Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Внутриклеточная концентрация атф как основной параметр контроля при разработке, исследовании и использовании гетерогенных биокатализаторов на основе иммобилизованных клеток микроорганизмов
1.1. Подходы к оценке эффективности действия гетерогенных биокатализаторов на основе иммобилизованных клеток микроорганизмов 12
1.1.1. Современные методы исследования биокатализаторов на основе иммобилизованных клеток микроорганизмов 12
1.1.2. Потенциал биолюминесцентного метода определения концентрации внутриклеточного АТФ в исследованиях гетерогенных биокатализаторов
на основе иммобилизованных клеток микроорганизмов 17
1.1.3. Адаптация биолюминесцентного метода определения АТФ к анализу биокаталитических систем на основе иммобилизованных клеток индивидуальных и смешанных культур 22
1.1.3.1. Удельные концентрации внутриклеточного АТФ, характерные для различных микроорганизмов 22
1.1.3.2. Определение концентрации АТФ в иммобилизованных клетках, входящих в состав биокаталитических систем на основе индивидуальных и смешанных культур
1.1.3.2.1. Определение концентрации АТФ в иммобилизованных клетках индивидуальных культур 29
1.1.3.2.2. Определение концентрации АТФ в иммобилизованных клетках в составе гетерогенных биокатализаторов на основе смешанных культур 38
1.2. Внутриклеточная концентрация АТФ как критерий оптимизации процесса получения новых иммобилизованных биокатализаторов на основе клеток микроорганизмов 46
1.2.1. Анализ концентрации внутриклеточного АТФ как основа аргументированного выбора условий подготовки клеток к 46 иммобилизации
1.2.1.1. Значимость условий культивирования клеток дрожжей для их последующей иммобилизации 47
1.2.1.2. Условия роста клеток бактерий, подлежащих иммобилизации, как инструмент для направленного регулирования свойств получаемого гетерогенного биокатализатора 56
1.2.2. Выбор условий иммобилизации клеток на основе результатов биолюминесцентного анализа внутриклеточного АТФ в клетках микроорганизмов в составе гетерогенных биокатализаторов 62
1.2.2.1. Выбор температурных условий иммобилизации клеток микроорганизмов с учетом результатов биолюминесцентного анализа внутриклеточной концентрации АТФ 62
1.2.2.2. Выбор среды для иммобилизации клеток микроорганизмов с учетом результатов биолюминесцентного анализа внутриклеточной концентрации АТФ 67
1.2.2.3. Выбор компонентного состава гетерогенного биокатализатора на основе иммобилизованных клеток микроорганизмов 72
1.3. Применение биолюминесцентного метода определения АТФ для мониторинга характеристик биокатализаторов на основе иммобилизованных клеток микроорганизмов при их использовании в биотехнологических процессах и при хранении 95
1.3.1. Применение биолюминесцентной АТФ-метрии для мониторинга каталитических характеристик гетерогенных биокатализаторов на основе иммобилизованных клеток различных микроорганизмов при их использовании в разных биотехнологических процессах 95
1.3.2. Мониторинг метаболических характеристик гетерогенных биокатализаторов на основе иммобилизованных клеток различных микроорганизмов при их длительном хранении 108
1.4. Применение биолюминесцентного метода определения АТФ для анализа
биокаталитических систем, природных и искусственно создаваемых на
основе иммобилизованных клеток смешанных бактериальных культур 118
1.4.1. Подход к разработке новых функциональных продуктов питания, основанный на применении иммобилизованных клеток смешанных культур пробиотиков
1.4.2. Биолюминесцентная АТФ-метрия в исследованиях природных биокаталитических систем на основе самоиммобилизующихся клеток
1.4.2.1. Исследование закономерностей формирования биокаталитических систем в виде коррозионно-опасных биопленок и факторы, влияющие на их формирование 125
1.4.2.2. Применение ингибиторов коррозии и биоцидов для предотвращения процессов биокоррозии с использованием биолюминесцентной АТФ-метрии в качестве критерия эффективности их применения
1 1.4.2.2.1. Исследование влияния различных ингибиторов коррозии на кинетические параметры биолюминесцентной реакции 135
1.4.2.2.2. Определение биолюминесцентным методом биоцидной активности ингибиторов коррозии по отношению к планктонным клеткам и биопленкам 141
Глава 2. Подходы к созданию полифункциональных гетерогенных биокатализаторов на основе иммобилизованных клеток различных микроорганизмов ... 150
2.1. Разработка многоцелевых гетерогенных биокатализаторов на основе клеток
дрожжей, иммобилизованных в криогель ПВС 150
2.1.1. Гетерогенные биокатализаторы на основе клеток дрожжей, иммобилизованных в криогель ПВС, в биотехнологическом процессе получения белого столового вина 151
2.1.2. Гетерогенные биокатализаторы на основе клеток дрожжей, иммобилизованных в криогель ПВС, в биотехнологическом процессе получения красного столового вина 157
2.1.3. Гетерогенные биокатализаторы на основе иммобилизованных в криогель ПВС клеток дрожжей для устранения недобродов 161
2.1.4. Гетерогенные биокатализаторы на основе клеток дрожжей, иммобилизованных в криогель ПВС, для биологического кислотопонижения плодово-ягодных сусел 163
2.2. Установление общих закономерностей в формировании гетерогенных биокатализаторов на основе иммобилизованных клеток мицелиальных грибов, создание полифункциональных биокатализаторов и исследование их характеристик 167
2.2.1. Скрининг продуцентов различных гидролитических ферментов (амилаз, липаз, пектиназ) среди мицелиальных грибов для разработки на их основе иммобилизованных биокатализаторов 169
2.2.2. Разработка образцов гетерогенных биокатализаторов на основе иммобилизованных клеток-продуцентов гидролитических ферментов 173
2.2.2.1. Определение наиболее благоприятных условий формирования гетерогенного биокатализатора на основе клеток R. oryzae для получения амилолитических ферментов... 175
2.2.2.2. Установление оптимальных условий формирования гетерогенного биокатализатора на основе клеток R. oryzae для получения липолитических ферментов 181
2.2.2.3. Разработка гетерогенного биокатализатора на основе иммобилизованного мицелия гриба A. foetidus для получения пектинолитических ферментов 187
2.2.2.4. Разработка гетерогенного биокатализатора на основе клеток галоалкалофильного гриба Н. alkalinum для получения гидролитических ферментов 189
2.2.3. Исследование основных операционных характеристик разработанных гетерогенных биокатализаторов для получения гидролитических ферментов... 192
2.2.3.1. Характеристики ГБК при длительном культивировании иммобилизованных мицелиальных грибов, продуцирующих внеклеточные амилолитические ферменты 192
2.2.3.2. Установление условий, обеспечивающих длительное и эффективное использование иммобилизованных мицелиальных грибов, продуцирующих внеклеточные липолитические ферменты 195
2.2.3.3. Исследование свойств иммобилизованных мицелиальных грибов, продуцирующих внеклеточные пектинолитические ферменты в периодических условиях 201
2.2.3.4. Исследование внеклеточных гидролитических активностей иммобилизованных клеток мицелиального гриба Н. alkalinum, продуцируемых им в периодических условиях культивирования 204
2.2.3.5. Исследование наличия общих тенденций во взаимодействии иммобилизованных клеток мицелиальных грибов и полимерного носителя на примере криогеля ПВС 206
2.3. Гетерогенные биокатализаторы, полученные в результате трансформации компетентных иммобилизованных клеток бактерий 211
Глава 3. Биокаталитические системы на основе иммобилизованных клеток микроорганизмов: общие закономерности и характерные особенности 224
3.1. Отличия, существующие в характеристиках свободных и иммобилизованных клеток микроорганизмов 226
3.2. Глобальная система регуляции экспрессии генов, функционирующая под контролем концентрации иммобилизованных клеток в составе ГБК 245
Глава 4. Гетерогенные биокатализаторы на основе иммобилизованных клеток, обладающие моноферментной целевой активностью: подходы к получению и их свойства 252
4.1. Гетерогенные биокатализаторы на основе иммобилизованных клеток, содержащих глюкозоизомеразу 253
4.2. Гетерогенные биокатализаторы на основе иммобилизованных рекомбинантных клеток с активностью органофосфатгидролазы 260
4.2.1. Новые штаммы-продуценты органофосфатгидролазы и исследование свойств генетически модифицированных аналогов ОРН 260
4.2.2. Разработка ГБК на основе иммобилизованных клеток, содержащих ОРН или His6-OPH, и его применение для гидролиза пестицидов 277
4.2.3. Гетерогенный биокатализатор на основе иммобилизованных клеток бактерий, составляющих искусственный консорциум, для разложения паратиона 280
4.2.4. Разработка биосенсора на основе иммобилизованных рекомбинантных клеток E.coli DH5a для прямого определения фосфорорганических нейротоксинов... 286
Глава 5. Новые гетерогенные биокатализаторы, разработанные на основе иммобилизованных клеток микроорганизмов, в различных биотехнологических процессах 293
5.1. Иммобилизованные гетерогенные биокатализаторы на основе клеток микроорганизмов для получения топливного биоэтанола из различных отходов промышленности и сельского хозяйства 295
5.1.1. Получение этанола из ферментативно гидролизованной лактозы, содержащейся в творожной сыворотке, с использованием ГБК на основе иммобилизованных клеток дрожжей 298
5.1.2. ГБК в процессах конверсии глюкозы, полученной ферментативным гидролизом полисахаридного сырья в составе различных отходов сельского хозяйства и промышленности, в этанол
3 5.1.2.1. ГБК на основе иммобилизованных клеток дрожжей 302
5.1.2.2. Исследование возможности использования ГБК на основе иммобилизованных клеток различных мицелиальных грибов, секретирующих внеклеточные целлюлазы, для получения биоэтанола 307
5.2. ГБК на основе клеток иммобилизованного гриба в процессе получения L(+) молочной кислоты 314
5.2.1. Состояние проблемы, связанной с биотехнологическим получением МК 314
5.2.2. ГБК на основе клеток R. oryzae и криогеля ПВС в процессах получения МК... 3 5.3. Применение ГБК, полученного на основе иммобилизованных клеток гриба R. oryzae, секретирующих гидролитические ферменты, в процессе очистки сточных вод предприятий пищевой промышленности 323
5.4. Гетерогенные биокатализаторы в процессе биодеструкции ФОВ и продуктов их разложения 330
5.4.1. Состояние проблемы ликвидации реакционных масс, образующихся в результате химического уничтожения 330
5.4.2. Биоразложение фосфорорганических соединений в составе реакционных масс, получаемых после химического уничтожения вещества типа Vx
5.4.2.1. Ферментативный гидролиз ФОВ в составе реакционных масс, полученных при химическом уничтожении нейротоксинов 335
5.4.2.2. Разложение фосфорсодержащих соединений с С-Р-связью под действием иммобилизованного ГБК, полученного на основе клеток Pseudomonas sp. 78Г
и криогеля ПВС 339
5.4.2.3. Комплексное биоразложение фосфорорганических соединений в составе реакционных масс, образующихся в результате химического уничтожениявещества типа Vx 344
Глава 6. Материалы и методы 350
Заключение 380
Выводы 384
Список литературы
- Внутриклеточная концентрация АТФ как критерий оптимизации процесса получения новых иммобилизованных биокатализаторов на основе клеток микроорганизмов
- Гетерогенные биокатализаторы на основе клеток дрожжей, иммобилизованных в криогель ПВС, в биотехнологическом процессе получения красного столового вина
- Глобальная система регуляции экспрессии генов, функционирующая под контролем концентрации иммобилизованных клеток в составе ГБК
- Разработка ГБК на основе иммобилизованных клеток, содержащих ОРН или His6-OPH, и его применение для гидролиза пестицидов
Внутриклеточная концентрация АТФ как критерий оптимизации процесса получения новых иммобилизованных биокатализаторов на основе клеток микроорганизмов
Так известна работа, где биолюминесцентное определение АТФ использовалось при обследовании в санитарных целях различных поверхностей в госпитальной кухне на наличие микробных загрязнений (по сути, адсорбированных микробных клеток). Было проанализировано 280 проб и показано соответствие данных, полученных биолюминесцентным методом, результатам микробиологического анализа. Также было отмечено, что с использованием биолюминесцентного метода удалось существенно сократить время проведения анализа [70].
Благодаря использованию биолюминесцентного метода определения АТФ в нескольких работах [77-79] было показано, что концентрация АТФ пропорциональна концентрации биомассы живых клеток в анализируемом образце, и что метаболическая активность иммобилизованных клеток может быть ниже, чем у свободных клеток при наличии серьезных диффузионных затруднений, создаваемых матрицами носителей, что, в свою очередь, подтверждается другими характеристиками клеток (уровнем дыхательной активности и удельной скоростью роста) [78] или же быть выше, чем у свободных клеток, например, при создании более благоприятных условий для существования клеток (как правило, в проточных реакторах с оптимизированной, скоростью разбавления потока субстрата) [79]. Причин существования столь короткого списка примеров применения» биолюминесцентного метода определения АТФ для анализа ГБК на основе иммобилизованных клеток микроорганизмов, вероятно, несколько: 1) существующий общепринятый микробиологический подход к изучению иммобилизованных клеток; 2) существовавшая до недавнего времени дороговизна ферментных препаратов люциферазы, необходимых для проведения биолюминесцентного анализа; 3) отсутствие научной базы, основанной на многочисленных экспериментальных результатах, которая могла бы обеспечить широкую популяризацию данного метода для его использования при работе с иммобилизованными клетками.
Таким образом, одна из задач этой работы — это всестороннее изучение возможности использования биолюминесцентного метода определения концентрации внутриклеточного АТФ на разных стадиях работы (разработка, применение, хранение) с биокатализаторами на основе иммобилизованных клеток; установление факторов, ограничивающих применение данного метода; разработка методик, адаптирующих применение биолюминесцентного метода к анализу иммобилизованных клеток разных микроорганизмов (бактерий, дрожжей, мицелиальных грибов); установление адекватности использования данного метода для оценки каталитических характеристик ГБК на основе корреляции полученных значений концентраций внутриклеточного АТФ в иммобилизованных клетках с другими их характеристиками; создание научной базы, основанной на многочисленных экспериментальных результатах, которая могла бы обеспечить широкое применение данного подхода к изучению ГБК на основе иммобилизованных клеток микроорганизмов.
При выполнении этой работы применение обсуждаемого подхода к анализу биокаталитических систем на основе иммобилизованных клеток базировалось на обязательном проведении предварительных экспериментов со свободными клетками, направленных на определение удельной концентрации АТФ, характерной для клеток различных микроорганизмов, подлежащих иммобилизации. Целевой параметр определялся из калибровочных зависимостей, устанавливаемых в логарифмических координатах между концентрациями АТФ в исследуемых образцах и присутствующими в них точно известными концентрациями клеток. Примеры построения подобных калибровочных зависимостей приведены на рис.6. Точная концентрация клеток в анализируемых образцах определялась микробиологическим методом (высевом последовательных разведений на питательные агаризованные среды с последующим подсчетом выросших КОЕ). Исследования проводились с использованием свободных клеток, выращенных с соблюдением тех же условий, которые планировались к применению для ГБК на основе иммобилизованных клеток. Как правило, в этом случае все клетки в анализируемом образце заведомо были жизнеспособными.
Надо отметить, что линейные интервалы установленных зависимостей концентраций АТФ от концентраций клеток были достаточно широкими и полностью удовлетворяли потребностям, возникавшим позже при исследовании иммобилизованных клеток. На основе подученных данных были рассчитаны для различных микроорганизмов удельные концентрации внутриклеточного АТФ; в среднем приходящиеся на одну клетку (табл. 3).
Было установлено, что удельная концентрация внутриклеточного АТФ для клеток разных микроорганизмов различается и определяется, очевидно, размерами клеток, условиями их существования (аэробиоз или анаэробиоз), типом используемого субстрата и реализуемыми клетками метаболическими путями для трансформации основных субстратов. В принципе, такая информация позволяет в течение нескольких минут оценить концентрацию клеток в пробе одним измерением внутриклеточного АТФ, но при этом следует отметить, что далеко не во всех случаях необходимо или возможно определение удельной концентрации АТФ в расчете на 1 клетку в анализируемом образце.
Так, в случае проведения исследований с использованием культур, характеризующихся гетерогенностью состава (споры и вегетативные клетки), изменением размера клеток на разных фазах роста или агрегированных клеток, суспендирование которых в водных средах затруднено [80]. Более того, при работе с ГБК на основе иммобилизованных клеток часто возникает необходимость оценки концентрации АТФ, приходящейся на 1 г биокатализатора с исходно известной концентрацией клеток. В этом случае в работе необходима информация об удельной концентрации АТФ, приходящейся на 1 мг клеток. Для определения этого параметра в работе также устанавливались калибровочные зависимости концентрации АТФ от концентрации клеток в анализируемых образцах (рис.7) и проводились соответствующие расчеты (табл. 4).
Гетерогенные биокатализаторы на основе клеток дрожжей, иммобилизованных в криогель ПВС, в биотехнологическом процессе получения красного столового вина
Поскольку реагент, применяемый для экстракции АТФ из бактериальных клеток, находящихся в составе биопленок, мог параллельно экстрагировать из биопленок какие-то другие вещества, которые могли бы оказывать влияние на люциферазную реакцию, лежащую в основе биолюминесцентного метода исследования, а также мог не полностью экстрагировать АТФ из клеток вследствие сохранения ими целостности в присутствии матрицы биопленки, то первоначально было исследовано влияние различных эстрагентов на активность люциферазы, применяемой в биолюминесцентном анализе. Для этого проводилось определение интенсивности биолюминесценции в присутствии различных экстрагентов: ДМСО, додецилсульфат натрия (ДСН) (1% раствор) и агент, разрушающий клетки (АРК). Причиной выбора этих агентов послужило то, что ДМСО широко используется в биолюминесцентном анализе для экстракции внутриклеточного АТФ из различных клеток микроорганизмов, ДСН является хорошим реагентом для разрушения клеток в "мягких" условиях, а АРК — реагент для экстракции АТФ из различных клеток, разработанный компанией New Horizons Diagnostics Inc. (США), имеющей большой опыт аналитической работы с применением биолюминесцентного метода. Предположительно, АРК является четвертичным аммонийным соединением.
В экспериментах первоначально к 0,1 мл стандарта АТФ с известной концентрацией добавляли 0,9 мл экстрагирующего реагента, затем после тщательного перемешивания отбирали 50 мкл этого раствора и вносили в кювету с 50 мкл раствором люциферазы. В контрольном образце вместо экстрагирующего реагента добавлялась дистиллированная вода, и относительно регистрируемого биолюминесцентного сигнала оценивалось ингибирование люциферазной реакции экстрагирующими реагентами.
Результаты показали, что реагентом, оказывающим минимальное ингибирующее воздействие на люциферазную реакцию среди апробированных экстрагентов, является ДМСО (рис. 11а). Далее исследовалась эффективность экстракции внутриклеточного АТФ из клеток в составе биопленок с помощью этих реагентов.
Для выращивания биопленок на этом этапе работы использовали чистую культуру Desulfovibrio vulgaris В-1388, являющуюся одним из представителей СВБ, наиболее распространенных на нефтяных месторождениях. Экстракция с помощью трех реагентов велась с применением различных концентраций реагентов по отношению к обрабатываемой площади поверхности металла (0,5 - 2,0 мл/см2).
Время обработки биопленок тоже варьировалось (5-20 мин) для достижения максимальной экстракции АТФ из клеток. Параллельно определялась максимально ( 100%) экстрагируемая из биопленок концентрация АТФ, достигаемая при дезинтеграции клеток ультразвуком. Сравнение результатов, полученных с помощью ультразвуковой обработки, с эффективностью экстракции АТФ из биопленок с помощью разных реагентов (рис. 116) показало, что применение ДМСО позволяет наиболее эффективно экстрагировать АТФ из клеток в составе биопленок в сравнении с другими реагентами.
Необходимая концентрация ДМСО для наиболее полной экстракции АТФ из коррозионно активных биопленок была определена как 0,5 мл/см2 поверхности металла, покрытого биопленкой (рис. 11в), площадь поверхности металлических купонов была 2,27 см2), а время, достаточное для обеспечения максимальной полноты экстракции АТФ из биопленок, составило 15 мин при использовании ДМСО в концентрации 0,5 мл/см2 для обработки биопленок (рис. 11 г).
Подобранные условия проведения биошоминесцентного анализа концентрации внутриклеточного АТФ в составе биопленок были применены для исследования кинетики формирования биопленок клетками различных индивидуальных культур (рис. 12 - пример дан для клеток Desulfovibrio vulgaris В-1388). При этом концентрация клеток в составе биопленок рассчитывалась с использованием ранее установленной удельной концентрации внутриклеточного АТФ, характерной для данного типа клеток (табл. 3) и следующих уравнений: In N = In No + \Л [109] (1) и In АТФ = In АТФ0 + ut (2) где \х - удельная скорость роста, No - начальная концентрация клеток, N -концентрация клеток в момент времени t, t - время роста клеток, АТФо - начальная концентрация внутриклеточного АТФ, АТФ — концентрация АТФ в момент времени t Из кинетической кривой роста была рассчитана удельная скорость роста биопленки. Так для клеток Desulfovibrio vulgaris В-1388 она составила 0,082±0,005 ч"1.
Кинетика роста клеток D.vulgaris В-1388 в составе биопленки. Следует отметить, что параллельный анализ численности клеток в составе биопленок микробиологическим методом, который состоял из нескольких последовательных длительных операций (дезинтеграция биопленок, приготовление последовательных разведений суспензий клеток, высев полученных образцов в жидкую питательную селективную среду и их последующее культивирование в течение 10 сут.), также позволил определить удельную скорость роста биопленок, формируемых те ми же индивидуальными культурами. Так, для взятой здесь в качестве примера культуры D. vulgaris, удельная скорость роста была близка к вышеуказанному значению и составила 0,075±0,004 ч"1.
Результаты определения исходной концентрации самоиммобилизованных клеток в составе биопленок (No), например, на основе монокультур P. putida и R. erythropolis, полученные при обработке данных биолюминесцентного анализа кинетики роста биопленок, также сравнивались с аналогичными результатами, полученными классическими микробиологическими методами при такой же их математической обработке (табл. 7). Было установлено, что разница между результатами определения начальной концентрации клеток, полученными двумя методами, меньше 10%.
Гетерогенные биокатализаторы на основе клеток дрожжей, иммобилизованных в криогель ПВС, в биотехнологическом процессе получения красного столового вина
При этом тенденции в изменении каталитической активности ГБК и концентрации АТФ в иммобилизованных клетках были очень похожими. Здесь следует отметить тот факт, что удельная концентрация АТФ в расчете на 1 мг иммобилизованных клеток в среде с o-F-фенолом значительно отличалась от той величины, которая ранее была установлена для свободных клеток, причем не только в обычной питательной среде, но и среде с F-содержащим фенолом (табл. 32). Во-первых, очевидно, сам процесс иммобилизации негативно повлиял на энергетический статус клеток, а во-вторых, введение иммобилизованных клеток сразу в среду с o-F-фенолом дополнительно снизило концентрацию внутриклеточного АТФ. В результате этого исходная концентрация АТФ в клетках в начале непрерывного процесса составляла всего 0,2x10"" моль/мг клеток. Но в результате активного метаболизма клеток величина обсуждаемого параметра увеличилась почти на порядок в процессе применения ГБК (до -1,8x10"11 моль/мг клеток), хотя так и не достигла того уровня, который был отмечен для свободных клеток, не прошедших стадию иммобилизации (9,4x10" моль/мг клеток). Вероятно, именно этот факт обусловил то, что эффективно использовать данный ГБК в процессе получения 3-F-L-тирозина можно было не более 12 суток - далее синхронно со снижением уровня АТФ в гранулах ГБК отмечалось снижение его продуктивности.
Дальнейшие исследования показали, что перенос гранул ГБК из реактора со средой, содержащей o-F-фенолол, в которой он отработал в непрерывном режиме 15 суток, в обычную питательную среду и экспонирование его в этой среде в течение 2 суток приводит к увеличению концентрации АТФ в гранулах ГБК до уровня 2x10"10 моль/мг клеток. При этом восстанавливалась каталитическая активность ГБК. Возможность такой реактивации ГБК может быть принята во внимание при технологической реализации процесса получения З-Б-Ь-тирозина под действием иммобилизованных клеток.
Следует отметить, что аналитическое определение концентрации З-Р-Ь-тирозина в среде проводилось в работе методом тонкослойной хроматографии на пластинах Silufol (н-бутанол-ледяная уксусная кислота-вода, взятых в соотношении 4:1:1) и занимала несравнимо больше времени, чем это требовалось на определение концентрации АТФ в иммобилизованных клетках. Согласно полученным в этой работе результатам и установленной положительной корреляции в тенденциях изменения обсуждаемых двух параметров, характеризующих эффективность действия ГБК в процессе его длительного использования, можно при технологическом проведении процесса получения 3-F-L-тирозина использовать именно биолюминесцентную АТФ-метрию для оперативной и достоверной оценки метаболической активности ГБК. Следует в заключении отметить, что продуктивность иммобилизованного ГБК, как минимум, на порядок превосходила ту же характеристику у свободных клеток.
ГБК на основе клеток бактерий Clostridium thermoceltum-5, иммобилизованных в криогель ПВС. Биотехнологические процессы, связанные с перспективами использования биовозобновляемых источников природных полимеров, представляющих собой целлюлозосодержащее сырье (ЦСС) в виде растительной биомассы, отходов сельского хозяйств и промышленности, в последнее время привлекают к себе все больше внимание особенно в связи с появлением новых разработок в области топливной энергетики, связанных с трансформацией моносахаров, получаемых ферментативным гидролизом из целлюлозы и гемицеллюлозы, содержащейся в ЦСС.
В основе сдерживания развития таких процессов лежат проблемы, связанные с самими ферментами, используемыми для обработки ЦСС, в частности,, необходима высокая эффективность их каталитического действия при минимальной (по стоимости и длительности) физико-механической предобработке исходного сырья, а также требуется низкая стоимость ферментных препаратов, позволяющая переходить к их масштабному производству и применению. В свете решения этих проблем ведется постоянный поиск новых продуцентов целлюлолитических ферментов, отличающихся высокой активностью и термостабильностью, так как применение повышенных температур ( 60С) позволяет повысить скорости ферментативной трансформации ЦСС, а также избежать микробной контаминации образующихся сахаросодержащих ферментализатов.
К числу перспективных источников получения целлюлолитических ферментов относится анаэробная бактерия Clostridium thermocellum, способная секретировать в питательную среду эндо-1,4-Р-глюканазы (ЕС 3.2.1.4) при высокой температуре культивирования клеток ( 60С) [182-184].
В данной работе особый интерес представляло исследование возможности использования криогеля ПВС для получения ГБК на основе этой культуры с целью его дальнейшего многократного использования в периодических условиях в качестве непрерывно функционирующего источника секретируемого фермента. Интерес был обусловлен двумя причинами: во-первых, известно, что гранулы криогеля ПВС начинают терять свою механическую прочность при 70С, а при 80С — плавятся. В свете этого необходимо было определить принципиальную возможность применения данного носителя для иммобилизации клеток термофильной культуры. А во-вторых, очевидный научный интерес представляло собой исследование влияния условий иммобилизации на секреторную способность данной бактериальной культуры. Следует отметить, что в качестве одного из критериев оценки эффективности действия ГБК в этих исследованиях также использовалась концентрация внутриклеточного АТФ.
Изучение кинетики накопления эндоглюканазной активности в среде культивирования гранул ГБК, содержащих включенные в криогель ПВС клетки С. thermocellum, позволило установить, что процесс секреции эндоглюконазы сопряжен с потреблением целлобиозы, и со снижением скорости потребления субстрата скорость накопления ферментативной активности в среде также заметно снижается (рис.34). При этом максимум концентрации АТФ в клетках совпадал с началом стадии интенсивного биосинтеза и секреции внеклеточных ферментов, продолжение которой далее сопровождалось заметным снижением (в 5 раз) уровня концентрации АТФ в иммобилизованных клетках. Одновременно с выходом на постоянный уровень величины накапливающейся в среде эндоглюканазной активности, было отмечено установление постоянного уровня концентрации АТФ в иммобилизованных клетках.
Разработка ГБК на основе иммобилизованных клеток, содержащих ОРН или His6-OPH, и его применение для гидролиза пестицидов
В случае биопленок образование самих биокаталитических систем происходит, как правило, на какой-то поверхности при использовании ее в качестве подложки для формирования своей структуры, при этом биопленка может сохранять свою каталитическую активность, будучи удаленной с той поверхности, на которой происходило ее формирование (например, коррозионно-опасная биопленка может быть смыта с металлической поверхности в турбулентном потоке).
Долгое время считалось, что высокая плотность упаковки биопленки не позволяют антимикробным веществам проникать внутрь такой биокаталитической системы с целью подавления ее функциональной активности и роста иммобилизованных в ней клеток [4, 368]. Но относительно недавно было установлено, что структура различных биопленок пронизана водными микроканалами, через которые осуществляются интенсивные процессы массообмена [50, 356, 369], и поэтому все объяснения высокой резистентности клеток в составе биопленок, связанные с недосягаемостью клеток в таких природных ГБК для молекул веществ, обладающих биоцидной активностью, потеряли свою состоятельность. Проведенный биохимический анализ самих клеток, входящих в состав биопленок, и сравнение его результатов со свободными клетками тех же культур, показали, что самоиммобилизованные клетки обладают измененным составом и структурой клеточных стенок [370-372], что, как считают многие авторы проведенных исследований, и является причиной изменения проницаемости клеточной стенки для антимикробных агентов и, как следствие, резистентности этих клеток.
В параллель с этим следует отметить, что искусственно иммобилизованные клетки также обладают существенно повышенной устойчивостью к воздействию различных токсичных веществ, чаще всего являющихся субстратами или метаболитами процессов, для которых предназначены иммобилизованные ГБК. Так, в рамках только этой работы была показана более высокая резистентность иммобилизованных клеток к различным веществам по сравнению со свободными (п. 1.3, 2.1, 5.1; 5.2, 5.4): у бактерий Citrobacter intermedins - к o-F-фенолу, у бактерий Alcaligenes xylosoxidans - к ТДГ, у дрожжей Saccharomyces cerevisiae - к этанолу и органическим кислотам, у мицелиального гриба Rhizopus oryzae - к L(+)-MK, у бактерий Pseudomonas sp- к метилфосфоновой кислоте. Следует отметить, что число примеров, подтверждающих высокую резистентность иммобилизованных клеток к различным веществам, оказывающим ингибирующий или токсичный эффект на свободные клетки, безусловно, существенно шире [4, 12].
Согласно многочисленным литературным данным, в результате искусственной иммобилизации у клеток так же, как и у клеток в составе природных биопленок, наблюдались существенные изменения в биохимическом составе, а именно, в концентрацииях ДНК, РНК, белков и полисахаридов, которых, как правило, в иммобилизованных клетках становилось в несколько раз больше, чем в свободных клетках. Наиболее подробно эти изменения были изучены при разработке ГБК на основе иммобилизованных клеток дрожжей (табл.71).
Микроорганизм Способ и носитель для иммобилизации Выявленные изменения Ссылка Candida utilis Ковалентное связывание сгидроксиалкил-метакрилатнымгелем Увеличение в составе клеточной стенкиаминосахаров (на 37%), белков (на50%), липидов с насыщеннымижирными кислотами (на 21%),увеличение концентрациивнутриклеточных белков (на 31%) [373, 374]
Saccharomyces cerevisiae Включение в желатиновый гель Увеличение в составе клеточной стенкиманнан-содержащих белков смолекулярной массой 91 и 123 KDa [375] Включение в Са-альгинатный гельАдсорбция на пористом стекле Изменения жирнокислотного пулалипидов клеток с увеличением долинасыщенных (пальмитиновой - С16:0 истеариновой -С 18:0) кислот иснижением доли олеиновой (С18:1)кислоты [376] Включение в Са-альгинатный гель Изменение состава внутриклеточныхбелков, в частности, ферментовгликолиза [377, 378]
Так, например, с использованием методов электронной микроскопии было установлено, что при иммобилизации дрожжевых клеток клеточная стенка утолщается, поверхность цитоплазматической мембраны увеличивается за счет формирования везикулярных инвагинаций, усиления извилистости и складчатости контура [379]. Было установлено значительное увеличение числа митохондрий, увеличение их размеров и усложнение структурной организации, а также усиление развития эндоплазматического ретикулума, выполняющего важную роль в обменных процессах клетки. Здесь следует указать, что, в отличие от обнаруженных изменений в иммобилизованных клетках, у клеток, находящихся в стационарной фазе роста, наоборот, как известно, происходит уменьшение размеров митохондрий [380], что лишний раз подтверждает тот факт, что иммобилизованные клетки не могут быть ассоциированы по своим характеристикам со свободными клетками из стационарной фазы роста. Вместе с этим для клеток, находящихся под воздействием стрессовых факторов, у которых срабатывает генетически запрограммированный адаптационный ответ на появление таких воздействий, как раз наблюдается увеличение размеров митохондрий.
Иммобилизация дрожжей приводила к увеличению доли насыщенных жирных кислот в составе цитоплазматической мембраны [374]. Также было установлено, что в составе клеточной стенки у иммобилизованных клеток дрожжей увеличивается доля гликопептидов, содержащих маннан вместо глюкана, которые изменяли ее проницаемость [373-375]. При этом иммобилизация клеток дрожжей осуществлялась исследователями с использованием различных методов, в частности, включением в Са-альгинатный гель или ковалентным связыванием поверхности клеток с гидроксиалкилметакрилатным гелем SeparonH-1000.
Что касается иммобилизованных клеток бактерий, то и для них хорошо известны примеры изменения состава клеточной стенки, пула внутриклеточных белков и др. [4]. В рамках данной работы было обнаружено, например, что клетки бактерии Pseudomonas sp. 78Г, иммобилизованные в криогель ПВС и использованные для деструкции метилфосфоновой кислоты, являющейся продуктом разложения отравляющего вещества типа Vx (см. п.5.4), значительно увеличиваются в размере и образуют вокруг слой, состоящий из экзополисахаридов, обеспечивая себе, таким образом, повышенную в сравнении со свободными клетками резистентность к токсичному субстрату (рис. 88). Следует отметить, что аналогичные изменения, происходящие с клетками рода Pseudomonas, ранее были описаны при исследовании различных биопленок [9,12,369,381].
