Содержание к диссертации
Введение
2. Обзор литературы 8
2.1 Энтеропептидаза-ключевой фермент пищеварения 8
2.1.1. История открытия и физиологическая роль 8
2.1.2. Структура энтеропептидазы 9
2.1.3. Экспрессия гена энтеропептидазы 13
2.2. Взаимодействия сериновых протеиназ с субстратом при ферментативном катализе , 17
2.2.1. Специфичность сериновых протеиназ 17
2.2.2. Сайты распознавания субстрата 19
2.2.3. Распознавание субстратов вовремя катализа 23
A. Критерии специфичности сериновых протеиназ 23
Б. Специфичность определяется этапами связывания и ацилироваыия 24
B. Вклад в специфичность ассоциации субстрата 25
Г. Следствия, касающиеся специфичности гидролиза сложных эфиров 26
2.2.4. Как удаленные взаимодействия влияют на катализ? 27
A. Дальние взаимодействия выравнивают субстрат в активном центре 28
Б. Удаленные взаимодействия оптимизированы в переходном состоянии 29
B. Удаленные взаимодействия индуцируют конформациоиные изменения, содействующие катализу 30
Г. Удаленные взаимодействия экранируют каталитическую триаду от растворителя
Д. Удаленные взаимодействия связывают катализ с движением структуры протеиназы 31
2.3. Экспрессия рекомбинантиых гибридных белков и их ренатурация 32
2.3.1. Экспрессия рекомбинантиых белков 32
2.3.2. Гибридные (слитные) белки 33
Проблемы при экспрессии слитных белков 34
Расщепление слитных белков 35
Слитные белки с тиоредоксином в качестве белка-носителя 37
2.3.3. Ренатурация рекомбинантиых белков 38
3. Материалы и методы 41
3.1. Материалы 41
3.1.1. Реактивы и ферментные препараты 41
3.1.2. Штаммы иплазмидиые вектора 42
3.1.3. Питательные среды для роста бактерий , 42
3.1.4. Синтетические олигонуклеотиды 42
3.2, Методы 43
3.2.1. Трансформация клеток Е. coli плазмидной ДНК 43
3.2.2. Выделение плазмидной ДНК 44
3.2.3. Электрофорети чес кий анализ ДНК в агарозном геле 44
3.2.4. Количественные определения препаратов ДНК и примесей РНК 44
3.2.5. Выделение ДНК из агарозного геля 45
3.2.6. Определение нуклеотидыой последовательности (секвенирование) ДНК 45
3.2.7. Конструирование рекомбинантной плазмидной ДНКрЕТ-32/L-HEP 45
3.2.7. Олигонуклеотид-направленный мутагенез 47
3.2.8. Экспрессия гена L-HEP и ее мутантных вариантов 48
3.2.9. Идентификация белков noN-юнцевой последовательности 48
3.2.10. Ренатурация гибридных белков с тиоредоксином в качестве белка-носителя...49
3.2.11. Очистка активной L-HEP и ее мутантных вариантов 50
3.2.12. Определение количества белка в растворах и гелях 51
3.2.13. Измерение каталитической активности L-HEP и ее мутантных вариантов 51
Гидролиз тиоэфира Z-Lys-SBzl 51
Гидролиз специфического субстрата GD4K-na 52
Гидролиз неспецифических хромогенных пептидных субстратов 52
Гидролиз белковых субстратов 53
Вычисление кинетических параметров 53
3.2.14. Реакции ингибирования каталитической акитвности L-БЕР 54
3.2.15. Построение пространственных моделей L-HEP и ее мутантных вариантов 54
3.2.16. Молекулярная динамика каталитических субъединиц энтеропептидаз 55
3.2.17. Оценка мутантных вариантов L-HEP 56
3.2.18. Моделирование взаимодействий L-BEP, L-HEP и ее мутантных вариантов с
пептидными субстратами 58
4, Результаты и обсуждение 60
4.1. Синтез гена L-HEP, его клонирование в плазмидные вектора и подбор экспрессионной системы 60
4.2. Ренатурация слитного белка Trx/L-HEP и очистка активного фермента L-HEP 61
4.3. Исследование ферментативных свойств L-HEP 63
4.4. Построение пространственной модели L-HEP 71
4.5. Моделирование и получение мутантных вариантов L-HEP с увеличенным выходом ренатурации 72
4.6. Исследование специфичности L-HEP 77
4.7. Моделирование взаимодействия активного центра энтеропептидазы с пептидными субстратами 81
4.8. Получение и исследование каталитических свойств мутантных вариантов L-HEP с заменами R96K, K219Q и R96K/K219Q 86
4.9. Заключение 93
Выводы 96
Список литературы 98
- Взаимодействия сериновых протеиназ с субстратом при ферментативном катализе
- Удаленные взаимодействия экранируют каталитическую триаду от растворителя
- Штаммы иплазмидиые вектора
- Ренатурация слитного белка Trx/L-HEP и очистка активного фермента L-HEP
Введение к работе
Энтеропептадаза - ключевой фермент пищеварения млекопитающих. Она управляет каскадом пищеварительных ферментов, превращая трипсиноген в трипсин, который в свою очередь активирует другие зимогены и, кроме того, активно участвует непосредственно в протеолизе белковой пищи,
Катионный трипсиноген (предшественник трипсина I) не является единственным субстратом энтеропептидазы. Помимо него существуют проферменты анионного трипсина (трипсина II), мезотрипсипа и нейрональиого трипсина, для активации которых также необходима энтеропептадаза. Помимо самого распространенного сайта DDDDK в трипсиногенах встречаются укороченные сайты DK и DDK. Несмотря на то, что экспрессия энтеропептидазы in vivo локализована преимущественно в дуоденальных энтероцитах, при патологиях может наблюдаться побочная экспрессия, например, в раковых клетках. В таком случае можно ожидать существования отличного от трипсиногена субстрата.
В связи с этим важно оценить в полной мере специфичность энтеропептидазы и выявить факторы, влияющие на нее. В последние годы подобная работа проделана в отношении десятков ферментов. Для многих из них определена специфичность по отношению не только к остатку, идущему непосредственно перед разрезаемой связью (Pi), но и к более удаленным остаткам, как с N-конца сайта узнавания (Рг-Рп), так и с С-конца (Рі'-Рп')- Для подобного исследования необходим многосторонний подход к изучению специфичности фермента, включая использование широких наборов или библиотек пептидных субстратов, а также исследование неспецифического гидролиза различных белков.
Не менее важной проблемой является понимание роли дистальных по отношению к разрезаемой связи аминокислотных остатков в ферментативном катализе. Считается, что их связывание с субстратом может понижать барьер реакции ферментативного расщепления путем передачи энергии по сети водородных связей. Кроме того, предполагается, что взаимодействия дистальных остатков с сайтами связывания протеиназы может влиять на внутренние движения фермента и субстрата, необходимые для осуществления некоторых этапов протеолитической реакции. Для проверки этого предположения необходимо накопление большого объема данных по подобным взаимодействиям, включая каталитические константы, энергетику процесса и молекулярную динамику взаимодействия фермент-субстрат.
Для полноценного исследования рекомбинантных белков очень важно наличие эффективных систем экспрессии, позволяющих нарабатывать белки в значительных количествах. В случае энтеропептидазы потребности современной науки весьма широки: помимо интереса ее изучения как важного элемента физиологии человека, энтеропептидаза стала важным инструментом биотехнологии, где используется для расщепления рекомбинантных гибридных белков. В связи со значительной трудностью получения Б Escherichia coli правильно сложенного белка с несколькими дисульфидными связями в цитоплазме, периплазме или секретироваиного в культуральную среду, часто используют такие условия экспрессии, при которых происходит агрегация белка и образование телец включения. В этом случае для получения правильно сложенного белка производят его ренатурацию из телец включения. Разработка и оптимизация процедуры ренатурации важна не только для получения конкретного белка, но и для выявления элементов структуры, важных для фолдипга родственных белков.
В настоящей диссертационной работе разработана процедура получения рекомбинантной каталитической субъединицы энтеропептидазы человека (L-HEP). Для этого создан штамм-продуцент Е. coll, обеспечивающий высокий уровень экспрессии гибридного белка тиоредоксин/L-HEP, и разработана методика ренатурации этого белка из телец включения. Для повышения выхода ренатурации было проведено молекулярное моделирование оптимизированной аминокислотной последовательности энтеропептидазы. Один из предсказанных моделированием мутантных вариантов дал значительно увеличенный выход ренатурации, что позволило получать до 40 мг активного фермента с 1 л бактериальной культуры. Исследования ферментативной кинетики полученного препарата показали его иа порядок более высокую, чем у бычьего аналога, активность при гидролизе специфического субстрата, и, кроме того, обнаружили вторичную специфичность к субстратам с гидрофобными остатками в положении Р2. Моделирование комплексов ферментов человека и быка со специфическим субстратом позволило предположить, что различные константы Михаэлиса обосновываются различными аминокислотными остатками в положения 96 и 21.9 полипептидной цепи ферментов. Введение в названные положения L-HEP соответствующих аминокислотных остатков энтеропептидазы быка подтвердило эту гипотезу и, кроме того, значительно уменьшило гидролиз белковых субстратов по сайтам, отличающимся от специфического отсутствием отрицательно заряженного остатка в положениях Р2 и Рз.
Взаимодействия сериновых протеиназ с субстратом при ферментативном катализе
Специфичность - важнейший параметр, характеризующий любой фермент, обеспечивающий сложную регулируемую работу всех живых организмов. Практически треть всех известных протеиназ можно классифицировать как серииовые протеиназы, названные так по нуклеофильному остатку серина в активном центре. Этот «механизменный» класс первоначально определялся по наличию системы передачи заряда по цепи Asp-His-Ser, каталитической триаде [24]. Такая триада обнаружена, по меньшей мере, в четырех структурных семействах, что позволяет предположить, что каталитический механизм эволюционировал по меньшей мере четырьмя различными путями [25]. Эти четыре семейства сериновых протеиназ: химотрипсин, субтилизин, карбоксипептидаза Y и С1р протеиназа (номенклатура MEROPS [26]). Недавно были открыты сериновые протеиназьг с неизвестными ране каталитическими триадами и диадами, включая Ser-His-Glu, Ser-Lys/His, His-Ser-His и N-концевой Ser [25].
Специфичность сериновых протеиназ, равно как и всех других, определяется их физиологической ролью. Химотрипсин-подобные протеиназы в природе наиболее распространены, в базе данных MEROPS их более 240 [26]. Эти протеиназы можно найти у эукариотов, прокариотов, археобактерий и вирусов. Химотрипсин-подобные протеиназы вовлечены во многие жизненно важные физиологические процессы, включая пищеварение, гемостаз, апоптоз, передачу сигналов, воспроизводство и иммунный ответ [27-30]. «Каскады» последовательной активации сериновых протеиназ управляют сворачиванием крови, фиксацией комплемента и фибринолизом [31-33]. Сходные протеииазные каскады, по-видимому, вовлечены в развитие, реконструкцию матрикса, дифференциацию и заживление ран [34-37]. Специфичности пищеварительных ферментов, таких как трипсин, химотрипсин, эластаза, довольно широки и включают в себя выборку только по аминокислотному остатку, идущему непосредственно перед разрезаемой пептидной связью, ассортимент которых ограничивается аминокислотами со сходными свойствами. Например, трипсин расщепляет пептидную связь после лизина или аргинина, химотрипсин - после фенилаланина или тирозина, эластаза - после малых остатков: аланнна, глицина, треонина. Специфичность регуляторных протеиназ гораздо уже, так как их физиологическим субстратом является строго определенный белок и «в мирное время» они не имеют права «покушаться» на другие белки. Примерами таких регуляторных сериновых протеиназ могут служить каскад свертывания крови, система комплемента, энтеропептидаза. Последняя, как считается, находится на вершине каскада пищеварительных ферментов, однако и она экспрессируется на поверхность дуоденальных энтероцитов в виде одноцепочечного предшественника и, очевидно, требует к себе внимания какого-то другого фермента-активатора, так как ее сайт активации плохо поддается автокатализу, а активация с помощью других ферментов пищеварительной системы нарушила бы стройную регуляторную систему.
Обычно регуляторные протеиназы специфичны по более длинным сайтам узнавания, которые включают в себя несколько остатков белкового субстрата, связывающихся в определенной конформации с определенными сайтами фермента, В большинстве своем эти сайты связывания расположены в непосредственной близости от активного центра -каталитической триады в случае сериновых протеиназ. Кроме того, в некоторых случаях, видимо, происходит связывание в более отдаленных участках, как, например, в случае энтеропептидазы, при укорачивании тяжелой цепи которой до определенного размера происходит значительное снижение скорости расщепления трипсиногена. Специфичность сериновых протеиназ обычно можно объяснить топологией субстрат-связывающих сайтов в непосредственной близости от каталитической триады («щель активного центра») [38-40]. Однако, хотя с этой точки зрения специфичность рассматривается как различие в связывании субстратов, обычно она выражается через скорости химической трансформации.
Сайты распознавания субстрата включают в себя сайт связывания полипептидной цепи и карманы, связывающие боковые цепи пептидного субстрата. Исследование специфичности протеиназы в общем случае сфокусировано на взаимодействии Pj/Si (по номенклатуре Шехтера и Бергера [44], где Р]-РГ обозначают пептидные остатки на ацильной и уходящей сторонах разрезаемой связи, соответственно. Прилегающие пептидные остатки пронумерованы от разрезаемой связи, и S, Si и т.д. обозначают соответствующие сайты связывания фермента), после чего рассматривают P2-Pn/S2-Sn взаимодействия. Si -Sn сайты обычно упускают из рассмотрения из-за превалирования методов использующих субстраты с уходящей хромофорной группой. Кроме того, на связывание субстрата часто влияют регуляторные домены [43].
Специфичность химотрипсин-подобных сериновых протеиназ обычно классифицируют по P-Si взаимодействию [41, 44], Si сайт представляет собой карман, прилегающий к Serl95, образованный остатками 189-192, 214-216 и 224-228 (по химотрипсиновой нумерации, предложенной Краутом [42]). Специфичность обычно определяется остатками в положениях 189, 216 и 226 [38, 40]. Например, специфичность химотрипсина соответствует большим гидрофобным остаткам Pi с 50000-кратным предпочтением Phe перед Ala [45,46], Комбинация Serl89, GIy216 и Gly226 создаст глубокий гидрофобный карман в химотриисине, отвечающий за его специфичность [41]. Asp 189, Gly216 и Gly226 создают отрицательно заряженный Si сайт отвечающий за специфическое расщепление трипсином субстратов с Arg или Lys в Р положении [47,48]. Эластаза предпочитает субстраты с малыми алифатическими остатками в положении Р: S!-сайт эластазы меньше, чем Si сайты химотрипсина и трипсина из-за Val216 и Thr226 [49], Специфичность гранзима В к кислым остаткам в положении Pi объясняется Arg226 [50]. Эти наблюдения предполагают, что специфичность этих протеиназ контролируется небольшим набором структурных элементов. Тем не менее, как поясняется ниже, простая замена этих структурных элементов не переключает специфичность Si сайта.
Удаленные взаимодействия экранируют каталитическую триаду от растворителя
Приготовление компетентных клеток Е. cod, а также их трансформацию плазмидной ДНК проводили по методике RF1/RF2 трансформации: Методика КР1/КР2-трансформации
Несколько свежих колоний, выращенных на чашке со средой LB, ресуспеидировали в 1 мл среды SOB и засевали в 100 мл той же среды. Клетки инкубировали при 37 С и хорошей аэрации до достижения культурой ранней логарифмической стадии роста. Культуру переносили в пробирки и охлаждали во льду в течение 15 мин, затем осаждали центрифугированием в течение 15 мин при lOOOg и 4 С и тщательно удаляли супернатант. Осадок ресуспеидировали в 1/3 от исходного объема клеточной суспензии буфером RF1: 100 мМ LiCl, 50 мМ МпС12, 30 мМ ацетата калия, 10 мМ СаСЬ, 15% (вес/объем) глицерин, рН 6.8, и выдерживали на льду 15 мин. Обработанные таким образом клетки расфасовывали по 100 мкл и замораживали в жидком азоте. Приготовленные компетентные клетки хранили при -70 С в течение 6-9 месяцев, при этом существенного снижения эффективности трансформации не наблюдалось.
К 100 мкл компетентных клеток добавляли 5-30 нг плазмидной ДНК, хорошо перемешивали и инкубировали во льду в течение 30 мин. Затем клетки подвергали тепловому шоку в течение 90 сек при 42 С, после чего вновь помещали в лед и инкубировали 4-5 мин, К клеточной суспензии добавляли 400 мкл среды SOB и растили в течение 45 мин при 37 С и хорошей аэрации. Затем клетки высевали по 100 мкл на чашки с селективной средой.
Выделение плазмидной ДНК проводиле по методике минипрепаративного выделения ДНК. Одиночными колониями трансформированный клеток штамма Е. coli XL-1 Blue инокулировали 10 мл среды LB с антибиотиком, После инкубации в течение 8-16 часрв при 37 С с перемешиванием 250 об/мин биомассу клеток Е. coli осаждали центрифугированием в течение 5 мин при 10000g. Далее процедура проходила по методике QiaQuik Spin Miniprep (Qiagen, Германия).
Электрофоретический анализ плазмидной ДНК и ее фрагментов проводили в 0.8-1.2% агарозных гелях в присутствии бромистого этидия с конечной концентрацией 0.5 мкг/мл. Электрофорез проводили при напряженности электрического поля 5-7 В/см, в качестве электродного буфера использовался трис-боратный буфер (89 мМ трис, 89 мМ борной кислоты, 2.5 мМ ЭДТУ, рН 8,3). Полученная картина анализировалась с помощью трансиллюминатора Vilber Lourmat TFP-M/WL.
Количественные измерения препаратов ДНК проводили (!) спектрофотометрически и (2) путем сравнения интенсивности флуоресценции бромистого этидия в исследуемом образце и в стандартном образце с известной концентрацией, В первом случае измеряли поглощение растворов при длине волны 260 им, что позволяло рассчитать концентрацию ДНК в образце. При этом считали, что оптическая плотность D=l соответствует 50 мкг/мл двуцепочечной ДНК и 20 мкг/мл олигонуклеотидов, С помощью отношения величин D, измеренных при 260 и 280 нм определяли степень загрязненности препаратов ДНК примесями РНК и белков. Для определения малых количеств ДНК использовался второй метод - визуального сравнения флуоресценции образца и серии стандартов.
Выделение плазмидной, а также фрагментироваш-юй ДНК из агарозных гелей проводили согласно инструкции к набору QiaQuik Gel Extraction Kit (Qiagert, Германия). Секвеыирование ДНК проводилось на приборе ABI Prism 3 (Applied Biosciences, США) в Центре «Биоинженерия» РАН. В качестве праймеров брались в зависимости от задачи следующие олигонуклеотиды: Т7 promoter primer, Т7 terminator primer, Trxag primer, синтезированные в Учебно-Научном Центре ИБХ РАН с последовательностями, идентичными праймерам, предлагаемым Novagen (США).
Последовательность ДНК, кодирующая L-HEP (705 пар оснований), была синтезирована из 26 олигонуклеотидов (длиной 35-43 пар каждый) с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР). Первый олигонуклеотид дополнительно кодировал сайт узнавания энтеропептидазы и сайт рестрикции Bgl II на 5 -конце. К последнему олигонуклеотиду добавляли сайт рестрикции Hind III на 5 -конце. Кодоны, имеющие низкую эффективность экспрессии в прокариотах, были заменены согласно таблице встречаемости прокариотических кодонов [106]. Все олигонуклеотиды имели по 12-14 перекрывающихся нуклеотидов на обоих концах. ПЦР проводили в два этапа. На первом этапе две половины гена (первая содержала олигонуклеотиды 1-14 и вторая - 13-26) синтезировали в раздельных реакциях. В обоих случаях для ПЦР брали 50 пмоль первого и последнего олигонуклеотидов и по 2,5 пмоль всех остальных олигонуклеотидов в конечном объеме 100 мкл. ПЦР проводили, нагревая смесь до 95 С 5 мин и, затем, повторяя 20 циклов, состоящих из инкубации при 95 С в течение 30 сек, при 46 С в течение 30 сек и при 72 С в течение 45 сек.
Штаммы иплазмидиые вектора
Молекулярную динамику (МД) исследуемых белков проводили с помощью программного пакета GROMACS 3.2 (Herman Berendsens group, department of Biophysical Chemistry of Groningen University, Германия) [116,117]. Молекулы белков заключали в призматической ячейке со стенками, удаленными от молекулы на 1 нм. Пространство ячейки, не занятое белком, заполнялось молекулами воды (модель SPC216), кроме того, суммарный заряд ячейки нейтрализовался замещением части молекул воды необходимым количеством одновалентных ионов. Использовалось силовое поле GROMOS87. Проводилась минимизация энергии в ячейке в три этапа: с «замороженным» белком, с «замороженной» основной цепью бела и без «замороженных» групп атомов. Минимизация осуществлялась методом быстрого спуска, используя 300 итераций с шагом 0.01 нм. На первом этапе критерием минимума служило достижение минимума максимальной действующей силы в 0.1, на втором - 0.01, и на третьем - 0.001 кДж-моль ! Нм \ Далее в течение 5 пс проводили МД воды с «замороженным» белком, после чего белок нагревали в течение 60 пс от 0 до 300 К. После этого проводили МД всей системы в течение 5-15 не. В ячейке поддерживались постоянные температура и давление (по методу Берендсена, [118]). Шаг интегрирования динамики брался равным 2 фс, координаты и энергия записывались каждые 1000 шагов, скорость - каждые 10000 шагов. Подсчет ван-дер-ваальсовых взаимодействий ограничивали радиусом действия 1.4 нм, электростатические взаимодействия считали с помощью метода РМЕ (Particle-Mesh Ewald electrostatics, «частица-ячейка + суммы Эвальда», заряды приписываются узлам решетки, для чего используется основная В-сплайновая интерполяция) [119].
Полученные мутантные варианты L-HEP оценивались следующим образом. Заполненность внутреннего пространства молекулы оценивалась визуально и/или оценкой перекрывания мутированного остатка с окружающими атомами (модуль Homology). Качество включения мутированного аминокислотного остатка в данную вторичную структуру и микроокружение в белковой молекуле оценивали с помощью компьютерной программы Profile-3D, по методу, разработанному группой D. Eisenberg [120]. В основе этого метода - расчет критерия "совместимости" между некоторой аминокислотной последовательностью и данной пространственной структурой белка. Производится редукция трехмерной структуры до ее упрощенного одномерного описания, называемого "строкой окружения" (или ЗО-лрофилем), которая затем сравнивается с исследуемой последовательностью аминокислотных остатков. Метод с высокой чувствительностью выявляет белки, обладающие сходным фолдом, в тех случаях, когда не удается установить их сходство только по аминокислотной последовательности, Подход также применяется для проверки качества гипотетических пространственных структур белков (моделей). При этом измеряется "совместимость" модельной структуры с собственной аминокислотной последовательностью.
Для заданной трехмерной структуры белка программа вычисляет одномерную строку характеристик окружения остатков. Характеристики окружения каждого остатка вычисляют по площади его боковой цепи, встроенной в белок; доли площади боковой цепи, находящейся в контакте с полярными атомами; и локальной вторичной структуре. По этим показателям остатки относят к одному из 18 классов микроокружения. Авторами метода из анализа выборки кристаллических структур из PDB была оценена вероятность находиться в том или ином классе микроокружения для каждого вида аминокислотных остатков, т.е. была получена таблица вероятностей размером 20x18.
ЗБ-профиль каждого мутантного варианта усреднялся в каждом положении полипептидной цепи по отрезку, захватывающему два предшествующих и два последующих остатка. В случае, когда замены аминокислотных остатков приводили к отрицательным значениям ЗБ-профиля, мутантный вариант исключался из дальнейшего рассмотрения.
Варианты с наиболее «удачными» заменами подвергались молекулярно-динамическому исследованию. Для молекулярной динамики всех структур использовался программный пакет GROMACS. Для L-HEP и ее мутантных вариантов были сняты траектории по 15 не. Для всех траекторий были посчитаны среднеквадратичное отклонение от начальной структуры (СКО) и среднеквадратичные флуктуации от усредненной структуры (СКФ) суммарно для всего белка и отдельно для групп остатков. Контроль сохранения вторичной структуры в динамике осуществляли с помощью программы DSSP [121]. Кроме того, из траектории в нескольких точках экспортировались структуры белка для наглядного сравнения с исходной структурой в программе визуализации. 3.2.18. Моделирование взаимодействий L-BEP, L-HEP и ее мутантных вариантов с пептидными субстратами
За основу модели взаимодействия фермента с субстратом брался комплекс L-BEP с ковалентно связанным с ним ингибитором VD4K -хлорметаном. Для построения взаимодействия L-HEP с субстратом GD4K-na было проведено выравнивание L-BEP и L-HEP, молекула ингибитора копировалась в структуру L-HEP, с помощью модуля Builder проводились замены несовпадающих и добавление недостающих частей молекулы субстрата. После этого проводилась минимизация энергии комплекса с помощью описанной выше процедуры. Аналогичным образом получались модели комплексов мутантных вариантов L-HEP с GD4K-na и комплексы всех белковых структур с пептидами AAFR, AALR и EEIK. Расстояния между элсктрозаряженными остатками фермента и субстрата и длины образующихся между ферментом и субстратом водородных связей оценивали с помощью Insight П. Для качественного сравнения взаимодействия L-BEP, L-HEP и ее мутантных вариантов с одним из субстратов и одного определенного фермента с разными субстратами было проведено наложение пространственных структур путем их выравнивания по основной цепи фермента.
Для исследования взаимодействия различных вариантов энтеропептидаз с субстратами также использовались эксперименты по молекулярной динамике комплексов фермент/субстрат. С целью сохранения в течение МД-эксперимепта конформации триады Aspl02-His57-Serl95, близкой к наблюдаемой при катализе, был выбран субстрат глицил-тетрааспартил-лизил-изолейцин (GD4KI). МД параметры были взяты те же, что использовались в МД экспериментах по проверке стабильности мутантных вариантов L-HEP с заменой цистеинов. Ход динамики контролировался по СКО тяжелых атомов основных цепей фермента и субстрата, а также по визуальной оценке сохранения пространственной структуры комплекса с нахождением субстрата в активном центре фермента.
Ренатурация слитного белка Trx/L-HEP и очистка активного фермента L-HEP
В настоящей работе был получен активный препарат рекомбинантной легкой цепи энтеропептидазы человека высокой степени чистоты. Исходя из сложности сборки подобной протеиназы при использовании прокариотической системы экспрессии был выбран выриант производства целевого белка в виде единой пояипептидной цепи с тиоредоксином в нерастворимом виде для последующей его ренатурации. Использование схемы с дисульфидным обменом цистеинов белка с парой окисленный/восстановленный глутатионы (помогающей сборке белков с дисульфидными связями в эукариотических клетках) позволило получить достаточное для биохимических и физико-химических исследований количество высокоактивного фермента. Однако значительная трудоемкость и существенный расход материалов (реактивов) делают такую ренатурацию малоперспективной процедурой получения рекомбинантных белков. Для облегчения этой задачи была проведена оптимизация, затронувшая как процедуру ренатурации, так и структуру самого ренатурируемого белка. В результате удалось не только достичь почти десятикратного увеличения выхода ренатурации каталитической субъединицы энтеропептидазы, но и получить существенные результаты по влиянию на фолдинг белка некоторых структурных элементов. Эти результаты могут быть использованы при получении и исследованиях других сериновых протеиназ химотрмпсинового типа.
Важнейшей характеристикой регуляторных протеиназ, каковой является энтеропептидаза, считается специфичность по отношению к определенным пептидным последовательностям. Физиологическая роль энтеропептидазы с середины прошлого века предполагалась исключительно в активации трипсиногена. Обнаруженная при исследовании L-HEP побочная специфичность позволяет предположить существование иных мишеней у энтеропептидазы человека. Например, может существовать белок-мишень, подобный TRAIL, у которого энтеропептидаза способна расщепить одну из экспонированных на поверхность белка петель, что может привести к блокированию сигнала. Другой результат подобного изменения специфичности - появление нестрогого соблюдения иерархии в каскаде пищеварительных ферментов. Расширение специфичности энтеропептидазы может позволить ей как активацию других зимогенов панкреатического сока, помимо трипсиногена, так и более значительное участие в переваривании белковой составляющей пищи, особенно при денатурации последней. Возможно, такой эволюционный шаг требуется для улучшения пищеварения всеядных млекопитающих (человека, свиньи). Либо, наоборот, травоядность быка потребовала более высокорегулированного каскада пищеварительных протеиназ, опосредованного более высокоспецифичной энтеропептидазой в его корне.
Полученные результаты влияния различных участков субстрат-связывающего центра энтеропептидазы на гидролиз субстратов позволили не только выявить конкретные структурные различия, приводящие к отличиям в специфичности ферментов человека и быка по отношению к различным субстратам, но и сделать вывод об их недостаточности для полного обоснования этой разницы. Так как фермент человека более активно гидролизует все рассмотренные субстраты, вне зависимости от остатков Рг-Рц, логично предположить, что одно из главных различий L-HEP и L-BEP кроется в структуре активного центра. Его устройство чрезвычайно тонко: десятые доли ангстрема в расстояниях между остатками каталитической триады, оксианионной дыры и субстратом играют большую роль; поэтому даже небольшие изменения в укладке ядра молекулы фермента могут привести к серьезному изменению эффективности работы каталитической машины. Подобные перемещения ее элементов особенно должны влиять на расщепление амидной связи, так как для уменьшения ее жесткости при образовании тетраэдрическото интермедиата необходимо идеальное взаиморасположение субстрата и всех элементов активного центра. Исследование двух ферментов с практически одинаковыми структурами, но отличающимися параметрами катализа может значительно прояснить сам процесс катализа, который до сих пор не имеет однозначного объяснения. Другая возможная причина обнаруженного различия - это влияние связывания субстрата в отдаленных от расщепляемой связи сайтах на его гидролиз не через простое увеличение сродства, а более сложными путями, каковыми считаются изменения внутреннего движения фермента и реорганизация обширной сети водородных связей, в которую входят и связи, непосредственно влияющие на процесс ферментативного катализа. В частности, преимущество L-HEP может быть связано с большей сопряженностью энергии водородных связей (или опосредуемых этими связями структурных изменений комплекса), образуемых петлей 216-220 и основной цепью субстрата, с каталитическим процессом.
Для подтверждения или опровержения этих гипотез необходимо накопление статистических данных по разным ферментам, включая параметры катализируемых ими реакций, моделирование динамики их взаимодействий с различными субстратами, кристаллографические данные и др. Однако несомненным фактом является то, что получение подобной информации для одного фермента (чему посвящена данная работа) указывает направление исследований и может способствовать изучению других ферментов.
