Введение к работе
Актуальность темы
В последние годы стало очевидно, что химический синтез не в полной мере удовлетворяет потребностям общества в новых лекарственных препаратах (ЛП). Недостатками многих новых эффективных ЛП является плохая растворимость в воде, малое время циркуляции, низкая биодоступность и общая высокая токсичность. Одним из решений этих проблем является использование в качестве носителей ЛП корпускулярных структур микро- и нанометрового размера. При этом к подобным структурам предъявляются жесткие требования, такие как низкая токсичность, хорошая емкость по отношению к ЛП, способность к направленному транспорту, контролируемое высвобождение ЛП в зоне мишени, химическая и физическая стабильность при хранении (как для ЛП, так и для самого носителя), а также приемлемая цена, сопоставимая с аналогичными препаратами, не имеющими корпускулярного носителя. Выбор мицелл в качестве объекта исследования в нашем случае был обусловлен тем, что на первом месте по перспективности использования в качестве носителей ЛП стоят системы нанометрового размера. Было доказано, что они способны повышать растворимость, и биодоступность плохо растворимых ЛП [Amidon et al., 1995; Lobenberg and Amidon, 2000; Dressman and Reppas, 2000]. В качестве исследуемой лекарственной субстанции был выбран клиндамицин, являющийся антибиотиком широкого спектра действия. В частности, клиндамицин активен в отношении грамположительных кокков (стафилококков, стрептококков, за исключением энтерококков), некоторых грамположительных бактерий (клостридии, сибиреязвенные микробы), неспорообразующих анаэробов (бактериоиды, фузобактерии) и микоплазм. Клиндамицин хлорид хорошо растворим в воде, так что после внутривенного или внутримышечного введения большее количество препарата остается во внеклеточном пространстве. Однако внутриклеточные инфекции часто не поддаются обычной антимикробной терапии, так как для их подавления требуется повышение концентрации антибиотика внутри клетки. Поэтому многие антибиотики, включая клиндамицин, показывая хорошую антибактериальную активность in vitro, имеют низкую активность против внутриклеточных бактерий in vivo из-за плохого проникновения в клетки или вследствие инактивации лизосомальными энзимами [Kumana and Yuen, 1994]. Разработка новых антибактериальных форм препарата, имеющего в своем составе носитель нанометрового размера и плохо растворимую в воде модификацию клиндамицина, могла бы расширить диапазон действия антибиотика и улучшить его терапевтическую активность.
Имеются данные по инкапсулированию клиндамицина в липосомы [Fierer et al., 1990; Swenson et al., 1990]. Было доказано, что включение клиндамицина в состав липосомального носителя улучшает его фармакокинетические свойства. Однако к началу диссертационных исследований не было достоверных данных по мицеллярным формам данного антибиотика. Преимущества создания
мицеллярной формы препарата очевидны, поскольку размер мицелл, как правило, существенно меньше, чем размер липосом применяемых для инкапсуляции клиндамицина [Lutwyche et al., 1998; Schiffelers et al., 2001]. Можно предположить, что включение лекарственных препаратов в мицеллы способно повысить химическую и физическую стабильность композиций из нескольких плохо растворимых в воде антибиотиков при хранении. Кроме того, можно ожидать повышения терапевтической эффективности мицеллярного препарата, поскольку, с одной стороны, ЛП в мицелле будет защищен от действия неблагоприятных факторов, а с другой стороны мицеллярная структура допускает более длительную циркуляцию в кровотоке для токсичного ЛП без превышения допустимой концентрации в организме. Наконец, мицеллы хорошо подходят как переносчики лекарственных препаратов и с точки зрения размера, поскольку мелкие сосуды имеют предел для проходимости частиц в несколько сот нанометров.
Целью диссертационной работы являлось получение стабильных мицеллярных композиций на основе малорастворимой в воде соли клиндамицина бензоата, исследование роста бактериальных культур с различной родовой принадлежностью на средах содержащих мицеллярную и немицеллярную формы лекарственного препарата на основе клиндамицина в условиях in vitro, и сравнительное исследование мицеллярного и немицеллярного препаратов in vivo.
Задачи исследования:
Синтезировать нерастворимую в воде соль клидамицина бензоат (ClindBz).
Создать на базе синтезированной соли стабильные во времени мицеллярные композиции, в том числе содержащие комбинацию антибиотиков клиндамицина и гентамицина.
Провести оценку антибактериальной эффективности полученных композиций в сравнении с препаратом на основе растворимой в воде соли клиндамицина in vitro.
Провести оценку фармако кинетической эффективности полученных композиций в сравнении с препаратом на основе растворимой в воде соли клиндамицина при лечении заболеваний крупного рогатого скота.
Научная новизна работы:
1. Синтезирована модифицированная форма лекарственной субстанции (ClindBz), исследованы ее физико-химические свойства и оптимизирован процесс синтеза для получения максимального выхода конечного продукта. Модифицированная субстанция вместе с гентамицином использована для получения новой мицеллярной ветеринарной композиции «Гентамакс М» с широким спектром антимикробного действия.
Показано, что рост культуры Sarcina (Micrococcus) luteus не зависит от размера мицелл (в диапазоне 6-20 нм) в препарате «Гентамакс М».
Доказано, что мицеллярный препарата «Гентамакс М» на основе плохорастворимой в воде соли ClindBz после внутримышечного введения удерживается в крови телят примерно в два раза дольше, чем препарат на основе водорастворимого ClindHCl.
Показано, что потенциальная повышенная терапевтическая эффективность препарата «Гентамакс М» может быть обусловлена только улучшенной фармакокинетикой и биодоступностью, а не прямым антимикробным действием.
Научно-практическая значимость работы:
Создана эффективная оригинальная мицеллярная лекарственная композиция «Гентамакс М», содержащая ClindBz и гентамицина сульфат с широким спектром антимикробного действия. Разработан лабораторный регламент получения модифицированной лекарственной субстанции ClindBz с целью последующей адаптации регламента к условиям производства. Препарат «Гентамакс М» планируется к производству на базе ЗАО «Нита-Фарм».
Достоверность научных результатов подтверждается воспроизводимостью экспериментальных данных, а также клиническими испытаниями, проводимыми в ЗАО «Нита-Фарм».
На защиту выносятся следующие результаты и положения:
В диапазоне концентраций ПАВ Cremafor-EL и сорастворителя ДМА от 0 до 15% температура точки помутнения не зависит от состава смеси, а температура абсолютной нестабильности возрастает с увеличением концентрации ДМА. Средний размер мицелл зависит от типа применяемого ПАВ и состава композиции.
Мицеллярные композиции, содержащие не более 5% ПАВ Cremafor-EL, 20% сорастворителя Solufor, 4% гентамицина сульфата и 11% ClindBz являются стабильными не менее 1 года. При использовании сорастворителя ДМА (10%), стабильные композиции могут содержать до 10-15% ПАВ Cremafor-EL и 11% ClindBz.
Размеры зон задержки роста бактериальной культуры Sarcina luteus в присутствии мицеллярных композиций на основе ClindBz не зависят от размера мицелл в диапазоне 6-20 нм.
Мицеллярная композиция на основе ClindBz действует на грамположительные бактериальные культуры Bacillus subtilis сходным образом с немицеллярной композицией, содержащей растворимую в воде соль клиндамицина ClindHCl.
Бактерицидные для Sarcina luteus концентрации препарата «Гентамакс М» на основе ClindBz регистрируются в плазме крови здоровых и больных телят дольше по сравнению с препаратом «Гентамакс» на основе ClindHCl.
Личный вклад диссертанта и результаты, полученные совместно с другими исследователями:
Личный вклад соискателя состоит в получении модифицированного лекарственного вещества ClindBz, оптимизации его синтеза, создании оригинальной композиции, исследовании ее физико-химических свойств, проведении экспериментов и интерпретации полученных данных. Турбидиметрический анализ антимикробного действия препаратов и опыты на установке динамического рассеяния света выполнены совместно с к.ф-.м.н. Хлебцовым Б.Н. Опыты по определению бактериостатических концентраций «Гентамакс М» и анализу образцов крови выполнены совместно с лаб. Ивановой И.Б. Планирование экспериментов и обсуждение результатов проводились под руководством д.б.н. Чумакова М.И. и д.ф.-м.н Хлебцова Н.Г. Опыты по определению сравнительной эффективности «Гентамакс М» и «Гентамакс» на животных в условиях фермы проведены с участием Семенова СВ. и Улизко М. (ЗАО «Нита-Фарм»).
Гранты. Данное исследование поддерживалось грантом Фонда содействия развитию малых форм предприятий в научно-технической сфере «Регион-наука-бизнес», проект 1972р/3794 2003-2004 гг. «Разработка опытных образцов и создание технологии получения новых форм ветеринарных лекарственных средств с повышенной активностью».
Работа выполнена в Лаборатории агробактериальной трансформации и биотехнологии и в Лаборатории биосенсоров на основе наноразмерных структур ИБФРМ РАН в рамках плановых госбюджетных тем НИР. Часть исследований проведена в научно-исследовательском отделе ЗАО «НИТА-ФАРМ».
Апробация результатов: Результаты диссертации представлялись на следующих научных конференциях:
Международная конференция физико-химического анализа жидкофазных систем Саратов, 30 июня - 4 июля 2003 г.
IV Всероссийская конференция молодых ученых Современные проблемы теоретической и экспериментальной химии 23- 25 июня 2003 г. Саратов.
Saratov Fall Meetting Optical Tecnologies in Biophysics and Medicine, Oct.7-10, 2003.
Structure and dynamics of Polymer and Colloidal Systems. Giens, France, 10-15 Sept. 2004.
Публикации: По теме диссертации опубликованы 3 статьи, из них 2 в рецензируемых журналах и одна в зарубежном сборнике, и 4 тезисов.
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 123 страницах машинописного текста, содержит 25 рисунков, 24 таблицы, состоит из введения, литературного обзора, 3-х глав собственных исследований, заключения, выводов и списка литературы из 163 источников.
