Введение к работе
Актуальность проблемы. Сурвивин - это один из представителей семейства белков-ингибиторов апоптоза (IAP), экспрессирующийся только в опухолевых, но не в здоровых тканях. В отличие от других белков семейства функции сурвивина не ограничиваются лишь ингибированием программированной клеточной смерти, он также является важным регулятором клеточного деления. Благодаря своей бифункциональности сурвивин играет важную роль в онкогенезе: с одной стороны он позволяет клеткам с дефектами веретена деления продолжать деление, с другой - делает их устойчивыми к действию хемотерапевтических агентов, гамма-излучения и иммунотерапии [Li et al, 2006].
Было показано, что функции сурвивина могут зависеть от его локализации в клетке и структурного состояния [Pavlyukov et al, 2011]. Поэтому структурно-функциональные исследования этого белка являются актуальной задачей, решение которой приведет к лучшему пониманию процессов перерождения здоровой клетки в раковую, а также позволит разработать новые подходы к терапии и уточняющей диагностике онкозаболеваний.
Изучение структурно-функциональных особенностей сурвивина осложнено тем, что практически отсутствуют антитела, селективно связывающие различные структурные формы сурвивина. Мы предположили, что подобные антитела могут быть получены путем иммунизации животных синтетическими пептидными фрагментами сурвивина, моделирующими различные функционально важные участки белка.
Цель работы. Получение с помощью синтетических пептидов, моделирующих различные функционально важные участки сурвивина, антител, пригодных для изучения структурно-функциональных особенностей белка и уточняющей диагностики онкозаболеваний. В рамках поставленной цели были сформулированы следующие задачи:
-
Выбор пептидных фрагментов сурвивина для получения антител.
-
Иммунизация животных пептидными фрагментами сурвивина и получение противопептидных сывороток.
-
Выделение из сывороток с помощью аффинной хроматографии на сорбентах с иммобилизованными пептидами моноспецифических антител, направленных к строго определенным участкам сурвивина.
-
Изучение свойств полученных антител и оценка их пригодности для структурно-функциональных исследований сурвивина.
-
Исследование возможности использования полученных антител для уточняющей диагностики онкозаболеваний.
Научная новизна работы. В настоящей работе получена панель из 9 ранее не описанных моноспецифических антител к сурвивину, пригодных для структурно-функциональных исследований белка. Впервые показано, что антитела к различным участкам сурвивина имеют разное сродство к мономеру
В организации работы принимал участие академик РАН, д.х.н., проф. Швец В.И.
белка и сурвивинсодержащему комплексу. Было впервые установлено, что лишь антитела к N-концевому участку сурвивина выявляют пул белка, вовлеченный в ход клеточного деления и солокализованый с комплексом белков-хромосомных пассажиров. С помощью полученных антител впервые показано, что мономер сурвивина и сурвивинсодержащий комплекс могут играть разные роли в онкогенезе и лишь мономер сурвивина принимает участие в злокачественном перерождении клетки. Разработан подход к выделению нативного сурвивина из лизата опухолевых клеток с помощью сорбентов с иммобилизованными моноспецифическими антителами к сурвивину.
Практическая значимость работы. В настоящей работе было показано, что мономер сурвивина экспрессируется только в опухолевых тканях, а сурвивинсодержащий комплекс - как в опухолевых, так и смежных с опухолью тканях, что может быть использовано для диагностики рака. Было установлено, что высокое содержание сурвивина в опухолевых тканях коррелирует со снижением степени дифференцировки опухоли и возрастанием стадии заболевания. Таким образом, моноспецифические антитела к сурвивину могут быть использованы для диагностики биологической агрессивности и метастатической активности опухоли.
Апробация работы и публикации. Результаты настоящей работы были представлены на XX, XXI, XXII, XXIII, XXIV и XXV зимней международной молодежной научной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2008, 2009, 2010, 2011, 2012, 2013), 2-й Московской международной конференции «Иммунофизиология: естественный аутоиммунитет в норме и патологии» (Москва, 2008), XVI и XVIII международной конференции «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии» (Украина, 2008, 2010), 30ом и 31ом европейском пептидном симпозиуме (Финляндия, 2008; Дания, 2010), X чтениях, посвященных памяти академика Ю.А.Овчинникова (Москва, 2011), 1ом мультидисциплинарном симпозиуме «Молекулярная онкология: от лабораторного стола к медицине» (Украина, 2012), VI Российском симпозиуме «Белки и пептиды» (Уфа, 2013) и 15ом международном конгрессе по иммунологии (Италия, 2013).
Материалы диссертационной работы изложены в 3 статьях в рецензируемых научных журналах и в 19 сообщениях в тезисной форме и в виде материалов российских и международных конференций. Получен 1 патент РФ. Работа выполнена при поддержке грантов РФФИ №10-04-01588-а и №12-04-31590.
Структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 126 страницах с использованием 27 рисунков, 27 таблиц и состоит из введения, обзора литературы, результатов и обсуждения, экспериментальной части, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 143 ссылки.
