Введение к работе
Актуальность проблемы
В настоящее время в природный круговорот углерода вовлекается значительное количество соединений, попадающих в биосферу в качестве химических средств защиты растений, в виде отходов промышленности, загрязнений нефтью и нефтепродуктами. Многие из этих соединений, включая и полициклические углеводороды (ПАУ), являются токсичными и, следовательно, возможная аккумуляция их в биосфере представляет серьезную опасность для живых организмов. Основную роль в деградации подобных загрязнений играют микроорганизмы, так как микробная деградация ароматических соединений приводит к высвобождению углерода из ароматических структур и, таким образом, к вовлечению его в биологический круговорот. Для успешного использования микроорганизмов с целью очистки окружающей среды требуется детальное изучение их катаболических путей, а также ключевых ферментов, катализирующих деструкцию ароматических поллютантов.
В природе разрушение ароматических углеводородов в аэробных условиях происходит через расщепление ароматического кольца бактериальными диоксигеназами. Однако эти ферменты работают лишь в том случае, если в ароматическом кольце имеются две гидроксильные группы в орто- или пара-положении по отношению друг к другу. Поэтому, один из первых шагов в биодеградации ароматических соединений - это введение одной или двух гидроксильных групп в ароматическое кольцо. Введение одной гидроксильной группы в ароматическое кольцо - моногидроксилирование - часто катализируется монооксигеназами, относящимися к подклассу флавинсодержащих монооксигеназ, которые также носят название гидроксилаз. Гидроксилазы ароматических соединений являются объектом биохимических и генетических исследований не только в силу их важной роли в процессах детоксикации, но также как превосходные системы для изучения механизмов ферментативного включения кислорода в молекулу субстрата.
Салицилатгидроксилаза (СГ) (КФ 1.14.13.1) является одним из ключевых ферментов деградации полициклических ароматических углеводородов, катализирует декарбоксилирование и одновременное гидроксилирование салицилата в присутствии НАДН, приводящее к образованию катехола. Биохимические исследования салицилатгидроксилаз в последнее время были дополнены активными генетическими исследованиями. Использование современных молекулярно-генетических методов для изучения генов салицилатгидроксилаз показало большое их разнообразие. Но к настоящему времени большинство салицилатгидроксилаз не выделялось и свойства их не исследованы. Изучение разнообразия генов бактериальных салицилатгидроксилаз показало, что в природе наиболее часто встречаемый ген - ген nahG плазмиды pDTGl. Однако этот фермент к настоящему времени не был выделен и изучен.
Изучение свойств различных салицилатгидроксилаз важно для понимания фундаментальных механизмов адаптации микроорганизмов к новым условиям загрязнения. Помимо решения теоретических вопросов исследование салицилатгидроксилаз имеет и практический интерес. Ранее было показано, что феназин-модифицирующий ген phzS из штамма P. aeruginosa PAOl, кодирует
белок подобный салицилатгидроксилазам из различных микроорганизмов, в том числе салицилатгидроксилазе NahW из P.stutzeri AN10 (Mavrodi et al, 2001). Феназиновые антибиотики, продуцируемые PGPR-бактериями, подавляют рост и развитие фитопатогенных микроорганизмов в ризосфере растений. Исследование роли салицилатгидроксилазы в процессе гидроксилирования феназинов позволит улучшить имеющиеся биопрепараты, используемые в сельском хозяйстве для защиты культур от фитопатогенных микроорганизмов. Салицилатгидроксилаза также может быть использована в качестве рецепторного элемента в биосенсорных системах для детекции широкого спектра органических соединений при мониторинге объектов окружающей среды и биотехнологических процессах.
Работа поддержана грантами ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России на 2009-2013 годы» мероприятие 1.3.2. Проведение научных исследований целевыми аспирантами (ГК №Ш705), мероприятие 1.1 (ГК №02.740.11.0296), грантом РФФИ 11-04-97562-р_центр_а.
Цель работы:
выделение салицилатгидроксилазы микроорганизма - эффективного нефтедеструктора Pseudomonas sp. 142NF(pNF142), изучение ее свойств и определение роли в гидроксилировании феназиновых антибиотиков.
Для достижения указанной цели необходимо было решить следующие задачи:
Определить видовую принадлежность Pseudomonas sp. 142NF(pNF142)
Определить тип и локализацию гена салицилатгидроксилазы
Подобрать среды и условия культивирования микроорганизма для наработки наибольшего количества белка с максимальной активностью салицилатгидроксилазы
Выделить и изучить биохимические и каталитические характеристики салицилатгидроксилазы
Выявить основные закономерности зависимости активности салицилатгидроксилазы от строения субстрата
Определить роль салицилатгидроксилазы в гидроксилировании феназиновых антибиотиков, играющих важную роль в защите растений от фитопатогенов
Научная новизна
Установлено, что штамм-нефтедеструктор, входящий в биопрепарат
«МикроБак», Pseudomonas fluorescens 142NF(pNF142) содержит ген
салицилатгидроксилазы nahG, отнесенный к типу pDTGl. Показано, что ген nahG локализован на плазмиде.
Впервые выделена салицилатгидроксилаза, ген которой относится к типу pDTGl, и изучены ее свойства. Установлено, что салицилатгидроксилаза P.fluorescens 142NF(pNF142) состоит из одной субъединицы 46 кДа; является ФАД-содержащим белком; оптимальные условия функционирования: рН 7,5;
температура 35С; константы Михаэлиса по салицилату и НАДН 1,3 мкМ, и 9,9 мкМ, соответственно.
Впервые выявлена зависимость между величиной зарядов на функциональных группах субстрата, рассчитанных с помощью квантовомеханических методов, и активностью салицилатгидроксилазы. Показано, что активность салицилатгидроксилазы зависит от положения и типа заместителей в молекуле салицилата, влияющих на заряды функциональных групп -СООН и -ОН, необходимых для протекания ферментативной реакции. Изменение знака рассчитанного суммарного заряда на группе ОН в молекулах с различными заместителями с отрицательного на положительный приводит к снижению активности фермента. Понижение суммарного заряда на группе СООН приводит к увеличению активности фермента в ряду субстратов, замещенных в одном положении.
Впервые показано, что салицилатгидроксилаза Pseudomonas jluorescens 142NF(pNF142) участвует в трансформации феназиновых соединений, обладающих выраженной антибиотической активностью в отношении фитопатогенов.
Научно-практическая значимость
Для увеличения выхода салицилатгидроксилазы предложено культивирование микроорганизмов в ферментере на богатой среде с индукцией салицилатом оперонов биодеградации нафталина в середине экспоненциальной фазы роста культуры, что позволяет получить биомассу штамма P. jluorescens 142NF(pNF142) с высоким содержанием салицилатгидроксилазы (210 Ед/л) с высокой удельной активностью (0,065 Ед/мг). Поскольку штамм Pseudomonas jluorescens 142NF(pNF142) входит в состав биопрепарата «МикроБак», предназначенного для очистки нефтезагязненных территорий, получение биомассы с высокой активностью салицилатгидроксилазы, обладающей широкой субстратной специфичностью, повышает эффективность этого биопрепарата.
Схема очистки салицилатгидроксилазы, включающая ионообменную хроматографию, гидрофобную хроматографию и гель-фильтрацию, позволила получить гомогенный препарат фермента с выходом 25% и активностью 7,5 Ед/мг белка, который может быть использован как биокатализатор для создания биосенсора для определения салицилата в биологических жидкостях при лечении салицилатами (например, аспирином), а также в составе многоферментных биосенсоров для определения широкого круга веществ.
Известно, что ризосферные микроорганизмы способны защищать растения, синтезируя феназиновые антибиотики. Поскольку салицилатгидроксилаза нефтедеструктора Р. jluorescens 142NF(pNF142) участвует в трансформации 2-гидроксифеназин-1-карбоновой кислоты, а ген салицилатгидроксилазы расположен на плазмиде, то за счет конъюгационного переноса плазмиды в ризосферные бактерии можно усилить свойства биопрепаратов, используемых в сельском хозяйстве для защиты культур от фитопатогенных микроорганизмов, и в биотехнологиях очистки окружающей среды.
Апробация работы
Материалы работы были представлены на IV Международной конференции из серии «Наука и Бизнес» (Пущино, 2007); VI Международной научной конференции «Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии» (Минск, 2008); III Международной конференции «Микробное разнообразие: состояние, стратегия сохранения, биотехнологический потенциал» (Пермь, 2008); XII International congress of bacteriology and applied microbiology (Istanbul, 2008); Международной научной конференции «Генетика и биотехнология XXI века. Фундаментальные и прикладные аспекты» (Минск, 2008); 3rd Congress of European microbiologists «Microbes and Man - Interdependence and Future Challenges» (Gothenburg, 2009); Всероссийской конференции «Экотоксикология-2010» (Тула, 2010); VI Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2011); Международной конференции «Окружающая среда и человек: друзья или враги?» (Пущино, 2011).
Публикации
Опубликовано 17 работ, в том числе 6 статей, 11 сообщений в тезисной форме и в виде материалов конференций.
Структура и объем работы
Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, результатов исследований и их обсуждения, выводов и списка использованной литературы. Работа изложена на 116 страницах, содержит 49 рисунков и 18 таблиц. Список литературы включает 115 источников, из них 93 зарубежных.
