракции биологически активного регуляторного белка проводили электрофорез в условиях, исключающих его денатурацию (Hames, 1990), с применением 7,5%-ного геля, приготовленного по методике указанной выше, но без добавления додецилсульфата натрия. После электрофореза из геля вырезали фрагменты, соответствующие значениям Rf 0,8-1,0, элюировали водой с добавлением азида натрия. Полученные элюаты объединяли, затем диализовали против воды с добавлением азида натрия при комнатной температуре. В последние порции воды для диализа азид натрия не добавляли. Далее полученный раствор белка концентрировали до небольших объемов с помощью роторного вакуумного испарителя.
Определение влияния исследуемых гликопротеинов на вязкоупругие свойства мембран гепатоцитов мыши при кратковременном органном культивировании in vitro
В данном исследовании биологическая активность, определяемая методом биотестирования, не была обнаружена во всех полученных фракциях основных белков, поэтому эти фракции далее не изучали.
Следует отметить, что на основании результатов, полученных при применении этого метода биотестирования, можно сделать заключение о принадлежности содержащихся в исследуемых фракциях белков к определенной группе РБ, проявляющих биологическую активность в СМД (Ямскова, Резникова, 1991; Ямсков и др. 1999). Данные по биологической активности указывают на присутствие белков данной группы в супернатантах молока, молочной и предстательных желез, но на отсутствие их в препаратах сухого молока и детского питания «Нутрилон 1». Следует отметить, что при исследовании молочной железы и молока, существовала возможность исследовать отдельно фракции РБ железы и ее секрета. В случае предстательной железы это было затруднительно, поэтому совместному исследованию подвергалась как сама железа, так и продукт секреции.
Предположительно, слабокислый РБ, обнаруженный в молоке и предстательной железе представляет собой ранее идентифицированный белок из сыворотки крови. Учитывая данные литературы, указывающие на способность некоторых сывороточных белков проникать из крови в секреты желез (Burgoyne, Duncan, 1998; Kim, et al., 2004) РБ со значением рН 4,5-5,6 из сыворотки крови может поступать в секрет молочной и предстательной желез. Этот аспект особенно важен ввиду того, что ранее была обнаружена активная форма РБ сыворотки крови в первой трети эмбрионального периода, но оставалось не ясной функция данного белка в постнатальном периоде, в течение которого он находится в неактивном, связанном с белком-инактиватором, состоянии (Ямскова, Резникова, 1991). Можно предположить, что подобно другим сывороточным белкам, РБ сыворотки крови способен проникать в молоко, отщепляясь от белка-инактиватора и переходя в биологически активное состояние. Подтверждением этому служит тот факт, что при исследовании фракций нативного молока, которые были получены изоэлектрофокусированием без стадии предварительного высаливания, фракция со значением рН, соответстующим значению рН слабокислого РБ молока (рН 4,5-5,6) проявляла биологическую активность (см. Табл. 3.1.2.). В таком случае, вероятно, что слабокислый РБ в молоке находится в «разблокированном», не связанном с белком-инактиватором состоянии. Кроме того, как свидетельствуют полученные нами данные в тканевом экстракте молочной железы фракция слабокислых белков (рН 4,5-5,6) не проявляла биологической активности в СМД, таким образом, наиболее вероятным источником данной фракции является сыворотка крови (Табл. 3.1.2.). Следует отметить, что РБ сыворотки крови стимулирует пролиферативную активность клеток соединительной ткани млекопитающих (Ямскова, Резникова, 1991). Возникает вопрос, поступает ли данный белок в молоко из сыворотки крови трансцеллюлярным или парацеллюлярным путем (Shennan, 2000) или синтезируется молочной железой во время лактации. Получение ответа на поставленный вопрос является предметом нашего дальнейшего исследования.
Ввиду того, что проблема адекватного искусственного вскармливания на сегодняшний день остается не решенной, многие коллективы исследователей по всему миру пытаются создать максимально сбалансированные смеси для детского питания (Host, Halken, 2004). Основные стремления в этой области направлены на улучшение уже известных смесей путем добавления биологически активных компонентов, таких как, витамины, микроэлементы, полиненасыщенные жирные кислоты, пребиотики (Carver, 2003; Boehm, et al., 2004). Однако основой для смесей все же остаются продукты переработки казеина молока коровы, различные гидролизаты, и аминокислоты. В процессе переработки молока коровы, в частности нагрева до высоких температур, некоторые биологически активные адгезивные факторы просто разрушаются, например, фибронектин (Sato, Hayashi, 1985). Также, можно предположить, что при получении казеина из молока коровы на элементах технологического оборудования могут оседать другие биологически активные факторы. Предпринятая в данном исследовании попытка идентифицировать в сухом молоке и в смеси для детского питания РБ, проявляющие биологическую активность в СМД не увенчалась успехом и показала, что РБ данной группы в исследуемых пищевых продуктах отсутствуют. Возможно, что при проведении технологического процесса, включающего стадии пастеризации, сгущения и сушки, РБ осаждаются на элементах технологического оборудования, вследствие чего не обнаруживаются в конечном продукте. Данный факт особенно важен в свете того, что все существующие смеси детского питания в той или иной степени не удовлетворяют потребности в качественной замене материнского молока для вскармливания младенцев (Walker, 2004; Oddy, 2002; Hoppu, 2001; Pourpak, 2004; Dupont, 2003).
В таблице 3.1.3. представлены основные характеристики получаемых в процессе очистки РБ-содержащих фракций. Следует отметить, что во фракциях супернатантов с помощью применяемого количественного метода не удалось определить концентрацию белка в растворе. Данный экспериментально установленный факт, очевидно, отражает свойство, присущее РБ данной группы, которое связано со способностью РБ присутствовать в растворах в виде ассоциатов. Это свойство было исследовано с помощью методов динамического светорассеяния и атомно-силовой микроскопии, полученные результаты приведены в следующих разделах.
Фракции слабокислого РБ молока и слабокислого РБ предстательной железы изучали далее ввиду того, что ранее обнаруженный биологически активный в СМД сывороточный гликопротеин имеет наряду со значением изоэлектрической точки, лежащей в таком же интервале значений рН, уникальные биологические и физико-химические свойства (Ямсков и др. 2001). Поэтому, представлялось интересным изучить физико-химические свойства белков, содержащихся в слабокислой фракции молока и предстательной железы, соответственно.
Данные белковые фракции были изучены с помощью современных методов биоорганической химии: электрофорез в ПААГ, круговой дихроизм, атомно-силовая микроскопия, ядерный магнитный резонанс, высокоэффективная жидкостная хроматография.
В число осуществленных биологических экспериментов входило определение локализации РБ, выделенных из молока и предстательной железы, в соответствующих тканях, а также исследование специфической биологической активности РБ простаты, проведенное на органных роллерных культурах простат мышей in vitro
Исследование влияния в СМД кислого и слабокислого регуляторных белков, выделенных из предстательных желез КРС, на состояние предстательных желез мышей в условиях роллерного культивирования in vitro
При анализе данных, а именно профиля поверхности после нанесения на скол слюды раствора слабокислого РБ молока можно отметить, что размеры видимых в микроскоп частиц различны и варьируют от 40 до 140 нм. Не имея данных по значениям гидродинамического радиуса частиц исследуемых РБ, можно было бы предположить, что молекулы РБ собираются в наноструктуры после нанесения на подложку. Однако, оценивая данные, полученные динамическим светорассеянием можно сказать, что частицы слабокислого РБ молока присутствуют в виде наноструктур со средним диаметром 100 и более нанометров, именно находясь в растворенной форме. Кроме схожести данных полученных с помощью описанных методов относительно размеров изучаемых РБ, также обращает на себя внимание упорядоченность полученных структур (Рис. 3.6.1.). Вероятно, молекулы изучаемых РБ при нанесении на подложку проявляют тенденцию к образованию организованной «сеточки». Данное свойство может являться предметом отдельного исследования.
На основании данных проведенного исследования, а также, результатов полученных при изучении РБ, выделенных из других тканей, можно предположить, что состав идентифицированных в растворах наночастиц, очевидно, сложный, а именно, кроме РБ в них входят другие вещества, например, углеводы и липиды. Ранее было показано, что фракции РБ, выделенные из различных тканей млекопитающих, содержат в своем составе углеводные компоненты, а именно, олигоманнозидные цепи (Ямсков и др., 2001). Методом биотестирования, применяемого для идентификации РБ данной группы, были исследованы структурно различающиеся олигоманнозидные цепи, которые путем гидролиза были получены из различных гликопротеинов. Данные этого исследования показали, что биологическую активность в СМД проявляли только те олигосахариды, которые содержали терминальные остатки маннозы со связью а(1-2) (Рыбакова, 2005). На основании результатов, полученных при обращенно-фазовой ВЭЖХ, можно высказать предположение о присутствии липидов в обнаруженных наночастицах. Поэтому представляется вероятным, что в наночастицах РБ взаимодействуют с липидами и олигасахаридами определенной структуры.
Исследование РБ с помощью электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ) Для определения значений молекулярной массы исследуемых РБ был проведен электрофорез в ПААГ. Фракции слабокислого РБ молока и слабокислого РБ предстательной железы были изучены методом электрофореза в ПААГ в денатурирующих условиях. Было установлено, что основным компонентом данных фракций являются низкомолекулярные белки со значением «кажущейся» молекулярной массы менее 10 кДа (Рис. 3.7.1., 3.7.2.). Подробное изучение данного спектра и анализ химических сдвигов подтвердил наличие: липидных компонентов (8 1,25; 1,26; 1,69; 2,71 м.д.) аминокислот (8 2,13 м.д. - метионин; 3,34 м.д. - пролин; 3,68 м.д. - глутамин; 3,69 м.д. - лейцин) холина(8 3,21 м.д.) углеводных компонентов (8 3,40 м.д.; 3,48 м.д.; 3,90 м.д. - Р-глюкоза; 3,84 м.д. - а-глюкоза).
Спектр сывороточного РБ более сложен, чем спектры РБ молока и простаты, что указывает, на более сложный как качественный, так и количественный состав сывороточного РБ по сравнению со слабокислыми РБ молока и простаты. Однако необходимо отметить существующую общность всех 3-х белков, заключающуюся в наличии липидных компонентов, определенных аминокислот и углеводных компонентов.
Полученные при изучении физико-химических свойств РБ данные ігуждаются, на наш взгляд, в дополнительном обсуждении. С одной стороны, РБ характеризуется по данным электрофореза, высокой подвижностью в ПААГ, что свидетельствует о низком значении молекулярной массы - приблизительно 1 кДа. С другой стороны, при диализе с использованием мембран с диаметром пор, соответствующих молекулярной массе 8-Ю кДа, не происходит выхода РБ из диализуемого раствора. Кроме того, результаты исследований растворов РБ методами динамического светорассеяния и атомно-силовой микроскопии показали присутствие в растворах РБ наноразмерных частиц, детектируемых при длине волны 280 нм, то есть содержащих белки. По данным обращенно-фазовой ВЭЖХ в изучаемых фракциях РБ присутствуют, соответственно, белки, причем одна фракция обладает выраженными гидрофильными свойствами, другая - гидрофобными свойствами. Логично предположить, что именно эти белки входят в состав наночастиц, обнаруженных в растворах РБ. Преобладание во вторичной структуре РБ Р-структур может являться причиной способности данных белков к образованию межмолекулярных ассоциатов (Ross, Poirier, 2004). Более того, наблюдаемые в растворе РБ наночастицы весьма крупны в сравнении с размерами наночастиц, образуемых другими белками (Armstrong et al., 2004; Cui et al., 2004). Следует отметить, что ранее при исследовании РБ, выделенного из сыворотки крови быка, была также продемонстрирована способность этого низкомолекулярного белка (молекулярная масса менее 15 кДа) образовывать в растворах высокомолекулярные ассоциаты с массой более 200 кДа (Ямскова, Резникова, 1991). Возможно, что именно существованием РБ в виде высокомолекулярных ассоциатов объясняется их резистентность к воздействию различных физико-химических факторов.
Обращает на себя внимание картина разделения растворов РБ методом электрофореза в 15%-ном ПААГ с добавлением додецилсульфата натрия. Известно, что в данных условиях разделение белков преимущественно происходит по значению их молекулярной массы (Laemmli, 1970). Согласно полученным результатам, Rf РБ, выделенных из предстательной железы и молока, соответственно, имеют значения, близкие к 1,0, что свидетельствует о высокой подвижности данных белков в ПААГ. Причины такого аномального поведения РБ при электрофорезе, на наш взгляд, могут быть обусловлены неординарной первичной структурой данных белков. Мы полагаем, что своеобразие физико-химических свойств РБ (как, впрочем, и других представителей изучаемой группы РБ, проявляющих биологическую активность в СМД) можно объяснить уникальными свойствами наночастиц, образуемых их молекулами.
Ранее была предпринята попытка определить первичную структуру РБ, выделенного из сыворотки крови млекопитающих (Ямсков и др., 2001). С помощью масс-спектрометрии был идентифицирован 12-членный фрагмент полипептидной цепи после обработки белка трифторметансульфокислотой, которую применили для дегликозилирования данного РБ. Полную аминокислотную последовательность сывороточного РБ изучить не удалось: данный РБ не перешел в газообразное состояние при применении метода MALDI TOF-масс-спектрометрии (Ямсков и др., 2001). Таким образом, определение первичной структуры полипептидной цепи РБ, образующих в растворах наноразмерные частицы, в состав которых, вероятно, входят также липиды и углеводы, нуждается, на наш взгляд, в разработке нового экспериментального подхода и является предметом отдельного самостоятельного исследования.
В предшествующих работах РБ, выделенные из тканей глаза млекопитающих, сравнивались с определенной группой, так называемых, белков S100 (Краснов и др., 2003). Белки S100 обнаружены в различных тканях млекопитающих, они участвуют в важнейших биологических процессах - клеточной адгезии, миграции, пролиферации, дифференцировке (Donato, 1999). Сравнительный аспект рассмотрения белков S100 и РБ обусловлен, в основном, свойством белков обеих групп оставаться в растворенном состоянии в насыщенном растворе сернокислого аммония. Белки S100 представляют собой низкомолекулярные (молекулярная масса около 25 кДа), термозависимые, Са -связывающие белки, вторичная структура которых характеризуется наличием 40% ос-спиралей (Fano et al., 1995).
