Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 8
1.1. Суть и значение биологического метода защиты растений 8
1.1.1. Механизмы действия полезных почвенных микроорганизмов 9
1.1.2. Достоинства и недостатки препаративных форм биопестицйдов 16
1.1.3. Экосистема обитания биологических агентов 18
1.2. Природная и искусственная иммобилизация клеток микроорганизмов...20
1.2.1. Иммобилизация микроорганизмов в почве и её преимущества 20
1.2.2. Поведение биообъектов, вносимых в почву 22
1.2.3. Способы иммобилизации клеток 24
1.2.4. Выход клеток из иммобилизованного состояния в свободное 28
1.2.5. Применение иммобилизованных клеток для защиты окружающей среды 30
1.2.6. Иммобилизация клеток совместно с субстратом 32
1.3. Заключение 33
ГЛАВА II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 35
2.1. Объекты исследования 35
2.2. Состав и приготовления питательных сред 36
2.3. Культивирование 37
2.3.1. Приготовление инокулята 37
2.3.2. Культивирование 37
2.4. Методы анализа 38
2.4.1. Определение концентрации белка в растворе методом Лоури 38
2.4.2. Определение концентрации крахмала в растворе модифицированным методом Бертрана 39
2.4.3. Метод анализа концентрации клеток в Са-альгинатных гранулах 40
2.5. Иммобилизация клеток микроорганизмов 40
2.7. Характеристики реактивов 41
2.8. Метод определения антагонистической активности 43
ГЛАВА III. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 44
Часть 1. Исследование влияния иммобилизации на стабильность вегетативных клеток 44
1.1. Определение стабильности иммобилизованных клеток при хранении.. 45
1.2. Определение выхода клеток из иммобилизованного состояния 47
1.3. Разработка методов анализа выхода клеток из гранул при попадании в почвенную экосистему | 49
1.4. Сравнение кинетики роста клеток из гранул и кинетики роста клеток суспензии, внесённых в торфа 56
Часть 2: Разработка новой иммобилизованной системы «полисахаридная матрица-клетка-субстрат» 58
2.1. Обоснование выбора субстрата для совместной иммобилизации 58
2.2. Исследование диффузии иммобилизованных субстратов из Са-альгинатных гранул 59
2.2.1. Исследование диффузии крахмала 59
2.2.2. Исследование диффузии желатина 61
2.3. Исследование метаболизма иммобилизованного субстрата 62
2.3.1. Исследование метаболизма иммобилизованного крахмала клетками гриба Т. viride 62
2.3.2. Исследование метаболизма иммобилизованного желатина клетками P.fluorescens 63
2.4. Исследование роста клеток за счёт метаболизма иммобилизованного субстрата 64
2.4.1. Рост T.viride из гранул на предметном стекле во влажной камере 65
2.4.2. Рост P.fluorescens из гранул на предметном стекле во влажной камере 67
2.5. Исследование взаимодействия тест-объекта Fusarium oxysporum с иммобилизованной системой 70
2.5.1. Исследование взаимодействия тест-объекта Fusarium oxysporum с иммобилизованными совместно с крахмалом клетками T.viride 70
2.5.2. Исследование взаимодействия тест-объекта Fusarium oxysporum иммобилизованными совместно с желатином клетками P.fluorescens 71
2.6. Изучение срока хранения иммобилизованных систем 72
Часть 3: Изучение свойств иммобилизованной системы «полисахаридная матрица-клетки-субстрат» 77
3.1. Исследование влияния концентрации субстрата на рост иммобилизованных клеток из гранул рост колонии T.viride вокруг
3.1.1. Исследование влияния концентрации крахмала на рост солоний гриба T.viride вокруг гранулы 1 80
3.1.2. Исследование влияния концентрации желатина на P.fluorescens вокруг гранул
3.1.3. Исследование влияния смеси субстратов на рост колоний гранул.
3.2. Исследование влияния концентраций альгината натрия на рост иммобилизованных клеток из гранул 88
3.2.1. Исследование влияния концентрации альгината натрия ria рост клеток
3.2.2. Исследование влияния концентрации альгината натрия на рост клеток P.fluorescens 90
3.3. Исследование влияния физиологического состояния и концентрации клеток на образование колоний вокруг гранул.
3.3.1. Исследование влияния концентрации клеток T.viride на рос^ колоний...92
3.3.2. Исследование влияния возраста культуры T.viride из гранул
3.3.3. Исследование влияния концентрации клеток P.fluorescens на рост гранул системы матрица-колонии
3.4. Исследование влияния размера гранул на рост колоний вокруг
3.5. Предполагаемая модель роста колоний вокруг иммобилизованной «полисахаридная матрица-клетки-субстрат»
Часть 4: Изучение иммобилизованной системы «полисахаридная клетки-субстрат» в качестве новой препаративной формы
4.1. Исследование объёмной колонизации торфа семян .112
4.1.1. Исследование колонизации разных объёмов торфа
4.1.2. Исследование колонизации объёмов торфов в динамичном
4.2. Исследования влияния иммобилизованной системы на всхожесть
Часть 5: Наработка опытной партии и проведение производственных огурца. испытании
5.1. Наработка опытной партии
5.2. Проведение производственных испытаний
Часть 6: Изучение влияния пестицидов на иммобилизованную сибтему 118
6.1 .Исследование воздействия пестицидов на иммобилизованные системы с
клетками T.viride , 120
6.1.1. Исследование влияния фитоплазмина 120
6.1.2. Исследование влияния фитолавина-300 122
6.1.3. Исследование влияния квадриса 124
6.2. Исследование воздействия пестицидов на иммобилизованные системы с клетками P.fluorescens 125
6.2.1. Исследование влияния фитоплазмина 126
6.2.2. Исследование влияния фитолавина-300 126
6.2.3. Исследование влияния квадриса 127
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 130
ВЫВОДЫ 132
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 133
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 134
Приложение 1: Акты испытаний 144
Приложение 2: Технические условия 149
- Суть и значение биологического метода защиты растений
- Состав и приготовления питательных сред
- Исследование влияния иммобилизации на стабильность вегетативных клеток
Введение к работе
подразумевает
Интенсивное развитие технологий защищенного грунта применение биологического метода защиты растений д^я улучшения экологической обстановки и снижения пестицидной нагрузки.
Большинство препаративных форм биологических препаратов на основе полезных микроорганизмов для борьбы с патогенными представляют собой споровые формы или вегетативные клетки. Также препаративные формы обладают рядом общих недостатков, а именно: кортким сроком хранения клеток, крайне низкой приживаемостью в реальных экосистемах, неустойчивостью к физико-химическим взаимодействиям. Э:и недостатки ведут к снижению эффективности биологических препаратов на основе микроорганизмов. Разработка новых препаративных форм, ко-орые лишены данных недостатков, является актуальной задачей современной б *отехнологии.
Целью исследования явилась разработка новой препаративной формы биологических фунгицидов на основе клеток гриба Trichoderma viride и бактерии Pseudomonas fluorescens. Для достижения поставленной цели предстояло решить следующие задачи:
Разработать принципиально новый метод иммобилизации клеток исследуемых микроорганизмов и специально подобранного для их метаболизма субстрата в Са-альгинатном геле; клеток разработанной на свойства
Исследовать динамику роста иммобилизованной системы;
Подобрать высокомолекулярный субстрат для ercj совместной иммобилизации с микроорганизмами и исследойать влияние концентрации этого субстрата на свойства иммобилизованюй системы;
Изучить влияние фазы развития микроорганизмов и их концентрации на кинетические характеристики роста клеток;
Исследовать влияние концентрации альгината натрия иммобилизованной системы клеток с субстратом;
Изучить сохранение клетками своих фунгицидных свойств при совместной иммобилизации с субстратом;
Изучить фитотоксические свойства иммобилизованное системы в
I лабораторных условиях и возможность её применения в производственных условиях в качестве новой препаративной формы средств защиты растений.
Суть и значение биологического метода защиты растений
С увеличением объёмов выращивания сельскохозяйственной производители стали всё более и более зависимы от агрохимикатов, как от наиболее действенного и эффективного растений от болезней и вредителей.
Однако увеличение внесения химических пестицидов негативных последствий, таких как развитие устойчивых видов ненаправленное действие на биоценоз почвы, а также накаплифание химикатов в конечной потребительской продукции (De Weggi Также выявили ряд грибных и бактериальных болезней, химические средства малоэффективны или, борьба с которыми высокую токсичность у растений (Gerhardson, 2002). Вместе с пестициды нельзя использовать при выращивании растений, лекарственных целях (Boby, Bagyaraj, 2003).
Все эти причины привели к поиску новых альтернативных защиты растений, одним из которых стал биологический. Суть метода заключается в использовании насекомых и выделенньрс микроорганизмов для уменьшения и контролирования поражающих растения объектов (Welbaum et al., 2004).
Последние несколько десятков лет биометод начал во многих странах мира, особенно активно его стали применять защищенного грунта, где выращивание зеленных и происходит круглогодично (Backman et al., 1997; Chet, Baker,
Во всём мире было создано достаточно большое количесіво на биологической основе для поражения галловой нематоды колорадского жука и других вредителей. Также в сельском хо: е болезни у широко использовать не только микроорганизмы, вызываю вредителей, но и «вредителей» самих вредителей. Один из примеров - это использование хищных клещей для борьбы с (Ахатов с соавт., 2006).
Для защиты растений от грибных и бактериальных болезней управления биоценозами почв стали использовать штамма микроорганизмов, выделенных из различных видов почвь биостимулирующих агентов, продлевая тем самым допестицрдный выращивания растений (Hallman et al., 1997; Barea, микроорганизмам относится разнообразное число видов, многих почвенных экосистемах, а чаще всего бактерии Pseudomonas, Xanthomonas, грибы p. Trichoderma, Gliocladi (Алимова, 2005)
Наиболее широко изученная и применяемая микроорганизмы, населяющие ризосферу корневой системы и области (Lodewyckx, 2002). Некоторые полезные микроорганизмы на частичках почвы в околокорневых нишах, некоторые корнях, где в дальнейшем образуют эндофитные популяции, другие проникать через барьеры эпидермиса и внедряться в растение 1997; Montesios et al., 2002).
Состав и приготовления питательных сред
L-бульон: глюкоза 20 г/л, дрожжевой экстракт 5 г/л; пептон 10 г/л; NaCl 2 г/л; готовят на водопроводной воде. Среду стерилизивали при 0,5 атм. в течение 30 минут.
L-бульон обедненный: глюкоза 1,5 г/л; дрожжевой экстракт 1,5г/л; пептон 3 г/л; NaCl 1,5 г/л; готовили на водопроводной воде. Среду стерилизовали при 0,5 атм. в течение 30 минут.
Среда Чапека (для грибов) мальтоза - 40 г/л, пептон - 8 г/л, дрожжевой экстракт - 6 г/л, КН2Р04 - 1 г/л, MgS04 5H20 - 0,5 г/л, NaCl - 10 г/л, вода водопроводная - 1 л. Среду стерилизовали при 0,5 атм. в течение 30 минут в автоклаве.
L-бульон для грибов: глюкоза - 15 г/л, дрожжевой экстракт - 10 г/л; сульфат калия - 0,3 г/л; готовили на водопроводной воде - 1л.; рН доводили до 5,5 любой кислотой (соляной, уксусной). Среду стерилизовали при 0,5 атм. в течение 30 минут в автоклаве.
Среда Кинг А: вода до 1000 мл, пептон 20 г/л, глицерин 10 г/л, K2S04 10 г/л, MgCb 1,4 г/л, агар 15 г/. Среду стерилизовали при 0,5 атм. в течение 30 минут.
Торф: сфагновый верховой нейтрализованный торф фракционировали через мелкое сито размером ячейки 1мм. Стерилизацию торфа осуществляли путем повторного автоклавирования. Просеивали и увлажняли торф, засыпали в жестяные поддоны слоем толщиной не более 2 см. Закрывали поддон бумагой, завязывали жгутом и помещали в автоклав при 1 атм. на 40 минут, через сутки или двое проводили повторное автоклавирование при 0,5 атм. в течение 30 минут.
Торфяная вытяжка: 500 г торфа заливали 1,5 л водопроводной воды и автоклавировали 30 минут при 1 атм. Полученный экстракт фильтровали через бумажный фильтр, добавляли к горячему фильтрату 0,5 г СаС03, тщательно перемешивали и через 5-7 минут фильтровали вновь. К экстракту добавляли 0,2 г К2НРО4 и доводили объём до 1 л, рН=6,8-7,0. Среду стерилизовали при 1,5 атм. 30 минут.
На агаризованной среде Чапека выращивали мицелий гриба. Кусочек приблизительно 5x5 мм помещали в предварительно подготовленную среду Чапека объемом 150 мл. Инокулят получался после 4 дней культивирования при постоянном перемешивании.
На агаризованном L-бульоне выращивали колонии бактерий. Колонию, вместе с кусочком агара помещали в жидкую среду Кинг А объемом 50 мл. Инокулят при оптимальной температуре получался после 18 часов культивирования при постоянном перемешивании.
Исследование влияния иммобилизации на стабильность вегетативных клеток
Основными недостатками биопрепаратов на основе бактерий рода Pseudomonas и грибов рода Trichoderma, используемых в качестве фунгицидов в сельском хозяйстве, являются крайне малый срок хранения и плохая приживаемость клеток после внесения в субстраты и грунты. Следует понимать, что два этих показателя, определяющие качество и эффективность действия биопрепарата, не связаны между собой. В процессе хранения концентрация клеток снижается, что обусловлено метаболическими процессами, протекающими в них. А показатель приживаемости клеток показывает их способность вступать в конкурентные взаимодействия с действующей ассоциацией микроорганизмов, колонизируя почвы за счёт доступного субстрата.
Из литературных источников известно, что иммобилизованные клетки (далее РІК) микроорганизмов приобретают способность к более длительному хранению, что обусловлено снижением скорости метаболических процессов. Целью исследований на первом этапе было выяснение возможности увеличения срока хранения вегетативных клеток микроорганизмов Т. viride и P. fluorescens при их иммобилизации. Как показано в литературном обзоре для увеличения стабилизации клеток во времени и не нарушении их физиолого-биохимических характеристик подходит достаточно ограниченное число методов иммобилизации и полностью удовлетворяет лишь один метод - иммобилизация механическим способом в полисахаридных матрицах различной природы. Для увеличения срока хранения вегетативных форм P. fluorescens и Т viride был использован метод иммобилизации в Са-альгинатном геле (Кощеенко, 1981), обладающий следующими преимуществами перед другими методами: 1. Отсутствие изменения морфолого-физиологических показателей вегетативных клеток (в связи с отсутствием отрицательных воздействий метода иммобилизации на культуры микроорганизмов).
Анализ литературных источников показал, что бактерии Pfluorescem и грибы T.viride не обладают соответствующей ферментативной активностью, позволяющей им метаболизировать альгиновую кислоту или Са-альгинатный гель.
Для иммобилизации использовали клетки Р fluorescens или Т. vinde, выращенные глубинным аэробным способом на соответствующих питательных средах до середины экспоненциальной фазы роста, далее суспензию концентрировали центрифугированием в 10 раз. Для иммобилизации использовали альгинат натрия в концентрации 2%.
Полученную суспензию клеток использовали для иммобилизации в Са-альгинатном геле в соотношении 1 часть суспензии : 9 частей раствора альгината натрия. Полученную суспензию клеток в растворе альгината натрия по каплям добавляли в 2% раствор СаС12 при постоянном перемешивании. Гранулы выдерживали в растворе СаС12 не более 30 минут, далее гранулы декантировали и 2 раза отмывали физиологическом растворе (далее физ.р-р). Гранулы хранили в физ. р-ре при температуре 4С. Диаметр иглы шприца подбирался для образования гранул диаметром 2мм. Все описанные ниже опыты проводились с гранулами подобного размера.
