Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 9
1.1. Каталитические характеристики и субстратная специфичность ОРН 9
1.2. Полигистидинсодержащие белки и носители для их иммобилизации
1.2.1. Полигистидинсодержащие белки 15
1.2.2. Полигистидинсодержащие производные органофосфатгидролазы 16
1.2.1. Носители для иммобилизации polyHis-содержащих белков 18
1.3. Биокатализаторы на основе иммобилизованной ОРН и её производных 23
1.4. Фосфонаты и методы их деструкции
1.4.1. Химическая детоксификация ФОВ: проблема и методы её решения 37
1.4.2. Деструкция С-Р связи в фосфоновых кислотах и их производных
1.4.2.1. Щелочной и кислотный гидролиз 40
1.4.2.2. Деструкция С-Р связи в фосфонатах с использованием металлокомплексов 44
1.4.2.3. Окислительное разрушение С-Р связи в фосфонатах 44
1.4.2.4. Термическое разложение метилфосфоновой кислоты 46
1.4.2.5. Биодеструкция С-Р связи в фосфонатах 48
2. Материалы и методы 57
2.1. Материалы 57
2.1.1. Реактивы 57
2.1.2. Используемые бактериальные штаммы 58
2.1.3. Питательные среды 58
2.1.4. Составы растворов 59
2.1.5. Приборы 59
2.2. Методы 59
2.2.1. Трансформация компетентных клеток 59
2.2.2. Биосинтез фермента His 12-ОРН 60
2.2.3. Биосинтез фермента His6-OPH 60
2.2.4. Получение носителей для металл-хелатирующсй хроматографии 61
2.2.5. Получение иммобилизованных препаратов органофосфатгидролазы, модифицированных полигистидиновыми последовательностями 61
2.2.6. Электрофоретический анализ белков в ПААГ 62
2.2.7. Определение концентрации белка
2.2.8. Кинетические исследования реакции гидролиза Параоксона, катализируемой polyHis-аналогами ОРН в растворимой форме 63
2.2.9. Кинетические исследования реакции гидролиза Параоксона, катализируемой polyHis-аналогами ОРН в иммобилизованной форме
2.2.10. Исследование температурного оптимума действия polyHis-аналогов ОРН в растворимой и иммобилизованной формах 65
2.2.11. Термоинактивация растворимых и иммобилизованных polyHis-аналогов ОРН 66
2.2.12. Изучение операционной стабильности биокатализагоров на основе иммобилизованных polyHis-аналогов ОРН 66
2.2.13. Получение и регидратация сухих иммобилизованных препаратов polyHis-аналогов ОРН 66
2.2.14. Электронная микроскопия криоПААГ 66
2.2.15. Кинетические исследования реакций гидролиза фосфонатов, катализируемых His6-OPH в растворимой форме 67
2.2.16. Кинетические исследования реакций гидролиза фосфонатов, катализируемых His6-OPH в иммобилизованной форме в защитном материале 61
2.2.17. Кинетические исследования реакций гидролиза фосфонатов, катализируемых His6-OPH в иммобилизованной форме в проточной системе 67
2.2.18. Определение концентрации фосфат-ионов 68
2.2.19. Определение концентраций МФК и муравьиной кислоты 69
2.2.20. Определение концентрации формальдегида 69
2.2.21. Определение концентрации метана 70
2.2.22. Определение концентрации метанола 70
2.2.23. Определение концентрации фосфонатов 71
2.2.24. Определение концентрации вещества типа Vx 72
3. Результаты и обсуждение 74
3.1. Белок Hisi2-OPH и его свойства в свободном и иммобилизованном состоянии 74
3.1.1. Биосинтез и иммобилизация белка Hisn-OPH 74
3.1.2. Влияние рН и температуры на каталитические характеристики Hisi2-OPH в растворимой форме 82
3.1.3. Каталитические характеристики His -OPH в растворимой форме 86
3.2. Свойства иммобилизованных биокатализаторов на основе His6-OPH и Hisi2-OPH..89
3.2.1. рН-зависимость активности иммобилизованных биокатализаторов 89
3.2.2. Влияние температуры на свойства иммобилизованных биокагализаіоров 3.2.3. Каталитические характеристики иммобилизованных биокатализаторов в отношении различных субстратов 92
3.2.4. Стабильность иммобилизованных биокатализаторов при хранении и периодическом использовании 102
3.2.5. Получение сухих форм иммобилизованных биокатализаторов 105
3.2.6. Исследование возможности масштабирования объёма иммобилизованного биокатализатора 106
3.3. Применение растворимой и иммобилизованной форм Нівб-ОРН в процессе гидролиза фосфонатов 111
3.3.1. Растворимая форма His6-OPH в реакциях гидролиза фосфонатов 111
3.3.1.1. Каталитические характеристики гидролиза ИБЭМФК и ДИБЭМФК под действием His6-OPH Ill
3.3.1.2. Каталитические характеристики гидролиза МФК под действием Нівб-ОРН 113
3.3.1.3. Кинетическая модель процесса ферментативного гидролиза различных ФОС в составе РМ, полученных после химической детоксификации вещества типа Vx 115
3.3.1.4. Ферментативный гидролиз ФОВ в составе РМ, полученных после химической детоксификации вещества типа Vx 125
3.3.1.5. Ферментативный гидролиз ФОС в составе РМ, полученных после химической детоксификации вещества типа Vx 126
3.3.1.6. Механизм реакции гидролиза МФК под действием His6-OPH 128
3.3.2. Иммобилизованная His6-OPH в реакциях разложения фосфонатов 132
3.3.2.1. Иммобилизованная His6-OPH в составе защитного материала 132
3.3.2.2. Разложение фосфонатов в проточных системах под действием иммобилизованных биокатализаторов 135
Выводы 138
Список литературы
- Полигистидинсодержащие производные органофосфатгидролазы
- Используемые бактериальные штаммы
- Изучение операционной стабильности биокатализагоров на основе иммобилизованных polyHis-аналогов ОРН
- Кинетическая модель процесса ферментативного гидролиза различных ФОС в составе РМ, полученных после химической детоксификации вещества типа Vx
Введение к работе
Актуальность темы. Деградация токсичных веществ, привносимых человеком в окружающую среду, формирует комплекс научных, технических, экологических, социальных и экономических проблем. Решение задачи разложения нейротоксичных фосфорорганических соединений (ФОС), к числу которых относятся применяемые в сельском хозяйстве пестициды, а также фосфорорганические отравляющие вещества (ФОБ), имеет большое значение и весьма актуально, поскольку сотни тысяч тонн этих веществ подлежат детоксификации.
В настоящее время разложение ФОС осуществляется путём их сжигания при 700С или обработкой щелочными агентами, что является неэкологичным решением проблемы. Запасы ФОВ, которые, согласно Международной конвенции об уничтожении химического оружия, должны быть уничтожены на территории России, составляют 32,3 тыс. т, половина из которых представлена наиболее токсичным веществом типа Vx (15,5 тыс. т). Согласно принятым в РФ методам уничтожения ФОВ, остаточные концентрации ФОВ в получаемых реакционных массах (РМ) достигают 0,1 мас.%, кроме того, продукты разложения ФОВ также являются токсичными для человека. Дальнейшая детоксификация образующихся РМ является крайне важной задачей, поскольку конечный продукт разложения должен соответствовать нормативам токсикологической и экологической безопасности, а это означает, что разложение фосфонатов, как наиболее токсичных компонентов РМ, должно быть максимальным.
Детоксификация различных ФОС с помощью биокаталитических систем имеет ряд преимуществ, а именно: она проходит в мягких условиях, и продукты гидролиза, как правило, являются биологически деградируемыми. В связи с этим особый интерес представляют ферменты, гидролизующие ФОС. Было установлено, что на сегодняшний день наиболее активным ферментом, осуществляющим биодеструкцию ФОС, является органофосфатгидролаза (ОРИ, ЕС 3.1.8.1), катализирующая гидролиз Р-О, P-S и P-F связей в производных ортофосфорной и фосфоновой кислот.
Актуальной научно-практической задачей представляется разработка иммобилизованных ферментных препаратов с ОРН-активностью для детоксификации ФОС в проточных системах на муниципальных и сельскохозяйственных очистных сооружениях. Использование металл-хелатирующих носителей не столько для выделения и очистки, сколько для иммобилизации ферментов, содержащих дополнительно введённую аминокислотную последовательность, вступающую в аффинное взаимодействие с носителем, может стать перспективным способом для получения иммобилизованных препаратов ОРН. Прочное координационное связывание фермента с носителем делает такую систему удобной для использования её в проточных режимах в процессах разложения ФОС, что в технологическом плане, несомненно, имеет важное значение.
Известно, что ферментативный гидролиз ФОВ может осуществляться в составе РМ. Однако до сих пор остаётся неизученной возможность гидролиза
фосфорсодержащих продуктов разложения ФОВ в составе РМ под действием ОРН, используемой в свободной или иммобилизованной форме.
Целью данной работы была разработка биокатализаторов для разложения фосфорорганических пестицидов, ФОВ и продуктов химической нейтрализации ФОВ, на основе ОРН, модифицированной полигистидиновыми (polyHis-) последовательностями и иммобилизованной на макропористых металл-хелатирующих носителях, представляющих собой полиакриламидный криогель (криоПААГ), модифицированный остатками иминодиуксусной кислоты (IDA) и
заряженный ионами металлов (Си или Со ).
Для достижения основной цели в работе необходимо было решить ряд основных задач:
определить влияние длины polyHis-последовательности, введённой на N-конец молекулы ОРН, на свойства белка в свободном и иммобилизованном виде на примере ОРН, модифицированной последовательностями, содержащими шесть (His6-OPH) и двенадцать (Hisn-OPH) остатков гистидина;
разработать и исследовать физико-химические и каталитические характеристики биокатализаторов на основе иммобилизованных полигистидинсодержащих производных ОРН для детоксификации ФОС в проточных системах;
исследовать возможность гидролиза метилфосфоновой кислоты (МФК) и её эфиров, являющихся продуктами химического разложения ФОВ, взятых в чистом виде, а также в составе РМ, полученных в результате химического уничтожения отравляющего вещества типа Vx, под действием His6-OPH в свободном и иммобилизованном состоянии.
Научная новизна работы. Впервые показано влияние длины polyHis-последовательности, вводимой на N-конец молекулы ОРН, на каталитические и физико-химические характеристики белка; выявлена склонность к олигомеризации фермента, содержащего НІ8і2-последовательность.
Показана возможность высокоэффективной иммобилизации ОРН, содержащей генетически введённую polyHis-последовательность различной длины на N-конец молекулы белка, на металл-хелатирующих носителях за счёт координационных взаимодействий, и исследованы их каталитические характеристики в проточной системе.
Впервые установлена гидролитическая активность His6-OPH в отношении моно- и диэфира МФК, а также самой МФК, и определены каталитические константы действия фермента в реакциях с этими субстратами. Предложен механизм действия His6-OPH в реакции разрыва С-Р связи в МФК.
Предложена кинетическая модель, адекватно описывающая поведение His6-ОРН в процессах детоксификации фосфонатов в РМ, получаемых после уничтожения ФОВ химическими методами и представляющих собой многосубстратные смеси.
Новизна и практическая значимость полученных результатов подтверждена 3 Патентами РФ и 1 Заявкой на Патент РФ.
Практическая значимость работы. Разработаны высокоэффективные иммобилизованные биокатализаторы на основе polyHis-производных ОРН и IDA-
криоПААГ, позволяющие гидролизовать различные фосфорорганические субстраты в широком диапазоне рН (7-12) и температуры (20-55С) при скорости протока до 480 мл/ч.
Показано, что иммобилизованные биокатализаторы могут длительно храниться (как минимум 900 сут.) и применяться (как минимум 500 сут.), многократно регенерироваться, а также возможно масштабирование объёмов получаемых образцов иммобилизованных биокатализаторов.
Установлена высокая эффективность разложения производных МФК в составе РМ, получаемых в результате химического уничтожения вещества типа Vx, под действием фермента His6-OPH в свободной и иммобилизованной форме.
Разработанные иммобилизованные биокатализаторы могут найти практическое применение: а) в системах очистки питьевой и речной воды, а также сельскохозяйственных сточных вод от фосфорорганических пестицидов; б) в биотехнологических схемах по уничтожению запрещённых к использованию или устаревших фосфорорганических пестицидов; в) в процессах биоразложения токсичных фосфорорганических компонентов РМ, полученных после химического уничтожения вещества типа Vx.
Основные положения, выносимые на защиту:
Увеличение длины polyHis-последовательности в молекуле ОРН приводит к появлению у белка склонности к олигомеризации, что существенно влияет на каталитические характеристики растворимой формы фермента.
Иммобилизованные биокатализаторы на основе polyHis-производных ОРН, полученные за счёт их координационного связывания с металл-хелатирующим
9+ 9+
носителем IDA-криоПААГ, заряженным ионами Си или Со , могут быть использованы для гидролиза ФОС в проточных системах.
3. Фермент His6-OPH в растворимой и иммобилизованной форме проявляет
каталитическую активность в отношении МФК, а также её моно- и диэфиров.
Связь работы с крупными научными программами и проектами. Представленные результаты были получены в 2005-2009 гг. в рамках следующих программ и проектов, участником которых был соискатель: Госконтракты с Федеральным управлением по безопасному хранению и уничтожению химического оружия МО РФ «Исследование возможности использования метода биодеградации для переработки реакционных масс, образующихся при уничтожении отравляющих веществ», шифр «Богема» (2004-2006); «Оптимизация технологических параметров процесса переработки реакционных масс, образующихся при уничтожении фосфорорганических отравляющих веществ, методом биодеградации», шифр «Биозащита» (2007-2008); Госконтракт с Федеральным агентством по науке и инновациям «Ферменты и биокаталитические системы для ремедиации окружающей среды» (2005-2006); НАТО грант CBP.NRCLG.981752 «Химерные белки для разложения фосфорорганических нейротоксинов» (2005-2007); грант РФФИ 08-04-12050-офи «Новый тип высокоэффективных биокатализаторов для обнаружения и обезвреживания фосфорорганических токсикантов» (2008-2009).
Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были представлены на: Междунар. конф. «Проблемы био деструкции техногенных загрязнителей окружающей среды» (Саратов, Россия, 2005); VI Междунар. конф.
«Проблемы загрязнения окружающей среды» (Пермь-Казань-Пермь, Россия, 2005); 5-й, 7-й и 8-й Ежегод. междунар. конф. ИБХФ РАН - ВУЗы (Москва, Россия, 2005, 2007, 2008); Inter. Conf. «Environmental Biocatalysis: From remediation with enzymes to novel green processes» (Cordoba, Spain, 2006); Междунар. конф. «Генетика микроорганизмов и биотехнология» (Москва-Пущино, Россия, 2006); 10-й, 12-й Междунар. Пущин, конф. молод, учен. «Биология. Наука XXI века» (Пущино, Россия, 2006, 2008); Inter. Workshop «New technologies in medicine and experimental biology» (Pattaya-Bangkok, Thailand, 2007); 4-м Москов. междунар. конгр. «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, Россия, 2007); Междунар. конф. «Биокатализ - 2007: структура, функции, применение» (Москва-Санкт-Петербург, Россия, 2007); XV Inter, workshop on Bioencapsulation (Vienna, Austria, 2007); XVIII Менделеев, съезде по общ. и прикл. хим. (Москва, Россия, 2007); 1-й, 2-й и 3-й Междунар. науч. конф. «Актуальные проблемы биологии, нанотехнологий и медицины» (Ростов-на-Дону, Россия, 2007, 2008, 2009); III Междунар. конф. «Микробное разнообразие: состояние, стратегия сохранения, биотехнологический потенциал» (Пермь-Н.Новгород-Пермь, Россия, 2008); 4-й Науч.-практ. конф. «Научно-технические аспекты обеспечения безопасности при уничтожении, хранении и транспортировке химического оружия» (Москва, Россия, 2008); 6-й Междунар. конф. «Сотрудничество для решения проблемы отходов» (Харьков, Украина, 2009); Inter. Conf. «Biocatalysis-2009: Fundamentals & Applications» (Arkhangelsk, Russia, 2009); XVII Inter, workshop on Bioencapsulation (Groningen, Netherlands, 2009).
Личный вклад автора. Автору принадлежит планирование экспериментов, непосредственное участие в них, анализ и обобщение полученных результатов, а также подготовка научных публикаций.
Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 7 статей, в том числе 2 обзора и 5 экспериментальных статей, из них 4 включены в список ВАК; 3 Патента РФ; 1 заявка на получение Патента РФ и 24 тезиса докладов на международных конференциях, конгрессах и симпозиумах.
Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа содержит 152 страницы печатного текста, 77 рисунков, 26 таблиц, 155 ссылок.
Полигистидинсодержащие производные органофосфатгидролазы
Использование различных ферментов на практике всегда в первую очередь ставит вопрос об их источниках получения и необходимой степени очистки. Получение белков высокой степени очистки в настоящее время широко распространено в фундаментальных и прикладных исследованиях. Зачастую это становится возможным за счёт применения полипептидных последовательностей, генетически вводимых в молекулу целевого белка, и дальнейшей иммобилизации на различных носителях, аффинных к данным последовательностям. Для выделения такие белки далее обычно элюируют с носителей, однако, возможно их использование в иммобилизованном состоянии, то есть без удаления с носителя [28].
На данный момент исследователями для выделения белков использовано большое число таких последовательностей: полиаргининовая (Argag), полигистидиновая (Hisag), целлюлозо-связывающая (CBDag), хитин-связывающая (ChBDag), глутатион S-трансферазная (SjGSTag) и другие [14]. Использование короткоцепочечных последовательностей с малой молекулярной массой и правильный выбор её локализации в молекуле белка (С- или N-конец) в большинстве случаев позволяет избежать изменения свойств фермента [29]. Наиболее часто исследователями применяются следующие короткие аминокислотные последовательности: Argag, Hisag, FLAGag, Strepag, c-mycag, Sag [14].
Использование последовательностей с большой молекулярной массой для генетической модификации белков предполагает их удаление после выделения и очистки фермента, для этого между белком и аминокислотной последовательностью необходимо присутствие дополнительной последовательности, узнаваемой протеазами [28].
Следует также заметить, что выбор той или иной дополнительно вводимой в молекулу белка аминокислотной последовательности зависит также от свойств самого белка и целей, которые в конечном итоге необходимо достигнуть, а именно: проведение высокоэффективной очистки белка, увеличения его растворимости или проведения успешной иммобилизации. Наиболее часто используемой на данный момент аминокислотной последовательностью является polyHis-последовательность.
Чаще всего polyHis-последовательность, используемая для модификации белков, содержит шесть остатков гистидина. Было сконструировано более 200 белков, включая ферменты, факторы транскрипции, антигены, мембранные белки и др. с использованием этой последовательности [30-32]. В большинстве случаев введение His6-последователыюсти в состав молекулы белка не оказывало влияния на каталитические свойства ферментов. Нізб-последовательность была помещена как на N-, так и на С-конец рекомбинаптных белков напрямую [33-35] или через дополнительно введённый линкер [36-37].
Так, глутатион-8-трансфераза (SjGST) из клеток Schistosoma japonicum была модифицирована введением Нізб-последовательности на С-конец белка и синтезирована в клетках E.coli [38]. Нативный и Нізб-содержащий белок SjGST был очищен с помощью носителя, модифицированного остатками глутатиона (GSH Sepharose 4В), и проведён сравнительный анализ каталитической активности. Было показано, что оба белка (нативный и Нізб-содержащий) имеют сходные каталитические характеристики.
Было показано, что введение Нізб-последовательности на N- или С-конец Р-галактозидазы из клеток Staphilococcus aureus не влияет на сродство фермента к субстрату [39].
В работе [36] была получена HRV-16 3D полимераза, содержащая Hise-последователыюсть на С-конце с предшествующим глицин-сериновым линкером. Плазмидой, кодирующей синтез данного фермента, были трансформированы клетки E.coli. Сравнение каталитических характеристик нативной и Нізб-содержащей HRV-16 3D полимеразы показало, что ферменты проявляют одинаковую каталитическую активность.
В ряде случаев введение в структуру белка polyHis-последовательности всё же влияет на свойства целевых белков, в частности, изменяются их каталитические характеристики [40-41], субстратная специфичность [41], растворимость [42] или способность образовывать олигомеры [43].
Например, леванфруктотрансфераза, модифицированная введением Иізб-последовательности на С-конец молекулы белка, имела свойства, отличные от нативного фермента, в частности, было отмечено отсутствие активности по ряду субстратов, но при этом в 10 раз увеличилась активность модифицированного фермента по сравнению с нативным по основному субстрату (левану) [41].
В связи с тем, что предвидеть изменение свойств polyHis-содержащих ферментов по отношению к их модифицированным аналогам заранее практически невозможно, обязательно необходимо проводить исследование влияния подобной модификации на их каталитические характеристики.
На сегодняшний день из литературы известно несколько результатов получения polyHis-содержащих производных ОРН. Так, для исследования процессов биосинтеза, выделения и очистки ОРН был создан гибридный белок, содержащий Hise последовательность, ОРН и зеленый флуоресцирующий белок (GFP). Было показано [44], что простым измерением флуоресценции модифицированной таким образом ОРН можно контролировать уровень ОРН-активности, а также следить за процессом выделения и очистки гибридного белка при использовании металл-хелатирующих носителей. Была получена конструкция His6-GFP-EK-OPH, при этом между GFP и ОРН был введён энтерокиназный сайт рестрикции для последующего выделения чистого фермента ОРН, поскольку было показано, что в составе гибридного белка с GFP активность ОРН резко понижается.
Ранее в группе микробной биохимии и биотехнологии кафедры химической энзимологии Химического факультета МГУ были получены две генетические конструкции для высокоэффективного биосинтеза производных ОРН, содержащих Hiso-последовательность на N- (Hiss-OPH) и на С-конце (OPH-His6) молекулы белка, в клетках E.coli [29,45].
При исследовании каталитических характеристик His6-OPH и OPH-His6 было установлено, что рН-оптимум их каталитической активности сместился в щелочную область до 10,5 по сравнению с нативной ОРН (рНопт 9,0), а также произошёл сдвиг изоэлектрической точки на 1,5 единицы [46]. Сравнение полученных данных с теми, что известны для ОРН (Табл.4) показало, что улучшилось сродство фермента по отношению к ряду исследованных ФОС, в частности, в отношении Паратиона и Метил-паратиона [29].
Используемые бактериальные штаммы
Иммобилизованные биокатализаторы на основе высокоочищенной ОРН, ковалентно иммобилизованной за счёт сшивающих агентов на различных типах найлона, как было показано, позволяют применять высокие скорости протока [69]. Ёмкость носителя по белку зависела от обрабатываемой площади его поверхности и типа используемого найлона: максимальные значения были достигнуты в случае использования мембраны из найлона-66 (Табл.7). Соответственно, максимальная активность иммобилизованного биокатализатора также была получена при использовании данного носителя. Из значения kcat следовало, что примерно 97% фермента инактивировалось в ходе самой иммобилизации. Носитель, используемый в данном иммобилизованном биокатализаторе, был способен адсорбировать большие количества гидрофобных субстратов и продуктов, а также создавал диффузионные затруднения для массообмена, что негативно сказывалось на эффективности действия биокатализаторов.
Было показано, что для получения иммобилизованных биокаїализаторов путём ковалентного связывания может быть использован и неочищенный препарат фермента [70]. В этом случае существенно упрощалась процедура иммобилизации, однако, низкая ёмкость пористого стекла по белку вместе со значительной инактивацией и без того небольшой активности фермента при его иммобилизации приводили к крайне низкой активности получаемых биокатализаторов. Стоит отметить, что с использованием данных биокатализаторов впервые была продемонстрирована возможность непрерывного гидролиза ФОС (Паратиона) в течение длительного периода времени (35 сут.), при этом их активность снижалась на 6% (Табл.7). В то же время низкая стабильность иммобилизованных биокатализаторов наблюдалась при их хранении при 6С, так что остаточная активность через 40 сут. составляла всего 40%.
Дальнейшее развитие данный подход получил в работе [71]. Простая процедура иммобилизации неочищенного фермента в силикагеле наряду с высокими скоростями протока позволили авторам говорить о возможном промышленном применении иммобилизованных биокатализаторов. Кроме того, при непрерывном гидролизе ФОС с использованием данных биокатализаторов в течение длительного периода времени (70 сут.) активность сохранялась на исходном уровне, в отличие от работы [70] (Табл.7). Помешала применению на практике разработанных иммобилизованных биокатализаторов их крайне низкая ферментативная активность. Помимо этого, хранение при 5С в течение 120 сут. приводило к 90%-ому снижению исходной активности.
В случае физической абсорбции неочищенного ферментного препарата в латексных микрочастицах также наблюдались проблемы с активностью получаемого иммобилизованного биокатализатора [72]. В данной работе ситуация значительно усугублялась чрезвычайно низкой ёмкостью носителя. В результате этого степень конверсии 0,34 мМ Параоксона составляла 37% (Табл.7). Кроме того, гидрофобный субстрат интенсивно абсорбировался носителем.
Прототип лабораторной установки для разложения ФОС в проточной системе был создан в работе [73]. В ней использовали двухфазную микроэмульсионную систему, в которой ОРН находилась в обращенных мицеллах. Эффективность данной установки была крайне низкой ввиду микромолярной концентрации фермента. В результате этого раствор субстрата приходилось пропускать циклически в замкнутом контуре в течение 12 ч. Это позволяло повысить степень конверсии 18 мМ Параоксона до 21% (Табл.7). Очевидно, что в данной системе наблюдались серьёзнейшие диффузионные затруднения для массопереноса субстрата из органической фазы в водную.
В работе [74] был разработан иммобилизованный биокатализатор, представляющий собой полиэлектролитный комплекс, содержащий ОРН и нанесённый на кремниевую подложку, на которой для увеличения площади поверхности литографически были сделаны микроканалы. Ввиду малых размеров скорость протока субстрата была очень низкой, и в то же время данный биокатализатор характеризовался крайне неудовлетворительной стабильностью: после 5 сут. оставалось всего 12% активности (Табл.7).
Использование гидрофобных взаимодействий для иммобилизации ОРН было осуществлено в работе [75]. В качестве носителя была использована агароза. модифицированная трифенилметильными остатками (третил-агароза). Было установлено, что иммобилизация повышает термостабилыюсть фермента по сравнению с растворимой формой. Также происходила стабилизация фермента в отношении действия органических растворителей, и в то же время часть фермента элюировалась при их пропускании через иммобилизованный биокатализатор. Было изучено влияние скорости протока на степень конверсии Параоксона, а также на каталитические константы иммобилизованного биокатализатора. Было показано, что с увеличением скорости протока происходит уменьшение степени конверсии субстрата, Кт и kcat (Табл.7). Авторы предположили, что возникают внешние и/или внутренние диффузионные затруднения. Следовательно, даже при максимальной скорости протока (70 мл/ч) иммобилизованный биокатализатор функционировал в неэффективном диффузиошго-контролируемом режиме. Другое предложенное объяснение заключалось в возможном влиянии стерических и конформационных эффектов гидрофобного окружения на активный центр фермента. Данный эффект не наблюдался в случае гомогенных биокаталитических систем. В данной работе было впервые проведено исследование каталитической - активности иммобилизованного биокатализатора на основе ОРН в отношении различных субстратов. Согласно полученным результатам, различные субстраты можно выстроить в следующий ряд в порядке уменьшения активности иммобилизованного фермента по отношению к ним: Параоксон = ДФФ Метил-паратион Паратион Кумафос. Этот ряд отличается от аналогичного для растворимой ОРН: Параоксон Паратион Кумафос Метил-паратион ДФФ [12]. Тем не менее, данные отличия никак не обсуждались авторами. Стоит отметить, что, кроме перечисленных недостатков, данный биокатализатор имел ограничения по скорости протока, допустимой при его использовании. Кроме того, происходила адсорбция гидрофобных субстратов на матрице носителя.
Гораздо меньшей активностью обладали биокатализаторы, полученные за счёт аффинных взаимодействий [28,76-78] (Табл.7). Так, в работе [76] была использована ОРН, содержащая кальмодулин (СаМ), генетически введённый на N-конец молекулы белка (СаМ-ОРН). В качестве носителя применяли целлюлозу, модифицированную остатками фенотиазина. с которыми СаМ-ОРН способен был специфически связываться. Низкая активность полученного иммобилизованного биокатализатора (Табл.7) была следствием катастрофического уменьшения активности ОРН за счёт введения гибридного партнёра (0,6 Ед/мг) [76]. Также стоит отметить, что, несмотря на наличие гибридного партнёра, фермент СаМ-ОРН перед иммобилизацией был очищен с использованием других методов.
Использование целлюлозы без её модификации оказалось возможным в качестве носителя для ОРН, содержащей генетически введённый гибридный партнёр целлюлозосвязывающий белок (CBD-OPH) [77]. Активность CBD-OPH была сравнима с ОРН. Стабильность получаемых иммобилизованных биокатализаторов зависела от типа используемой целлюлозы: Авицел А1 оказывала меньший стабилизирующий эффект по сравнению с CF11. В случае CF11 за 45 сут. хранения при 22С не происходило снижения исходной активности. В аналогичной работе [78] в таком же режиме хранения снижение активности составляло 5% (Табл.7). Кроме того, была показана возможность гидролиза Кумафоса, при этом с увеличением концентрации субстрата степень его конверсии уменьшалась.
Изучение операционной стабильности биокатализагоров на основе иммобилизованных polyHis-аналогов ОРН
Медленно во льду размораживали компетентные клетки, к 200 мкл клеточной суспензии добавляли 5-10 мкл плазмиды (1-10 нг ДНК). Смесь инкубировали во льду 40 мин, а затем проводили тепловой шок при 42С в течение 90 с, после чего быстро помещали пробирки в лед на 2 мин. Затем к каждой аликвоте трансформированных клеток добавляли по 800 мкл среды LB, содержащей 10 мМ MgCb, 10 мМ MgS04, 20 мМ глюкозы. Инкубировали при 37С в течение 1 ч. После этого клетки высевали на чашку Петри с агаризованной средой LB (1,7% бактоагара), содержащей 100 мг/л ампициллина. 25 мг/л канамицина и 0,4% глюкозы.
Для получения инокулята производили посев культуры петлей с чашек Петри в 100 мл среды LB, содержащей 100 мг/л ампициллина и 25 мг/л канамицина.
Для накопления биомассы клеток использовали жидкую питательную среду TYE, в которую добавляли СоСЬхбНгО до концентрации 23,7 мг/л. Перед посевом клеток в среду добавляли растворы ампициллина (100 мг/л) и канамицина (25 мг/л). 16-часовой инокулят вносили в колбу, содержащую 2000 мл полноценной питательной среды TYE, при достижении оптической плотности 0,6 при А.=540 нм, индуцировали синтез фермента добавлением ИПТГ в среду до конечной концентрации 0,25 мМ. Культуру растили при 28С и постоянном перемешивании (175 об/мин) в течение 19 ч.
Экспрессию фермента His6-OPH проводили с использованием экспрессионной системы, описанной в работе [8]. Для этого инокулировали 100 мл LB-среды, содержащей 100 мг/л ампициллина и 25 мг/л канамицина единичной колонией клеток, трансформированных плазмидой pTES-His6-OPH, с чашки Петри. Выращивали инокулят в течение 16 ч при температуре 28С в аэробных условиях (175 об/мин). Инокулировали 1000 мл TYE-среды, содержащей 100 мг/л ампициллина, 25 мг/л канамицина и 23,7 мг/л СоСЬхбНгО, 10 мл ночной культуры. Выращивали при 28С и интенсивном перемешивании (190 об/мин) до тех пор, пока оптическая плотность при X = 540 нм не достигнет 0,6, после чего добавляли индуктор ИПТГ до концентрации 0,25 мМ и выращивали культуру при температуре 28С в течение 20 ч.
Для синтеза криогелей на основе сшитого сополимера ІУ.ІУ-димешлакриламида с аллилглицидиловым эфиром в лаборатории проф. В.И. Лозинского была разработана следующая схема: водный раствор смеси ІЧТУ-диметилакриламида (ДМ А А) и N,N -метилен-бис-акриламида (МБАА) дегазировали, пропуская аргон. Далее к раствору добавляли аллилглицидиловый эфир (АГЭ). Суммарная концентрация сомономеров составляла 0,51 М. Затем раствор охлаждали в ледяной бане до 1-2С, добавляли необходимое количество инициирующей пары — смеси персульфата калия и N,N,N ,N -тетраметилэтилендиамина, после чего реакционную массу расфасовывали по 4 мл в 5-миллилитровые пластиковые шприцы, которые помещали в камеру криостага (FP 45 HP, Julabo, Германия) с температурой -12С.
Согласно разработанной схеме, была получена серия образцов криогелей с разным мольным соотношением ДМАА:АГЭ (9,5 +- 0,5; 9 + 1; 8 - 2; 7 - 3) при постоянных общей концентрации сомономеров и доли дивинильного мономера МБАА (10 мол.%).
После реакции образцы оттаивали при комнатной температуре и промывали 100-кратным объёмом дистиллированной воды. Далее через каждый образец криогеля пропускали 50 мл 0,5 М раствора ЫагСОз, 50 мл 1 М NaiCCb, 50 мл 0,5 М раствора IDA в 1 М ЫагСОз. Под раствором IDA образец оставляли на 24 ч при комнатной температуре. После чего через колонку пропускали 100 мл 0,5 М ИагСОз, а затем дистиллированную воду, чтобы довести рН до нейтрального значения. Далее через образец пропускали 10 мл 0,1 М раствора C11SO4X6H2O, после чего носители промывали дистиллированной водой до исчезновения окраски в элюате.
Иммобилизованные препараты модифицированной ОРН получали нанесением белковых препаратов, представляющих собой клеточный дезинтеграт, супернатант клеточного дезинтеграта после удаления из него клеточного дебриса и очищенные препараты ферментов. Полученную биомассу отделяли центрифугированием (6000 g, 15 мин), взвешивали и ресуспендировали в 50 мМ фосфатном буфере (рН 7,0), содержащем 300 мМ хлорида натрия, в соотношении 5 объёмов буфера на 1 г влажной биомассы. После этого клетки разрушали обработкой ультразвуком (частота 44 кГц) 6 раз по 45 секунд, между обработками биомассу выдерживали в течение 1 мин во льду. В результате этого получали клеточный дезннтеграт. Удаление клеточного дебриса из дезинтеграта осуществляли центрифугированием 15000 g в течение 20 мин. Белковые препараты наносили со скоростью 60 мл/ч на колонку (1x5 см) с макропористым носителем IDA-криоПААГ, предварительно заряженным ионами Со или Си и уравновешенным 50 мМ фосфатным буфером (рН 7,5), содержащим 300 мМ NaCl. Затем промывали колонку тем же буфером со скоростью 60 мл/ч до тех пор, пока оптическая плотность при АК280 нм становилась меньше 0,01. После этого промывали колонку элюирующим буфером до тех пор, пока оптическая плотность при Х=280 нм вновь становилась меньше 0,01. Промывали биокатализатор 50 мМ фосфатным буфером (рН 7,5), содержащим 300 мМ NaCl, и хранили при +8С.
Элюирование иммобилизованных белков с носителя проводили в линейном градиенте имидазола (0-0,4 М) в 50 мМ фосфатном буфере (рН 7,5), содержащем 300 мМ NaCl, со скоростью 60 мл/ч. Собирали фракции по 0,5 мл и анализировали их по белку и на присутствие ферментативной активности. Собранные фракции объединяли и диализовали против 10 мМ фосфатного буфера (рН 7,5) при 8С в соотношении объёмов 1:100. Внешний буфер меняли два раза. Диализовали фракции против 0,1 М карбонатного буфера (рН 10,5), содержащего 0,1 мМ СоСЬ, при 8С в соотношении объёмов 1:100 и концентрировали в 10 раз с использованием концентраторов Millex Millipore (20 кДа). Полученные очищенные ферменты хранили при +8С.
Кинетическая модель процесса ферментативного гидролиза различных ФОС в составе РМ, полученных после химической детоксификации вещества типа Vx
Согласно данным, представленным в литературном обзоре (п.п. 1.3), использование в качестве метода иммобилизации физической абсорбции фермента в матрице носителя является вполне достаточным для применения полученных материалов для защиты от воздействия ФОВ [79]. Однако открытым оставался вопрос о возможности разложения продуктов первичного гидролиза ФОВ иммобилизованным ферментом по аналогии с подобной активностью его растворимой формы. Для ответа на поставленный вопрос фермент His6-OPH был абсорбирован в полиметакрилатный гидрогель, на основе которого был разработан защитный материал, структура которого схематично представлена на Рис.76.
Верхний слой, обычно используемый в качестве изолирующего от проникновения отравляющих веществ в виде жидкости, представлял собой полиамидхлопчатобумажную ткань с полифторолефиновой или полиуретановой мембраной, обладающей олеофильными свойствами. Кроме непосредственно защиты от жидкостей ФОВ, применение данного материала обеспечивает равномерное распределение и дозировку ФОВ к следующему сорбирующему слою [154].
Средний слой являлся сорбирующим и самодегазирующимся. В качестве дегазирующего элемента использовался раствор фермента His6-OPH очищенного, а также неочищенного, введённого в буферной смеси в сорбент в различных концентрациях. В качестве носителя и сорбента применяли сшитый сополимер акриловой кислоты и акриламида, имеющий высокую степень иабухаемости (-3000). Таким образом, сорбент обладал колоссальной абсорбционной ёмкостью и был способен удерживать большие количества абсорбируемых веществ. В результате этого носитель, с одной стороны, позволял вводить различные количества фермента в сорбционный слой, а с другой -сорбент гарантировано удерживал буферный раствор с заданным значением рН в микроокружении фермента, создавая благоприятные условия для высокоэффективного ферментативного катализа.
Рис.76. Схема защитного материала на основе иммобилизованной His6-OPH: 1 - капли отравляющего вещества на поверхности материала; 2 - верхний изолирующий слой; 3 - слой, содержащий иммобилизованный фермент Hise-OPH; 4 — нижний гигиенический слой.
Нижний (гигиенический) слой был выполнен из тканого или нетканого целлюлозосодержащего материала. Он был предназначен для контакта с кожным покровом и выполнял функцию подложки для остальных слоев. Кроме того, предполагалось, что данный материал будет осуществлять эффективный отвод влаги от тела человека.
Исследование защитных свойств полученных материалов показало, что при нанесении на поверхность такого материала вещества Vx в концентрациях 10 г/м отсутствие токсичных паров за слоем защитного материала было зарегистрировано на протяжении 96 ч (дальше анализ не проводился) при различных температурах (22-45С) и рН (7,8-10.5).
Исследование кинетики разложения различных фосфонатов в среднем слое с ферментом His6-OPH показало (Рис.77), что не зависимо от чистоты применяемого ферментного препарата, рН и температуры время самодегазации образца защитного материала уменьшалось с 7 до 3 ч при увеличении концентрации фермента His6-OPH. Минимальное время самодегазации (3 ч) наблюдалось для материалов, содержащих 0,0076 и 0,22 масс.% для очищенного и неочищенного препарата IIis6-OPH, соответственно. При этом рН 10,5 буфера, применяемого при изготовлении защитного материала, являлось оптимальным.
Изменение концентраций различных фосфорсодержащих соединений в дегазирующем слое в процессе ферментативной детоксификации вещества Vx под действием иммобилизованного фермента His6-OPH.
До 1-го часа в накоплении ЭЭМФК и МФК наблюдался лаг-период, в го время как для фосфатов лаг-период закончился в первые 30 мин. За это время гидролиз Vx прошёл на 40%. По всей видимости, происходил гидролиз не только P-S, но и эфирной Р-0 связи в молекуле Vx с образованием 8-(2-диизопропиламинозтил)метилфосфонаіа. который в данном эксперименте не контролировался.
Далее происходило быстрое накопление МФК и более медленное накопление ЭЭМФК и фосфатов. Стоит отметить, что через 2,5 ч гидролиз Vx заканчивался полным его разложением, в то же время накопление ЭЭМФК происходило до 25 ч включительно. Видимо, происходил гидролиз диэтилового эфира метилфосфоновой кислоты, который в данном эксперименте не контролировался. К 25 ч в системе, по всей видимости, наступало равновесие, потому что дальнейшее вьщерживание реакционной смеси не приводило к изменению концентраций контролируемых компонентов.
Таким образом, иммобилизация не являлась препятствием для проявления ферментативной активности His6-OPH в отношении различных фосфонатов. Стоит также отметить, что подобная активность иммобилизованного фермента была продемонстрирована впервые, и ранее не была описана в литературе. Кроме того, активность фермента HiS(,-OPH в отношении ЭЭМФК лишний раз подтвердила его способность гидролизовать моноэфиры МФК. Новизна и очевидные преимущества над аналогами разработанного биокатализатора были подтверждены патентом РФ (Патент РФ №2330717,2008).
Похожие диссертации на Иммобилизованные биокатализаторы на основе полигистидинсодержащих производных органофосфатгидролазы: получение и свойства
