Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 10
1.1. Современные методы детекции прионов 10
1.2. Синтетические фрагменты прионных пептидов; методики иммунизации животных 23
1.3. Гибридизация соматических, миеломных и антителпродуцирующих клеток с целью получения моноклональных антител 32
2. Собственные исследования 36
2.1. Материалы и методы 36
2.1.1. Культуры клеток, питательные среды 36
2.1.2. Вирусные штаммы 41
2.1.3. Получение конъюгатов пептидов 43
2.1.4. Лабораторные животные 43
2.1.5. Получение асцитной жидкости 43
2.1.5. Определение титра антител методом ИФА в крови иммунизированных животных и в асците 44
2.1.6. Иммуноцитохимическое исследование клеточных культур на наличие прионов 44
2.1.7. Проведение Вестерн-блота 45
2.1.8. Выявление прионов методом ИФА 51
2.2. Результаты 52
2.2.1. Получение поликлональных антител к синтетическому
пептиду прионного белка. Оценка уровня антител в сыворотке
крови иммунизированных животных в ИФА 52
2.2.2. Иммуноцитохимическое исследование культур клеток, гистосрезов головного мозга и мазков крови 59
2.2.3. Разработка метода выявления прионного протеина в белковом препарате «Бактивин» Вестерн-блот анализом 70
2.2.4. Разработка методов иммуноферментного анализа для выявления прионного протеина 73
2.3. Гибридизация соматических и миеломных клеток с антителпродуцирующими клетками мышей и кроликов, характеристика полученных культур и определение продукции моноклональных антител в культуральнои среде 77
3. Обсуждение 88
4. Выводы 98
5. Практические предложения 99
Список литературы 100
Приложения 119
- Современные методы детекции прионов
- Синтетические фрагменты прионных пептидов; методики иммунизации животных
- Материалы и методы
Введение к работе
М*^ 1. .
Актуальность темы. Прионные болезни представляют группу нейродегенератяввых расстройств человека (болезнь Крейцфельдга-Якоба (БКЯ), синдром Герппманна-Штройслера, куру) и животных (скрепи овец и коз, трансмиссивная энцефалопатия норок, хроническая изнуряющая болезнь диких оленей и лосей), которые являются причиной нарушений в ЦНС и неизбежно ведут к гибели (SB.Prusiner,1992).
Многочисленными исследованиями доказано, что прионы - возбудители коровьего «бешенства» могут служил, причиной заболевания человека (Thackray AM, Klein MA, Aguzzi A, Bujdoso R., 2002). Это заболевание названо новым вариантом болезни Крейцфельдта - Якоба (вБКЯ), которое в отличие от ранее известного заболевания встречается в молодом возрасте. По сравнению со спорадической формой БКЯ, вБКЯ вызывается штаммами прионов, сбладшощими высокой лимфотротшостью. Доказательством лимфотропизма прионов, вызывающих вБКЯ, стало обнаружение в Великобритании в ходе руганного мониторинга в миндалинах и аппендиксах патогенного приона от людей, умерших в возрасте 10-50 лет (в их числе 70% молодых людей в возрасте 20-29 лет, т.е. среднем возрасте проявления вБКЯ). Высокий процент инфицирования людей инфекционнм прионом связывают с возможностью передачи вБКЯ путем гемотрансфузии (Llewelyn С A, HewittPE., Knight R.S. et al., 2004).
Диагностика прионных болезней до недавнего времени базировалась на выявлении характерных клинических признаков, а также патогистологическом исследовании головного мозга. Предложены методы иммуногистохимии, иммунохимии и др. для посмертной или послеубойной диагностики губкообразной энцефалопатии крупного рогатого скота (BSE), скрепи овец и коз (КйЫегЕ., Oech B.,.Raeber AI, 2003).
Разработка чувствительных специфических методов детекции минимальных количеств РгР* у животных, зараженных прионами, в инкубационном и раннем клиническом периодах болезни, в культурах клеток, сыворотках крови и других биологических жидкостях, приобретает особую значимость. Учитывая, что РтР5* адаптирован к развитию кроме нервной ткани, в лимфоцитах, фолликулярных дендритных клетках, рядом авторов предложены методы доклинического выявления прионов иммуногастохимическим методом в миндалинах, а также в лимфатических узлах конъюнктивы глаза овец (О" Rourke et al, 1998, 1999; Mackenzie A, 1983; RubensteinR.,KascsakR.,MerzP. etaL, 1986) с использованием моноклональных антител к синтетическому прионному пептиду. В России Вольготной ОМ, Рыбаковым С.С. и др., (2002), Рыбаковым С.С. и др., (2005) получены поликлональные антитела к различным синтетическим фрагментам прионного белка и показана их специфичность при иммуногистохимической детекции прионов в гастосрезах головного мозга больных BSE животных.
Необходимо тестировать культуры клеток, полученных из органов и тканей сельскохозяйственных животных и используемых в биотехнологии и вирусологии, на присутствие прионов, а также создание клеточных линий, чувствительных к агенту скрепи, для изучения различных аспектов взаимодействия прионов с клеткой.
Цель работы: получить поликлональные антитела к синтетическим пептидам прионного белка и проверить их специфичность к клеточной и инфекционной изоформам прионного протеина.
Основные задачи исследований:
1. Провести иммунизацию лабораторных животных (кроликов, мышей)
синтетическим пептидом прионного белка с аминокислотной
последовательностью 106-134 (по бычьему пептиду) и получить сыворотку,
содержащую поликлональные антитела к пептиду прионного белка,
способную специфически связываться с прионным белком.
-
Получить гибридные культуры, продуцирующие моноклональные антитела к синтетическому пептиду прионного белка, отвечающие за специфическое связывание с прионным белком.
-
Изучить активность поли- и моноклональных антител к прионам в различных реакциях.
Научная новизна работы. Получены поликлональные антитела на синтетический пептид прионного белка с аминокислотной последовательностью 106-134 (по бычьему пептиду).
Определена способность иммунной поликлональной кроличьей сыворотки выявлять инфекционный прион в гистосрезах головного мозга животных, больных ТГЭ и культурах клеток, инфицированных агентом скрепи.
Впервые получены межвидовая гибридная культура спленоциты овцы х лимфоциты кролика (ПО ТК" х Ж) и мьгашная гибридома, продуцирующие моноклональные антитела к пептиду прионного белка. Культура ПО ТК'х Ж чувствительна к вирусам инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота и вирусной диареи - болезни слизистых крупного рогатого скота.
Практическая значимость исследований. Специфические кроличьи антитела к синтетическому прионному пептиду способны выявлять прионы в культурах клеток и гистосрезах головного мозга.
Получена гибридная культура почка овцы х лимфоциты кролика, чувствительная к вирусам ИРТ и ВД-БС КРС (заявка на патент принята Г-59, ГСП-5 18.08.2005г., № 2005126087).
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Получение поликлональных иммунных кроличьих сывороток к
пептиду прионного белка.
2. Иммуноцитохимический и иммуногистохимический методы
выявления инфекционного приона в культурах клеток, инфицированных
агентом скрепи и гистосрезах головного мозга животных, больных ТГЭ с
применением иммунной поликлональной кроличьей сыворотки.
3. Получение, культурально-морфологическая и кариологическая
характеристика гибридной культуры почки овцы и лимфоцитов иммунного
кролика. Изучение ее чувствительности к вирусам инфекционного
ринотрахеита крупного рогатого скота, вирусной диареи - болезни слизистых, парагриппа-3, респираторно-синцигаальной инфекции и их цитопатогенного действия.
Апробация работы. Материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на Международной научно-практической конференция "IEKBM -80 лет на передовом рубеже ветеринарной науки". Харьков, 2002; Международной научной конференции «Современные достижения и проблемы биотехнологии сельскохозяйственных животных», Подольск, 2002; Научной конференции, посвященной 300- летию основания Санкт -Петербурга "Биологическая, медицинская и ветеринарно- медицинская наука и новейшие технологии на благо человека и человечества." Санкт-Петербург, 2003 г.; Международной научной конференции «Развитие ключевых направлений с/х науки в Казахстане: селекция, биотехнология, генетические ресурсы» г. Астана, 2004 г; на 45-ом Международном конгрессе Европейского общества тканевых культур (ETCS), г. Мюнстер 2004 г; международной научной конференции «Сохранение генетических ресурсов» г. Санкт-Петербург, 2004 г.; Международной научной конференции «Ветеринарная медицина» г. Ялта, 2005 г; на межлабораторном совещании ВИЭВ, 2005 г.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 работ.
Объем и структура диссертации. Работа изложена на 132 страницах машинописного текста и включает: введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение полученных результатов, выводы, практические предложения, библиографический список использованной литературы и приложение. Материалы диссертации иллюстрированы 9 таблицами, 32 рисунками. Библиографический список литературы включает 187 источников, из которых 98 иностранных.
link1 Современные методы детекции прионов class1
До недавнего времени подходы для ранней диагностики ТГЭ основывались на клинических признаках (Суворов B.C., Шубин, 1987), электроэнцефалографии, ядерном магнитном резонансе или на исследовании биопсии мозга. Подтверждение диагноза при подозрении на болезнь, тем не менее, было основано на гистологическом и иммуногистохимическом (ИГХ) исследовании мозга. В настоящее время разработаны и разрабатываются методы, основанные на детекции инфекционных прионов различных тканях инфицированных животных до появления клинических признаков. Такие методы детекции основаны на использовании экспресс-иммунологических реакциях, таких как иммуноферментный анализ и Вестерн-блот.
Европейским Союзом по профилактике здоровья в 1999 и 2003 году признано 5 тест-систем для детекции протеазо-резистентной формы приона в пробах головного мозга:
Prionics-Check Western (Western-blot, Prionics AG) — простое автоматическое одношаговое приготовление проб, предварительно обработанных протеазами. Детекцию осуществляют после разделения фракций белков при помощи электрофореза, переноса на мембрану в трансблоттере и используя антиприонные антитела и вторичные антитела, меченные щелочной фосфатазой в реакции хемилюминисценции.
Platelia test (ELISA, BioRad). Детекцию прионов осуществляют в «сэндвич»-ИФА, используя меченные энзимами антитела.
Enfer test (ELISA, Enfer) - хемилюминисцентный ИФА с использованием первичных моноклональных антител и вторичных, конъюгиро ванных с пероксидазой антител с добавлением хемилюминисцентного реагента.
Prionics-Check LI A (ELISA, Pr ionics AG) - сэндвич хемилюминисцентный метод с простым одношаговым приготовлением проб обработкой протеазами, где одни из антител связаны с ферментами.
CDI (Inpro). Помимо протеазной обработки CDI использует дифференцировку связанными антителами нативного от денатурированного PrPSc.
Наиболее широко используемыми в Европе тест-системами являются Prionics-Check Western и Platelia test.
И все же посмертное нейропатологическое исследование мозговой ткани от животных и человека остается «золотым стандартом» ТГЭ диагностики (КйЫег Е., Oech В., Raeber A.J., 2003).
Для выявления PrPc/PrPSc в крови животных, культурах клеток, тканях, биологических субстратах и др. используют Вестерн-блот, иммуноблоттинг, иммуноцитохимию, изоэлектрическое фокусирование, иммунофлу-оресценцию и иммуноферментный анализ. В основу методов детекции PrPc/Sc в исследуемом материале легла способность специфического связывания антител к синтетическим пептидам прионного белка с прионами.
Иммуногистохимический анализ биопсийного материала миндалин использовали Hill A.F. et al. (1997) для диагностики нового варианта болезни Крейцфельдта-Якоба.
В лимфоидной ткани этим же методом Sigurdson C.J. et al. (1999) обнаруживали патогенный прион при хронической изнуряющей болезни оленей.
Bolton D.C. et al., (1982) иммуногистохимически обнаруживали в формалин-фиксированных или замороженных тканях специфически маркированный протеин РгР in situ.
Синтетические фрагменты прионных пептидов; методики иммунизации животных
О способности соматических клеток спонтанно сливаться друг с другом и образовывать многоядерные клетки было известно еще в 19 веке. Позже, при гистологическом исследовании патологического материала от больных некоторыми инфекционными заболеваниями обнаружили образование многоядерных клеток — симпластов.
Впервые спонтанное образование гибридных клеток описал Barski et al., (1961) при совместном культивировании клеток двух раковых линий с разным общим числом хромосом, неодинаковой способностью образовывать опухоли. Спонтанное слияние клеток происходит в культуре как in vitro так и in vivo.
В основе гибридизации соматических клеток в ее современном виде лежит слияние разных клеток, вызванное экспериментальным путем. Впервые для получения гибридом использовалось слияние миеломы и лимфоцитов мыши Kohler G. и Milstein С. в 1975 г.
Одна из самых популярных мышиных миеломных линий, широко используемая для гибридизации - P3X63-Ag8.653. Эта линия не синтезирует никаких цепей иммуноглобулинов и отличается быстрой пролиферацией и отличной гибридизируемостью. Клетки миеломы этого штамма не содержат фермента гипоксантин-гуанин-фосфорибозилтрансферазу (ГГФРТ) и погибают в селективной питательной среде, содержащей гипоксантин, аминоптерин и тимидин (ГАТ). Лимфоциты иммунизироаанных животных в такой среде не погибают, т.к. у них нет ферментного дефицита.
Наиболее широко используемый метаболический дефект миеломных клеток - дефицит по ферменту ГГФРТ. Этот фермент обеспечивает включение в ДНК и РНК предшественников пуринов (гипоксантина и гуанина), а также и антиметаболитов 8-азагуанина или 6-тиогуанина. Поэтому, если миеломные клетки культивировать на среде, содержащей азогуанин, то смогут выжить только те клетки, у которых отсутствует ГГФРТ, Такие клетки способны жить, синтезируя свою ДНК из пуринов, которые, в свою очередь, синтезируются de novo (аминоптерин, азасерин), то мутантные опухолевые клетки погибнут. В присутствии аминоптерина могут жить клетки, имеющие ГТФРТ и ее субстраты — гипоксантин и гуанин.
Гибридные клетки, несущие геном нормального лимфоцита, содержащего нормальный ген ГГФРТ выживают на селективной среде ГАТ в отличие от родительских опухолевых клеток. Нормальные лимфоциты, как правило, погибают в культуре in vitro через несколько дней. Т.о., в живых остаются только искомые гибридные клетки. От лимфоцитов гибридные клетки получают способность синтезировать определенные антитела и выживать в среде ГАТ. От миеломных клеток получают возможность бесконечно размножаться.
В лаборатории клеточной биотехнологии ВИЭВ методом многошаговой селекции из постоянных линий клеток сельскохозяйственных животных получены мутантные по генам ТК и ГГФРТ культуры клеток: СПЭВ ТК" , ТР ГГФРТ" (Ш.М. Тугизов, Л.П. Дьяконов, А.А. Кущ, Е.В. Майджи, 1985-1987) и ПО-ТК" (И.Л. Куликова, Л.П. Дьяконов, Т.В. Гальнбек, А.С. Симонова, 2000). Наличие у клеток дефекта по генам ТК и ГГФРТ позволило создать внутривидовые и межвидовые гибридные с нерастущими in vitro клетками (лимфоциты, энтероциты и др.): СПЭВ ТК"х спленоциты свиньи - А4хС, СПЭВ ТК х лимфоциты коровы - Д5 х ЛК, СПЭВ ТК" х лимфоциты лошади — АдхЬ, СПЭВ ТК" х лимфоциты кролика, ТР ГГФРТ х лимфоциты коровы (Ш.М. Тугизов, Дьяконов Л.П., А.А. Кущ, Е.В. Майджи и др., 1985-1987); ПО- ТК х лимфоциты овцы - ПО-ТК х Л О, ПО-ТК х спленоциты овцы ПО-ТК" х СО (И.Л. Куликова, А.С. Симонова, Дьяконов Л.П., Т.В. Гальнбек, 2000).
Полученные гибридные культуры клеток используются для широкого спектра научных исследований, они оказались высокочувствительными к вирусам, а гибридные клетки ПО-ТК хЛО и ПО-ТК"хСО к агенту скрепи (Куликова И.Л., Гальнбек Т.В., Симонова А.С. и др., 2002).
Материалы и методы
В работе использовали мутантные перевиваемые линии клеток ПО ТК", СПЭВ ТК , клеток миелом Sp 2/0 ГТФРТ, P3x63.Ag8/653 ГГФРТ", хранящиеся в Криобанке ВИЭВ. Паспорта на культуры, их культурально-морфологические, кариологические свойства и чувствительность к вирусам указана в паспортах (см. Приложения).
Эксперименты по гибридизации, стандартные растворы и методики использовали согласно с «Методическими рекомендациями по гибридизации соматических клеток сельскохозяйственных животных». М, 1988, 11с. (Дьяконов Л.П., Кущ А.К., Тугизов Ш.М., Майджи Е.В.).
В качестве партнеров по слиянию использовали не растущие in vitro клетки селезенки мышей и кроликов, лимфоциты кроликов.
Для получения лимфоцитов брали кровь от иммунных кроликов (самок, 2-3 кг) в растворе гистопака (Sigma) 1:1, центрифугировали 10 минут при 1000 об/мин.
Получение первичнотрипсинизированной культуры клеток селезенки мышей и кроликов проводили согласно методическим рекомендациям по получению мутантных штаммов линий клеток, органов животных (Методические рекомендации по получению мутантных штаммов перевиваемых линий клеток с/х животных, пригодных для гибридизации. М., 1984, 16 с. Авторы: Л.П. Дьяконов, А.А. Кущ, Ш.М. Тугизов).
Для механического вымывания клеток из измельченной ткани селезенки к тканевым кусочкам добавляли раствор Хенкса, колбу помещали на магнитную мешалку и перемешивали до помутнения раствора Хенкса.
Затем суспензию клеток в растворе Хенкса сливали стерильно в центрифужные стаканы и клетки осаждали центрифугированием при 1000 об/мин в течение 10 минут. Такую процедуру повторяли 2-3 раза. К оставшейся ткани добавляли раствор трипсина. Трипсинизацию лимфоидной ткани проводили дробно, с помощью 0,25%-ного раствора трипсина на магнитной мешалке при 37С. Раствор трипсина добавляли к ткани в соотношении 10:1. Продолжительность одного цикла трипсинизации 10-15 минут. Суспензию клеток в растворе трипсина с сывороткой (2-4%) центрифугировали при 1000 об/мин.
В экспериментах по гибридизации в соответствии с "Методическими рекомендациями по получению мутантных штаммов перевиваемых линий клеток с/х животных, пригодных для гибридизации", М, 1984,16с. - применяли раствор 5-бром-2-дезоксиуридина (5-БДУ) 500 мкг/20мл питательной среды. 5-БДУ использовали в концентрации от 4 до 150 мкг/мл.
100-кратные концентрированные маточные растворы гипоксантина (150 мг препарата растворяли в 100 мл сверхчистой воды при 45-50С); аминоптерина (10 мг препарата добавляли в 90 мл сверхчистой воды, вносили для растворения 0,5 мл 1Н NaOH и доводили объем водой до 100 мл, предварительно нейтрализовав 0,5 мл 1Н HCL); тимидина (50 мг препарата растворяли в 100 мл деионизированной воды).
