Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. ДИАГНОСТИЧЕСКИЕ ПРЕПАРАТЫ ДЛЯ ВЫЯВЛЕПИЯ И МОНИТОРИНГА ИНФЕКЦИОННЫХ И СОМАТИЧЕСКИХ ПАТОЛОГИЙ ЧЕЛОВЕКА И ЖИВОТНЫХ (обзор литературы) 9
1.1. Виды иммунохимического анализа 11
1.2. Методы генного зондирования 24
1.3. Метод диагностических экспресс-тестов 25
1.4. Иммуномембранный метод 25
1.5. Иммунохроматографический анализ 25
1.6. Иммуносорбенты для иммунохимического анализа 26
ГЛАВА2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 37
2.1. Материалы исследования 37
2.2 Методы исследования 41
2.3, Статистическая обработка полученных результатов 52
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХОБСУЖДЕНИЕ 53
3.1. Выбор оптимальных твердофазных носителей 53
3.2. Сопоставление различных способов проведения иммунохимического анализа с использованием гидрозольных препаратов 54
3.3. Определение оптимального модификатора для твёрдой фазы 61
3.4. Результаты хемосорбции в модельной системе 63
3.5. Экспериментальные данные по определению антител к дифтерийному анатоксину в сыворотке крови 67
3.6. Изучение гидрозольных диагностикумов для детекции антител к М. tuberculosis 71
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 77
ВЫВОДЫ 8..7
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 19.
Введение к работе
Актуальность проблемы. При развитии патологического состояния болезни в организме человека в его биологических жидкостях: крови, моче, слюне появляются определенные маркеры — специфические вещества сложной, как правило, белковой природы. При обнаружении тех или иных специфических маркеров врач может судить о факте заболевания. В ряде случаев это удается тогда, когда больной не подозревает о начале и развитии болезни. Следовательно, необходимо внедрять в практическую деятельность врача новые экспрессные методы ранней диагностики. В распоряжении любого врача-клинициста должны быть диагностические препараты, позволяющие осуществить хотя бы качественную диагностику (по принципу «да»—«нет»)с последующим более полным исследованием в случае «да» конкретной патологии, соответствующей его специальности.
Эти препараты должны быть дешевы, экспрессны — постановка реакции и считывание результатов не более 1-2 минут, не требующих дополнительных приборов (возможность проводить реакции непосредственно на рабочем месте), возможность ставить реакции с малыми объемами препарата и биоматериала, взятого от больного (10-20 мкл). Кроме того, они должны иметь стабильные и воспроизводимые иммунохимические свойства, т.е. выявлять маркеры того или иного заболевания в самом широком спектре биологических жидкостей (в моче, слюне, сыворотке крови и т.д.) в минимальных концентрациях. В настоящее время иммунохимические методы далеки от сформулированных выше требований. Для большинства из них характерна не экспрессность, высокая стоимость одного анализа, требуются дорогостоящие приборы. Учитывая отсутствие приборов, простоту применения и быстроту постановки реакции, можно рекомендовать эти препараты для решения задач, стоящих перед МЧС, в практику прямого переливания крови в медицине катастроф (в условиях, приближенных к полевым), когда необходимо защитить пациента при трансфузиологических процедурах от контаминантных инфекций, а также оценки краш-синдрома.
В последнее время предложено решение данной задачи. Все иммунохимические методы базируются на известном уже почти столетие феномене взаимодействия между антигеном и антителом. Поэтому можно использовать в качестве диагностических препаратов так называемые гидрозоли: ультрадисперсные частицы оксидов металлов побочных подгрупп и комплексные соединения, на поверхность которых по определенной технологии нанесены антигены, либо антитела, ассоциированные с тем или иным заболеванием. Если в распоряжении врача имеется один из компонентов данной пары: антиген либо соответствующие антитела, то он может поставить верный диагноз и принять адекватные решения. Определенное место эти препараты могут занять в тестировании эффективности вакцинации разных групп населения против ряда инфекционных заболеваний: клещевой энцефалит, столбняк, коклюш, дифтерия, туберкулез. При помощи их можно осуществлять также диагностику соматических (острый инфаркт миокарда, злокачественные опухоли) патологий. Данный вид иммунологического анализа является полу количественным, основан на методе гидрозольной агглютинации. [42.] Антитела оценивается по предельным титрам (концентрациям), а антигены -путём постановки параллельной реакции с референсным препаратом. Реакция происходит в лунках планшета, куда закапывают разведённый буфером гидрозоль и затем разведённый биоматериал. Результат считывается визуально. Общее время постановки 10-15 минут. Гидрозольные диагностику мы производятся в жидком виде и не требуют лиофилизации (вакуумной сушки). Сроки хранения от 9 месяцев до одного года в зависимости от исходных биолигандов.
Таким образом, основным предметом нашего исследования стали разработка и создание экспрессных иммунохимических препаратов, которые соответствовали бы выше перечисленным требованиям.
Цель исследования. Изучение особенностей синтеза гидрозольных диагностикумов на основе ультрадисперсных частиц неорганической природы: оксидов, комплексных соединений, на поверхность которых сорбированы специфические белки — антигены - маркеры определенных заболеваний.
Задачи исследования:
Выбор оптимальных носителей для синтеза диагностикумов на основе катионов металлов побочных подгрупп.
Исследование различных способов хемосорбции белков на выбранные твердые фазы.
Установление закономерностей между дозировкой химического модификатора и свойствами гидрозоля.
Получение и апробация диагностических препаратов на выявление маркеров таких заболеваний, как туберкулез, дифтерия.
Научная новизна:
Проведено комплексное исследование и выбор наиболее оптимального неорганического материала для последующего изготовления конъюгатов этих веществ и специфических белков-антигенов для иммунохимичес-кого анализа.
На основе экспериментальных данных осуществлён синтез гидрозольных препаратов.
Установлены количественные соотношения между дозировками химических модификаторов на поверхности ультрадисперсных частиц и свойствами получающихся продуктов - иммунохимических гидрозолей. Положения, выносимые на защиту:
1. Конъюгаты белков и неорганических дисперсных частиц - гидрозоли должны синтезироваться на основе гидрофобных неорганических объектов. Наиболее приемлемыми из таковых могут быть названы - оксид железа (III), оксид меди (II), гексацианоферрат (II) железа (III).
Исследование методов постановки реакции гидрозольной агглютинации в варианте на стекле, в U-образном планшете и на пористом мембранном фильтре.
Оптимальными по им мунохимическим свойствам являются гидрозоли, поверхности которых перед сорбцией специфических белков-биолигандов подвергаются химической модификации для ковалентного связывания белка с твердой поверхностью. Использовались модификаторы, осуществляющие хемосорбцию либо по NH2-rpynne (нитрозоамины), либо по SH-группе (катионы тяжёлых d-элементов периодической системы-Pb , Hg 7-
На основании этих положений осуществлен синтез гидрозолей для экспрессного бесприборного выявления определённых антител к возбудителям туберкулёза, дифтерии в биологических жидкостях человека.
Практическая значимость.
Получение и последующая реализация гидрозольных диагностикумов в практическом здравоохранении, предназначенных для выявления маркеров таких заболеваний, как туберкулез и дифтерия.
Реализация в практическом здравоохранении.
Результаты исследований внедрены в практику специализированной противотуберкулёзной больницы ГУИН по Кировской области.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 6 печатных работ.
Объем и структура диссертации.
Диссертация изложена на 90 страницах машинописного текста и состоит из введения, трёх глав, выводов, списка использованной литературы. Работа иллюстрирована 10 рисунками, 7 таблицами. Библиографический указатель литературы включает 83 отечественных и 41 зарубежных источников.
Апробация работы.
Основные положения диссертации доложены и обсуждены на научно-практических конференциях: «Применение нового метода гидрозольной агглютинации для оценки поствакцинального противодифтерийного иммунитета» (II международная конференция, «Идеи Пастера в борьбе с инфекциями» СПб, 1998), «Гидрозоли в клинической практике» (доклад на II конгрессе специалистов клинической лабораторной диагностики Москва 2000 г.), доклад на заседании проблемной комиссии «Морфология и морфогенез, нормальная и патологическая физиология» КГМА и на кафедре технологии микробиологического синтеза СПбГТИ (ТУ).
Виды иммунохимического анализа
Все иммунохимические методы [14,77.] базируются на известном уже почти столетие феномене взаимодействия между антигеном и соответствующим ему антителом. Широко используются для лабораторной диагностики инфекционных и паразитарных болезней,[16,83,78.] определения группы крови, тканевых и опухолевых антигенов, видовой принадлежности белка, распознавания аллергии, а также в научно-исследовательской работе. Они включают серологические исследования, или серологические реакции, к которым относят обычно реакции прямого воздействия антигенов и антител сыворотки крови in vitro.[9.] Если имеется один из компонентов этой пары, то возможна идентификация другого компонента иммунохимического комплекса в тех или иных биологических жидкостях пациента, а отсюда - возможность либо первичного диагноза, либо подтверждение диагноза и принятия адекватных диагнозу последующих решений. [64,25.] Естественно, для практики необходима последующая визуализация образования комплекса антиген-антитело. Это может быть либо прямая визуализация, либо использование какой-либо метки. [77.]
В настоящее время существует более 200 различных диагностических методов и их модификаций, основанных на реакции антиген-антитело (АГ-АТ) [77,75,63.]. Их условно подразделяют на 4 группы:
1. Прямые методы - преципитация и агглютинация. Эти методы анализа, основанные на простом взаимодействии АГ-АТ, результаты которого определяются непосредственно, основаны на феноменах преципитации и агглютинации. [3 7,43.]
2. Методы, основанные на агглютинации частиц, предварительно закреплённых на пассивных носителях: РГА, РПГА, коагглютинации, атексагтлютинации (метка - эритроциты, бактерии, латекс) Это метод
пассивной агглютинации, относятся реакции с прямой меткой.
3. Индикаторные методы с использованием меченых молекул АГ-АТ, которые являются индикаторами. Это РИА, ИФА, МФА. Меткой служат изотопы, ферменты, флуорохромы [47,70,80.]. Принцип индикаторных методов заключается в том, что внутрь их вводится метка и затем её количество детектируется соответствующими приборами. Это реакции с непрямой меткой.
4. Методы, основанные на использовании иммуносенсоров, являющихся разновидностью биосенсоров - специальных устройств, объединяющих в себя биологический чувствительный материал с системой передачи и трансформации электрического сигнала, сопровождающего реакцию АГАТ. Это направление интенсивно развивается в последние 5 лет.
А Рассмотрим более подробно эти методы.
"Прямые" реакции.
Это реакции взаимодействия антигена с гипериммунными сыворотками, либо гипериммунные сыворотки с антигеном. Реакции эти могут проводится ш либо в жидких средах, либо в гелях. Их результаты проявляются в виде так IT называемых полос, либо колец преципитации [37,43.].
Данные реакции основаны на визуализации образующегося иммунного комплекса за счёт какой-либо метки более удобной для детекции и способной так или иначе связываться с биолигандом. К таковым относятся, в частности, методы, основанные на регистрации феномена преципитации
Преципитация происходит в результате взаимодействия антител с растворимыми антигенами. Простейшим примером реакции преципитации является образование в пробирке непрозрачной полосы преципитации на границе наслоения антигена на антитело. Широко применяют различные разновидности реакции преципитации в полужидких гелях агара или агарозы (метод двойной иммунодиффузии по Оухтерлони, метод радиальной иммунодиффузии, иммуноэлектрофорез) [47.], которые носят одновременно качественный и количественный характер. В результате свободной диффузии в геле антигенов и антител в зоне оптимального их соотношения образуются специфические комплексы- полосы преципитации, которые выявляют визуально или при окрашивании. Особенностью метода является то, что каждая пара антиген-антитело формирует индивидуальную полосу преципитации, и реакция не зависит от наличия в исследуемой системе других антигенов и антител. Можно также указать на метод иммунодиффузии (ИД), который основан на том, что реакция АГ-АТ происходит внутри тонкого слоя геля, предварительно нанесённого на предметное стекло. Функция геля локализация на стекле своеобразного рисунка - преципитата. Растворённые АГ-АТ легко диффундируют в геле и вступают в реакцию друг с другом, образуя видимые полосы преципитации. Кроме того, разработан метод иммуноэлектро-форетического анализа (ИЭФА), основанный на сочетании электрофореза в агаровом геле с иммунодиффузией. В качестве носителей, кроме обычного геля, часто используют ацетатцеллюлозные плёнки. В последнее время широко развивается новое направление - капиллярный электрофорез, где движение носителя происходит не на поверхности стенки или плёнки, а внутри тонкого кварцевого капилляра. Следует отметить, что этот метод достаточно трудоёмкий, требует сециального оборудования. В целом прямые реакции обладают низкой чувствительностью, что делает их малоприемлимыми для практики.
Материалы исследования
Твёрдые носители для исследования выбирали из доступных пигментов. Пигментами [4] называются неорганические оксиды, которые при смешении с красочной основой могут давать устойчивые краски конкретного цвета для окрашивания тех или иных изделий. Наибольший практический интерес для иммунохимии представляет, прежде всего, красный оксид железа (Fe203), а также другие пигменты, характеризующиеся следующими показателями, представленные в таблице I .[43.]
Указанные препараты интересны для использования, прежде всего за счёт их интенсивной и устойчивой окраски, высокой плотности и очень большой удельной поверхности. Высокая плотность препаратов будет приводить к быстрой агглютинации.
Биолиганды,использованные в работе.
В качестве биолигандов использовали коммерческие высокоочищенные антигены следующих нозологии: противокоревой т глбулин человека, туберкулёзный антиген ППД, очищенный в стандартном разведении,
В качестве биологических материалов данного исследования использовали сыворотки крови здоровых доноров, не содержащих антитела к выше указанным нозологиям, а также сыворотки крови от больных людей с верифицированным диагнозом по конкретной нозологии: туберкулёз, дифтерия.
В ряде случаев сыворотки от больных людей и здоровых доноров перепроверялись с использованием действующих стандартных методов -оценки факта наличия антител к конкретным нозологиям: туберкулёз, дифтерия. Указанные исследования проводились при помощи иммуноферментного РОССИЙСКАЯ 41 Г0СКДАРСТП 1ЯА БИБЛИОТШ анализа (ИФА) и реакции пассивной гемагглютинации (РПГА). В качестве v модельных систем использовали модельный антиген промышленно производимый проти вокоревой т пгобулин человека и мышиные антисыворотки против глобулина человека.
Методы исследования.
.Постановка реакции гидрозольной агглютинации.
Для постановки реакции гидрозольной агглютинации использовали U-либо V-образные иммунологические планшеты. В лунках планшета разводили сыворотки, именуемые биологической жидкостью. Сыворотки получали путём взятия небольшого (не более 0.1 мл) объёма крови. Полученную кровь центрифугировали для осаждения форменных элементов. Допускалось взятие крови капиллярным методом.
Последующие разведения «положительной» и «отрицательной» сывороток в титрах от 1:2 до 1:1280 путём разбавления сывороток раствором для разведения производили таким образом, чтобы объём подлежащего титрованию биопрепарата в лунке составил 50 мкл. Затем в каждое разведение добавляется 50 мкл гидрозольного препарата оксида железа (III) с сорбированным, конкретным антигеном. После инкубации в термостате при 37С в течение 20 минут производится визуальная оценка реакции, либо микроскопия осадка. Положительной реакцией иммунологического анализа считается наличие агглютинации в лунках U-образного планшета (точка в центре лунки).
Выбор оптимальных твердофазных носителей
Осуществили выбор наиболее оптимальных твердофазных носителей. Твёрдые фазы для исследования выбирали из промышленно- доступных пигментов, свойства некоторых из них представлены в таблице 1.
Носители для иммунохимических тестов должны соответствовать определённым требованиям: иметь различную окраску, размеры и плотность частиц, быть дешёвыми и доступными, способность образовывать устойчивые коньюгаты с белками - биолигандами. Свой выбор остановили на промышленно производимых пигментах: оксид железа (III), оксид меди (II), оксид железа (II, III), а также золь гексацианоферрата (II) железа (III) взятого для сравнения. Впоследствии отказались от оксида железа (II, III), т.к. промышленность в настоящее время его не выпускает. Таким образом, при осуществлении первого этапа были выбраны первоначально наиболее подходящие носители для реакции гидрозольной агглютинации. К таковым могут быть отнесены: оксид железа (III), оксид меди (II), а также золь гексацианоферрата (II) железа (III). Оксид железа (III) является промышленно производимым препаратом, пигментом красным, имеющим утверждённую техническую документацию и стандартность по ряду интересующих физико-химических свойств (плотность, размер частиц, цвет). Также он является основой для производства магнитных носителей для специальной радиоэлектроники, однако, выйти на щ соответствующие организации, курирующие вопросы в этой области, не удалось.
Поэтому использовали техническую документацию на оксид железа (III) как пигмент и работали с ним, как с пигментным материалом. Оксид меди (II) и гексацианоферрат (II) железа (III) также являются пигментными материалами. Оксид меди (II) и гексацианоферрат (II) железа (III) синтезировали самостоятельно. Оксид меди (II) был взят как оксид для сравнения, имеющий более высокую плотность частиц, чем оксид железа (III). Предложенные носители отличаются от эритроцитов, применяемых в РПГА, существенно более высокой плотностью и стандарностью сорбционных свойств поверхности. На их поверхности, в отличие от эритроцитов, отсутствуют какие-либо белковые (антигенные) детерминанты, поэтому не дают ложнопозитивных результатов.
3.2. Сопоставление различных способов проведения иммунохимичес-кого анализа с использованием гидрозольных препаратов.
Гидрозольные препараты - это системы с прямой меткой, поэтому могут визуализироваться различными способами. В их основе лежит метод пассивной агглютинации. Агглютинация - это процесс склеивания и выпадения в осадок взвешенных частиц. На ультрадисперсную частицу адсорбируют антиген и при наличии в растворе соответствующих комплементарных структур - антител, эти частицы образуют агрегаты, которые с потерей агрегативной устойчивости выпадают в осадок. Это может наблюдаться невооруженным глазом и фиксироваться различными способами. Первым и наиболее традиционным может быть способ получения данных путём постановки реакции в U-образном планшете. К достоинству такого способа можно отнести: получение результатов сразу по многим сывороткам, возможность относительной автоматизации работы. Недостатком этого метода можно считать необходимость использования специальных иммунохимических планшетов, которые не всегда доступны практическому здравоохранению. Поэтому целесообразно было изучить возможность использования новых методов визуализации реакции гидрозольной агглютинации. К таким методам могут быть отнесены: постановка реакции на стекле и постановка реакции на пористом мембранном фильтре. Однако эти методы имеют определённые ограничения, в частности, постановка реакции на пористом мембранном фильтре лимитируется соотношением размеров пор фильтра и частиц гидрозоля. Схематично это можно представить в виде рисунка ( рисунок 1).
