Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР 9
1.1. Состав, функция и физико-химические свойства крови млекопитающих
Общие положения 9
Морфология и функция форменных элементов крови 12
Основные функции крови 14
1.2. Белки сыворотки крови 15
1.3. Биологически активный в сверхмалых дозах регуляторный белок, з2 выделенный из сыворотки крови млекопитающих
1.4. Цитокины 42
1.5. Цитомедины 44
1.6. Белки S100 47
ГЛАВА 2 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 49
2.1. Использованные материалы 49
2.2. Методы, примененные при выполнении работы 50
Получение фракций РБ из сыворотки крови млекопитающих 50
Обработка слабокислого регуляторного белка серным эфиром 51
Определение концентрации регуляторных белков 52
Масс-спектрометрия 52
Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) 53
Электрофорез в полиакриламидном геле 53
Исследование регуляторных белков с помощью ядерного магнитного с г резонанса (ЯМР)
Спектры кругового дихроизма 55
Дифференциальная сканирующая калориметрия 56
Биотестирование фракций белков, полученных в процессе очистки, 57
для определения присутствия регуляторных белков
Определение состояния регуляторных белков в растворах методом 58
АСМ (атомно-силовой микроскопии)
Получение поликлональной антисыворотки 58
Роллерное органное культивирование кожи тритонов Pleurodeles waltl 59
Изучение влияния сывороточного регуляторного белка на ранозаживление в коже у млекопитающих in vivo Изучение белка-инактиватора 61
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 65
3.1. Выделение и очистка регуляторных белков, выделенных изсыворотки крови КРС 55
3.2. Биотестирование фракций регуляторных белков в процессе очистки 68
Исследование мембранотропной активности РБ, выделенных из сыворотки крови млекопитающих
3.3. Исследование физико-химических свойств регуляторных белков, выделенных из сыворотки крови млекопитающих 92
Оценка значения «кажущейся» молекулярной массы регуляторных белков 92
Изучение вторичной структуры РБ с помощью метода кругового дихроизма 95
Изучение растворов РБ с помощью метода атомно-силовой микроскопии
Исследование РБ, выделенных из сыворотки крови млекопитающих, с помощью высокоэффективной э/сидкостной хроматографии Ю5
Исследование состава фракций регуляторных белков с помощью
ядерного магнитного резонанса 108
Изучение липидной компоненты фракции СРБ 110
Исследование КРБ с помощью метода масс-спектрометрии Electrospray
3.4. Изучение локализации в тканях позвоночных животных, а также специфической биологической активности регуляторных белков сыворотки крови 112
Исследование локализации СРБ в печени тритона Pleurodeles waltl 112
Исследование влияния РБ на состояние ткани кожи тритона Pleurodeles waltl при органном культивировании in vitro
Исследование влияния слабокислого регуляторного белка на ранозаживление кожи мыши in vivo
3.5. Исследование белка, инактивирующего мембранотропное действие СРБ 12U
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 131
ВЫВОДЫ 132
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 134
- Состав, функция и физико-химические свойства крови млекопитающих
- Использованные материалы
- Выделение и очистка регуляторных белков, выделенных изсыворотки крови КРС
Введение к работе
Актуальность работы.
Поиск, изучение свойств и возможности использования, новых биологически активных веществ является актуальной проблемой современных биотехнологии и биохимии. В этом аспекте особый интерес вызывают компоненты сыворотки крови, которая содержит широкий спектр различных веществ, проявляющих разнообразные типы биологической активности. Среди таковых следует отметить группу новых эндогенных биорегуляторов (РБ), характеризующихся проявлением биологического действия в сверхмалых дозах (СМД), соответствующих 10" -10"15 мг белка/мл [1]. Данные биорегуляторы оказывают влияние на важнейшие биологические процессы.
Биологически активные в сверхмалых дозах РБ данной группы были обнаружены в различных тканях млекопитающих [2, 3, 4, 5]. РБ стимулируют миграцию и адгезию клеток, влияют на клеточную пролиферацию и дифференцировку, а также апоптоз [6, 4, 7]. РБ данной группы представляют собой низкомолекулярные, устойчивые к воздействию различных физико-химических факторов белки, вторичная структура которых характеризуется значительным содержанием 0-структур [5]. В водных растворах молекулы РБ проявляют тенденцию в образованию наноразмерных ассоциатов [4]. В тканях РБ присутствуют в виде нескольких отличающихся по заряду фракций - наиболее представлены фракции кислых и фракции основных белков [5].
Наиболее изученным представителем данной группы
биорегуляторов является слабокислый биорегулятор, выделенный из
сыворотки крупного рогатого скота [8]. Было показано, что в состав
данного биорегулятора входит низкомолекулярный,
высокогликозилированный белок (остатки маннозы и N-ацетилглюкозамина) со значением рі в области рН 4,5-5,1. В аминокислотном составе РБ превалируют остатки дикарбоновых аминокислот, серина и глицина [4]. В СМД РБ сыворотки крови
оказывал влияние на пролиферацию и миграцию фибробластов in vitro,
проявлял мембранотропное действие в отношении клеток
млекопитающих [9, 10]. Было установлено, что данный РБ сыворотки
крови в постнатальном периоде находится в крови в неактивном
состоянии, в отличие от эмбрионального периода (первые две трети
эмбриогенеза), когда он присутствует в крови в активном состоянии
[4]. На основании данного РБ были разработаны новые
фармакологические препараты, которые в настоящее время применяются в практике медицины: «Адгелон-глазные капли» в офтальмологии; «Адгелон-раствор для инъекций» - ортопедии и травматологии [10, 11].
Однако присутствующие в сыворотке крови в существенно больших количествах кислые и основные РБ данной группы до настоящей работы не изучались.
Цель и задачи исследования.
Целью данной работы явились выделение и очистка кислых и основных регуляторных белков, активных в сверхмалых дозах, из сыворотки крови млекопитающих, изучение их физико-химических свойств и биологической активности. Особое внимание в этой работе было уделено сравнительному исследованию свойств РБ, обнаруженных в сыворотке крови млекопитающих. Для этого предполагалось решить следующие задачи:
Исследовать сыворотку крови крупного рогатого скота (КРС) и лошади для идентификации кислых и основных РБ.
Изучить физико-химические свойства РБ сыворотки крови млекопитающих: провести исследование состава и структуры данных белков, исследовать состояние РБ в водных растворах.
Идентифицировать ингибитор сывороточного РБ и изучить его свойства.
Изучить тканевую локализацию РБ сыворотки крови в печени млекопитающих.
Исследовать специфическую биологическую активность РБ сыворотки крови в СМД.
Научная новизна работы.
В результате проведенной работы впервые в сыворотке крови млекопитающих были идентифицированы и получены в высокоочищенном состоянии новые ранее не изученные кислые и основные РБ, которые проявляли биологическую активность в СМД. Впервые были изучены физико-химические свойства данных белков и показано, что они представляют собой низкомолекулярные белки, вторичная структура которых представлена, в основном, р-структурами и неупорядоченными элементами, описываемыми в терминах статистического клубка. иБыло установлено, что в растворах данные белки образуют наноразмерные частицы диаметром в интервале значений от 60 до 100 нм. По физико-химическим свойствам данные белки сходны с ранее выделенным РБ сыворотки КРС со значением рі в области рН 4,5-5,1. Впервые было показано, что сывороточный белок, обратимо ингибирующий биологическую активность РБ сыворотки, представляет собой белок, в высокой степени гомологичный сывороточному альбумину, и представляет собой его изоформу. Впервые было показано, что в основе обратимой инактивации РБ сыворотки крови лежит взаимодействие с белком-инактиватором, которое осуществляется по механизму белок-углеводного узнавания. Впервые был изучен механизм, лежащий в основе биологического тестирования РБ данной группы, и в том числе, РБ сыворотки крови. Исследование мембранотропной активности ряда моно-, ди- и олигосахаридов показало, что из маннозосодержащих олигосахаридов биологическую активность в СМД проявляли те, терминальные остатки которых были представлены дисахаридом Manal-2Man и дисахаридом Gaipi-4GlcNAc. Мембранотропная активность этих веществ характеризуется полимодалыюй дозовой зависимостью, которая сходна с дозовой зависимостью мембранотропной активности исследуемых РБ. Впервые была установлена межклеточная локализация РБ сыворотки
крови со значением рі в области рН 4,5-5,1 в печени позвоночных животных. Впервые на новых экспериментальных моделях органпого роллсрного культивирования кожи амфибий было продемонстрировано в СМД протекторное свойство изучаемых РБ сыворотки крови млекопитающих, а также ранозаживляющее действие на модели экспериментальной кожной рапы у мышей in vivo.
Практическая значимость.
Регуляторные белки сыворотки крови в СМД оказывали протекторное действие на ткань кожи амфибий in vitro, а СРБ в СМД стимулировал репаративные процессы в коже и способствовал восстановлению её гистоструктуры при экспериментальной травме у мышей in vivo. Можно полагать (учитывая отсутствие видовой специфичности у РБ данной группы), что идентифицированные в данной работе кислые и основные РБ сыворотки крови могут быть использованы в качестве субстанций для разработки новых фармакологических препаратов, аналогично применяемому в настоящее время эффективному лекарственному средству Адгелон, созданному на основе слабокислого регуляторного белка, а СРБ найдет новое важное применение.
Состав, функция и физико-химические свойства крови млекопитающих
Кровь - жидкая ткань, осуществляющая в организме транспорт химических веществ (в том числе кислорода), который обеспечивает протекание биохимических процессов в клетках и межклеточных пространствах различных тканей. Кроме того, кровь выполняет защитную, регуляторную, терморегуляторную и другие функции [12].
Кровь представляет собой коллоидно-полимерный раствор плазмы и взвешенных в ней форменных элементов: эритроцитов, лейкоцитов и тромбоцитов [13]. На долю форменных элементов приходится 40 - 45%, на долю плазмы - 55 - 60% от объема крови [14].
Плотность цельной крови зависит главным образом от содержания в ней эритроцитов, белков и липидов. Цвет крови меняется от алого до тёмно-красного в зависимости от соотношения оксигенированной (алой) и неоксигенированной форм гемоглобина, а также присутствия дериватов гемоглобина - метгемоглобина, карбоксигемоглобина и т. д. Окраска плазмы зависит от присутствия в ней красных и жёлтых пигментов - главным образом каротиноидов и билирубина, большое количество которого при патологии придаёт плазме жёлтый цвет [15].
В состав плазмы крови входят вода (90 - 92%) и сухой остаток (8 - 10%). Сухой остаток состоит из органических и неорганических веществ. К органическим веществам плазмы крови относятся белки, которые составляют 7 - 8%. Белки представлены альбуминами (4,5%), глобулинами (2 - 3,5%) и фибриногеном (0,2 - 0,4%).В плазме крови содержатся также безазотистые органические вещества: глюкоза 4,4 -6,6 ммоль/л, нейтральные жиры, липиды, ферменты, расщепляющие гликоген, жиры и белки, проферменты и ферменты, участвующие в процессах свертывания крови и фибринолиза. Неорганические вещества плазмы крови составляют 0,9 - 1%. К этим веществам относятся в основном катионы Na+, Са2+, К+, Mg2+ и анионы СГ, НР042" , НСОз . Содержание катионов является более жесткой величиной, чем содержание анионов. Ионы обеспечивают нормальную функцию всех клеток организма, в том числе клеток возбудимых тканей, обусловливают осмотическое давление, регулируют рН [13].
В плазме постоянно присутствуют все витамины, микроэлементы, промежуточные продукты метаболизма (молочная и пировиноградная кислоты) [12].
Одним из проявлений микрогетерогенности крови является феномен оседания эритроцитов. Он заключается в том, что в крови вне кровеносного русла (если предотвращено её свёртывание), клетки оседают, оставляя сверху слой плазмы. Скорость оседания эритроцитов (СОЭ) возрастает при различных заболеваниях, в основном воспалительного характера, в связи с изменением белкового состава плазмы. Оседанию эритроцитов предшествует их агрегация с образованием определённых структур типа монетных столбиков. От того, как проходит их формирование, и зависит СОЭ.
Концентрация водородных ионов плазмы выражается в величинах водородного показателя, т.е. отрицательного логарифма активности водородных ионов. Средний рН крови равняется 7,4. Поддержание постоянства этой величины - большое физиологическое значение, поскольку она определяет скорости очень многих химических и физико-химических процессов в организме. В норме рН артериальной крови 7,35-7,47; венозной крови-на 0,02 ниже [13].
Одно из важнейших свойств крови — текучесть, составляет предмет изучения биореологии. В кровеносном русле кровь в норме ведёт себя как не Ньютоновская жидкость, меняющая свою вязкость в зависимости от условий течения. В связи с этим вязкость крови в крупных сосудах и капиллярах существенно различается, а приводимые в литературе данные по вязкости носят условный характер. Закономерности течения крови (реология крови) изучены недостаточно. Неньютоновское поведение крови объясняется большой объёмной концентрацией клеток крови, их асимметрией, присутствием в плазме белков и другими факторами [16]. Измеряемая на капиллярных вискозиметрах (с диаметром капилляра несколько десятых миллиметра) вязкость крови в 4-5 раз выше вязкости воды. При патологии и травмах текучесть крови существенно изменяется вследствие действия определённых факторов свёртывающей системы крови. В основном работа этой системы заключается в ферментативном синтезе линейного полимера - фибрина, образующего сетчатую структуру и придающего крови свойства студня. Этот «студень» имеет вязкость, в сотни и тысячи превышающую вязкость крови в жидком состоянии, проявляет прочностные свойства и высокую адгезивную способность, что позволяет сгустку удерживаться на ране и защищать её от механических повреждений.
Использованные материалы
В работе были использованы следующие вещества: Трис(оксиметил)аминометан, персульфат аммония, Кумасси G-250, Stains-all, тетраметилэтилендиамин (TEMED), питательная среда DMEM, перйодат натрия, динитрофенилгидразин - препараты фирмы Sigma (США). Хлорид натрия, хлорид кальция, перхлорная кислота -препараты фирмы Fluka (Швейцария).
Бромфеноловый синий, 2-Р-меркаптоэтанол, додецилсульфат натрия, азид натрия, акриламид, N N -бис-метилен-акриламид, дитиотреитол - препараты фирмы Serva (Германия). Трифторуксусная кислота, трихлоруксусная кислота - препараты фирмы Merck (Германия).
Глицин, дигидрофосфат натрия, гидрофосфат натрия, ацетат натрия, карбонат натрия, цитрат натрия, тиосульфат натрия, лимонная кислота, соляная кислота, серная кислота, метанол, этанол, формалин, эфир диэтиловый, анизол, оксид фосфора (V), уксусная кислота, диметилсульфоксид, глицерин, глутаровый диальдегид -препараты Реахим (Россия), категория не ниже «чда». Трифторметансульфокислота (хч), Р&М (Россия), Ацетонитрил (чистый для градиентной ВЭЖХ), Криохром (Россия), набор маркеров молекулярной массы фирмы LKB (Швеция) включает в себя: фосфорилаза b (94 кДа), бычий сывороточный альбумин (67 кДа), альбумин куриного яйца (45 кДа), карбоангидраза (30 кДа), соевый ингибитор трипсина (20 кДа), лизоцим куриный (14.4 кДа). Калибровку хроматографической системы для определения молекулярной массы использовали следующие белки-свидетели: овотрансферрин (78 кДа), бычий сывороточный альбумин (67 кДа), альбумин куриного яйца (45 кДа), карбоангидраза (30 кДа), соевый ингибитор трипсина (20 кДа), миоглобин (17.2 кДа), лизоцим куриный (14.3 кДа) - препараты фирмы Serva (Германия) и Sigma (США).
Мембранные фильтры типа "СА" - Nalgene, США с размером пор 0,2 мкм. Мембранные фильтры «Durapore» - Millipore, США с диаметром пор 0,45 мкм;
В работе использовали сыворотку крови крупного рогатого скота (15 л) - стерильный, инактивированный коммерческий препарат, используемый в качестве добавки в ростовую среду клеточных культур, производства завода биопрепаратов Московского мясокомбината.
Сыворотка лошади была получена от здоровых лошадей в питомнике Петрово-Дальнее.
Все химические реактивы, используемые в данном исследовании соответствовали марке "хч". В исследовании использовали только деионизованную воду категории milliQ (15 МОм).
Исследование проводили на мышах-гибридах F1 (самцы, 20-22г), а также на тритонах Plenrodeles waltl, которые содержались, соответственно, в виварии и аквариальной Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН.
Выделение и очистка регуляторных белков, выделенных изсыворотки крови КРС
Регуляторные белки (РБ), биологически активные в СМД, были обнаружены в различных тканях позвоночных животных [2, 3, 8, 211]. В этих работах было установлено, что РБ в тканевых экстрактах присутствуют в виде фракций кислых и основных белков [5, 211].
Ранее в сыворотке крови позвоночных животных была идентифицирована только одна фракция РБ, значение изоэлектрической точки которого находится в области рН 4,5-5,1 [4, 151], поэтому в настоящей работе была предпринята попытка идентификации фракций кислых и основных РБ в сыворотке крови КРС. Для этого сыворотку крови фракционировали по схеме, ранее разработанной для выделения и очистки РБ данной группы [4] (рис 7).
После разделения супернатанта сыворотки крови методом изоэлектрофокусирования (ИЭФ) собирали и далее исследовали следующие три фракции [5], количественные характеристики которых представлены в таблице 2:
1. Фракция, собранная в области значений рН менее 3,0-кислые регуляторные белки (КРБ);
2. Фракция, собранная в интервале значений рН 4,5-5,1-слабокислые регуляторные белки (СРБ);
3. Фракция, собранная в интервале значений рН 8,5 - 10,0 -основные регуляторные белки (ОРБ).
Рис.8. Изоэлектрофокусирование в градиенте концентрации сахарозы в интервале значений рН от 3,5 до 10,5 супернатанта сыворотки крови. По ординате 1 отображены значения рН, соответствующие номерам фракций. По ординате 2 представлены значения оптической плотности соответствующих фракций при длине волны 280 нм; по абсциссе-номера фракций.
Данные три фракции далее были изучены методом биотестирования для идентификации РБ, биологически активных в СМД [4].
Из сыворотки крови лошади аналогично были выделены три фракции РБ: кислый РБ сыворотки лошади (КРБЛ), слабокислый РБ сыворотки лошади (СРБЛ) и основной РБ сыворотки лошади (ОРБЛ).
Данные три фракции были также изучены методом биотестирования. 3.2. Биотестирование фракций регуляторных белков в процессе очистки
Метод биотестирования основан на способности РБ данной группы оказывать влияние на свойства плазматической мембраны клеток млекопитающих (гепатоцитов), а, именно, ее вязко-упругие свойства и проницаемость [3, 4, 149]. Однако механизм биологической активности РБ данной группы остается до сих пор мало изученным, поэтому в настоящем исследовании была предпринята попытка изучить механизм мембранотропного действия РБ с помощью ряда олигосахаридов, различающихся структурно. Следует отметить, что согласно современным представлениям многие лиганды взаимодействуют со своими рецепторами, находящимися на ПМ, по принципу белок -углеводного узнавания [68]. Ранее было показано, что РБ данной группы гликозилированы и содержат остатки маннозы и N-ацетилглюкозамина. На основании полученных данных было предположено, что в состав РБ данной группы входят N-олигоманнозидные цепи [5, 8]. Предполагая, что во взаимодействии РБ с ПМ клетки участвует их углеводная детерминанта, была изучена мембранотропная активность ряда маннозосодержащих олигосахаридов с помощью метода биотестирования, применяемого для идентификации РБ (таблице 3). Кроме того, были изучены и другие углеводы и олигосахариды, которые могут участвовать в межклеточных адгезионных взаимодействиях и процессах межклеточного
