Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Гликолатоксидаза и ее физиологическое значение в растениях с различным типом метаболизма 14
1.1. Фотодыхание у С3 - и С* ~ растений 14
1.1.1. Гликолатный путь у С3 - растений 14
1.1.2.Типы фотосинтетического метаболизма 16
1.1.2.1. Фотосинтез у С3 - растений 16
1.1.2.2. Фотосинтез у С4 -растений 17
1.1.2.3. САМ метаболизм 20
1.1.3. Гликолатный путь у С4 - растений 22
1.2. Связь между ВПФП и фотодыханием 23
1.3. Гликолатоксидаза 24
1.3.1. Реакция и ее механизм 24
1.3.2. Распространение гликолатоксидазы 25
1.3.3. Очистка гликолатоксидазы 26
1.3.4. Свойства гликолатоксидазы 27
1.3.5. Кодирование гликолатоксидазы в геноме различных растений и животных 28
1.4. Адаптация растений к воздействию стрессовых факторов 32
1.4.1. Общие представления о стрессе 32
1.4.2. Влияние освещения на метаболизм растительной клетки 33
1.4.2.1. Влияние света на темновое дыхание 33
1.4.2.2. Влияние света на фотодыхание 35
1.4.3. Ответная реакция растений на солевой стресс 37
1.4.4. Влияние гипотермии на метаболизм растений 47
1.4.5. Роль ферментов в адаптации растительного метаболизма к неблагоприятным факторам среды 55
1.5. Значение гликолатного пути в метаболизме 56
1.5.1. Фотодыхание как энергетический процесс 56
1.5.2. Роль фотодыхательных интермедиатов в метаболизме растений 58
1.5.3 Функции пероксисомального метаболизма 66
ГЛАВА 2. Объекты и методы исследования 71
2.1. Объекты исследования 71
2.2. Методы исследования 71
2.2.1. Метод выделения ферментов из растительных объектов 71
2.2.2. Метод разделения клеток обкладки и мезофилла кукурузы 72
2.2.3. Метод определения перекрестного загрязнения тканей 72
2.2.4. Методы определения активности ферментов 72
2.2.4.1 .Метод определения активности гликолатоксидазы 72
2.2.4.2.Метод определения активности аконитатгидратазы 73
2.2.4.3.Метод определения активности фумаратгидратазы 74
2,2.4.4 .Метод определения активности ФЕП - карбоксил азы 74
2.2.4.5.Метод определения активности НАДФ - МДГ 75
2.2.5. Методы очистки изучаемого фермента 75
2.2.5.1, Методика очистки ГО из целых листьев 75
2.2.5.2. Методика очистки ГО из клеток обкладки и мезофилла кукурузы 76
2.2.6. Исследование кинетических характеристик и регуляции ферментов 77
2.2.7. Метод определения количества белка 77
2.2.8. Метод определения содержания хлорофилла 78
2.2.9.Методы создания физиологических стрессов 78
2.2.9.1. Метод создания условий с повышенной освещенностью 78
2.2.9.2. Метод создания солевого стресса 79
2.2.9.3. Метод создания гипотермии 79
2.3. Статистическая обработка данных 79
ГЛАВА 3. Особенности и тканевая специфичность гликолатоксидазы у о, -растения кукурузы 80
3.1. Распространение ГО в растениях с различным типом метаболизма 80
3.2. Распределение активности ГО между тканями листа С4 - растения кукурузы 81
3.3. Определение перекрестного загрязнения между изучаемыми тканями 82
3.4. Очистка ГО из С3 - и С4 - растений 83
3.4.1. Очистка ГО из Сз - растения пшеницы 83
3.4.2. Очистка ГО из целых листьев С4 - растения кукурузы 85
3.4.3. Очистка ГО из мезофилла и клеток обкладки проводящих пучков кукурузы 87
3.5. Изучение каталитических свойств ГО из листьев пшеницы и клеток обкладки и мезофилла кукурузы 91
3.6. Изучение влияния некоторых метаболитов на активность ГО в растениях 94
3.6.1. Изучение влияния изоцитрата и сукцината на активность ГО из Сз и С4 - растений 94
3.6.2. Изучение влияния глицина и серина на активность ГО из Сз - и С4 растений 98
ГЛАВА 4. Роль гликолатоксидазы в адаптации растений с различным типом метаболизма к изменениям условий среды 100
4.1. Изучение влияния интенсивности освещения на метаболизм растений 100
4.1.1. Изучение влияния интенсивности освещения на темновое дыхание растений 100
4.1.2. Влияние интенсивного освещения на гликолатный путь в растениях с различным типом метаболизма 108
4.1.3. Изучение влияния интенсивного освещения на этиолированные проростки кукурузы и пшеницы 114
4.2. Изучение влияния засоления на активность ГО в Сз - и С4 - 117
растениях
4.2.1. Изучение влияния кратковременного засоления на активность ГО в С3 - и С4 - растениях 117
4.2.2. Изучение влияния длительного засоления на активность ГО в Сз - 122 и С4 - растениях
4.3. Изучение действия положительных пониженных температур на активность ГО в Сз - и С$ растениях 126
Заключение 133
Выводы 137
Список использованных источников 139
- Связь между ВПФП и фотодыханием
- Значение гликолатного пути в метаболизме
- Методы определения активности ферментов
- Очистка ГО из С3 - и С4 - растений
Введение к работе
глюконеогеиетическим (Igambcrdiev A. U., 2002). При этом у Сз-растений теряется до 50% ассимилированного углерода.
Многие методы, применяемые для обнаружения фотодыхания в целых листьях, говорят о том, что у С4-растений фотодыхание отсутствует, или же его активность не велика (Brown W. V., 1975; Глаголева Т. А., 1975). Это, однако, не связано с отсутствием ферментов фотодыхания. Вероятнее всего, обмен веществ, связанный с функционированием гликолатного пути, просто подавлен. У С4-растсний для защиты от фотодыхательных потерь существует функциональное разделение фотосинтетических процессов между клетками обкладки и мезофилла. В клетках обкладки достигается уменьшение содержания С>2, что приводит к снижению оксигенирующей активности РУБФ-карбоксилазы {Chollet R., 1975). Предполагают, что в результате работы С4-цикла в клетках обкладки пучков в процессе фотосинтеза поддерживает относительно высокий уровень СОг. В результате этого отношение CCV О2 у них выше, чем у Сз-растений, а это благоприятствует фотосинтезу и способствует подавлению синтеза гликолата (Любимов В. Ю., 1985). Ключевым ферментом гликолатного пути является ГО - оксидаза L-2-гидроксикислот (гликолат: Ог-оксидоредуктаза, КФ 1,1.3.15), которая локализована в пероксисомах фотосинтетических тканей. Она окисляет различные 2-гидрокислоты, но более специфична к гликолату.
Ферменты гликолатного пути были выделены преимущественно из Сз-растений. Однако имеются данные об их присутствии у некоторых С4-растений (Любимов В. Ю„ 1984), но их локализация и функциональная роль остаются слабо изученными. Участие фотодыхания в адаптивной реакции растительного организма рассматривалось в ряде работ. Было показано, что этот процесс активируется при засолении (Cheesman J. М., 1988), изменении интенсивности освещения (Шахов А. А., 1993), повышенной температуре (Косулина Л. Г., 1993), развитии окислительного стресса (Калиикина Н. Г., 2001). Основным фактором, регулирующим интенсивность фотодыхания, является уровень освещенности, от которого зависит скорость оксигеназной реакции РуБИСКО. Однако, у С4 - растений, клетки обкладки, содержащие этот фермент, обеднены кислородом и изучение световой регуляции ферментов гликолатного пути в
различных тканях остается нерешенной проблемой. В Сз-растениях основной поток окислительного СОг и ( газообмена идет по пути оксегенирования РБФ и последующей метаболизации гликолата. Возможно, что какая-то часть гликолата у Q растений синтезируется за счет РуБФ-оксигеназы, т.к. в обкладке проводящих пучков поддерживается определенная концентрация (. Это особенно справедливо для С4-растений, у которых очень высокая активность фотосистемы II, а хлоропласта клеток обкладки характеризуются повышенной способностью к выделению Ог (Osmond СВ., 1971). Но, по -видимому, основным источником гликолата у Сд-растений является окислительный путь от оксалоацетата через малонат или гидроксипируват с участием активных форм кислорода (Del Rio L. A. [et al.], 1998; Любимов В. Ю., 1985), образование которых интенсифицируется при воздействий стрессоров различной природы, таких как пониженная и повышенная температура, засоление, гипероксидная атмосфера, воздействие патогенов.
Развитие толерантности в стрессовых условиях зависит от энергетического статуса клетки, в которой индуцируются соответствующие изменения, поэтому многие ткани растения при стрессе испытывают повышенные потребности в быстрометаболизируемых углеводах, что может поддерживаться за счет обходных реакций, в том числе, и реакций гликолатного пути.
Цель и задачи исследований. Целью данной работы являлось изучение особенностей функционирования изоформ гликолатоксидазы в листьях кукурузы и выявление роли этого фермента в адаптивной реакции растений с различным типом метаболизма к условиям среды. Для достижения цели были поставлены следующие задачи:
Изучить распространенность гликолатоксидазы у растений с различным типом метаболизма.
Осуществить разделение изоформ гликолатоксидазы из клеток обкладки и мезофилла листьев кукурузы и идентифицировать их тканевую специфичность.
Провести очистку изоформ гликолатоксидазы из различных тканей листа кукурузы.
Изучить каталитические и регуляторные свойства изоформ гликолатоксидазы, имеющих различную тканевую специфичность.
Исследовать динамику изменения активности гликолатоксидазы в растениях с различным типом метаболизма при варьировании условий освещенности и выявить корреляцию активности функционирования этого фермента с интенсивностью окислительного метаболизма митохондрий.
Изучить индукцию активности гликолатоксидазы в листьях этиолированных растений при зеленении.
Исследовать активность гликолатоксидазы у различных растений под влиянием хлоридного засоления.
Изучить функционирование гликолатоксидазы у Сз - и С4 -растений в условиях пониженной температуры.
Научная новизна работы. Нами была модифицирована методика разделения клеток обкладки и мезофилла С4 - растений, что позволило провести эффективное деление тканей листа кукурузы и обнаружить наличие нескольких изоформ ГО различной локализации. Впервые был очищен ферментный препарат ГО из клеток мезофилла кукурузы и изучены каталитические свойства этой изоформы в сравнении с ГО из клеток обкладки С4 - растения кукурузы и листьев Сз - растения пшеницы. Исследована регуляция активности различных изоформ ГО из С4 - растения кукурузы некоторыми метаболитами дыхания и гликолатного пути.
В представленной работе проведено исследование динамики активности ключевого фермента гликолатного пути - ГО в растениях с различным типом метаболизма, подвергавшихся стрессовым воздействиям. Изучен характер изменения активности ГО в растениях с различным типом метаболизма и различных по функциональной нагрузке тканях одного растения в условиях интенсивного освещения, засоления и гипотермии. Показано, что мезофилльная форма ГО менее устойчива к стрессорам различной природы, что указывает на возможную протекторную роль мезофилл ьных клеток кукурузы в защите фотосинтетического метаболизма С4 - растений от повреждающего действия факторов внешней среды.
Практическая значимость. Научные положения настоящей работы расширяют и углубляют современные представленій о физиолого -биохимических механизмах участия пероксисомальных процессов в адаптации растительных клеток. Традиционно считается, что фотодыхание снижает продуктивность сельскохозяйственных культур, однако получение мутантных организмов, дефицитных по этому пути, показало снижение их жизнеспособности (Blackwell R. D.[et al.], 1990; Leegoon R. С. [et al.],1995; Igamberdiev A. U,, 2001). Фотодыхание защищает растения от фотоингибирования, развивающегося при различных стрессовых условиях (Wingler А., 2000), а также участвует в поддержании энергетического статуса хлоропластов при лимитированном поступлении СОг и высокой интенсивности освещения (U. Heber [et al.], 1996). При изучение регуляции гликолатного пути нами получены данные о модуляции активности гликолатоксидазы, которые представляют интерес в понимании механизмов объединения энергетического и конструктивного обмена в единую целостную регулируемую систему, определяющую в конечном счете продуктивность растений. Представленные данные важны для получения новых сортов растений, обладающих повышенной экспрессией гликолатоксидазы как одного из механизмов устойчивости к изменениям факторов среды.
Модифицирован метод эффективного разделения клеток обкладки и мезофилла на примере С^ — растения кукурузы, у которого эти ткани несут различную функциональную нагрузку. Это позволит в дальнейшем изучить особенности локализации изоформ ферментов цикла Кальвина и гликолатного пути у различных представителей растений с С4 - типом метаболизма. Получены высокочищенные белковые препараты изоформ ГО из клеток обкладки и мезофилла, которые различаются по каталитическим свойствам, а также регуляцией дыхательными интермедиатами. Полученные предложенным путем препараты могут применяться для аналитического определения гликолата в биологических образцах.
Материалы работы используются в учебном процессе на биолого-почвенном факультете Воронежского госуниверситета. Результаты
исследований вошли в курсы лекций по «Физиологии растений», спецкурсы «Дыхание растений» и «Фотосинтез».
Апробация работы. Материалы работы были представлены и обсуждались на 7-ой международной конференции по химии и физико-химии олигомеров «Олигомеры VII» (Пермь, 2000), III съезде фотобиологов (Воронеж, 2001), 6 - ой и 9-ой Путинской школе - конференции молодых ученых «Биология - наука 21 -го века» (Пущиио, 2002, 2005 гг.), V Съезде Общества физиологов растений России (Пенза, 2003), научных сессиях Воронежского государственного университета (1999,2001, 2003).
Публикации. Результаты работы изложены в 12 публикациях: 7 статьях и 5 тезисах.
Структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 162 страницах машинописного текста. Состоит из введения, обзора литературных данных, результатов собственных исследований и их обсуждения, заключения, выводов и списка использованной литературы. В работе использовано 252 литературных источника, из них 91 отечественный и 161 иностранный. Иллюстрационный материал включает 39 рисунков, 8 таблиц.
Связь между ВПФП и фотодыханием
Фотодыхание представляет собой циклическую последовательность реакций, которые составляют единое целое с ВПФ - циклом. Рубиско обладает как карбоксилазной, так и оксигеназной активностью. При высоких концентрациях СОг и низком содержании ( преобладает карбоксилазная активность этого фермента. В аэробных же условиях часть РуБФ расщепляется в реакции, идущей с потреблением Ог, давая одну молекулу фосфоглицериновой кислоты и одну молекулу фосфо гликолата (НООС СЬі20РО(ОН)2 вместо двух молекул фосфоглицериновой кислоты. Далее фосфоглицериновая кислота включается в ВПФП, а фосфогликолат - в фотодыхние (Эдварде Дж., Уокер Д., 1986). Метаболизм рибозо - 5 - фосфата по транскетолазному пути может быть источником энергии для жизнедеятельности хлоропластов в отсутствие фотосинтеза, что доказывает взаимосвязь гликолатоксидазной системы с общим метаболизмом веществ в зеленой клетке (Колесников П. А., 1985). Петрухин и Лазор выявили активное включение меченых сукцината, цитрата и гликолата в ЦТК этиолированных проростков кукурузы при освещении, что подтверждает функционирование в них гликолатного пути (Петрухин Ю. А., 1990). Флавиновая оксидаза, характерная для пероксисом фотосинтезирующих тканей (ToJbert N.E., 1985) и присутствующая в меньших количествах в глиоксисомах и других типах микротелец - это оксидаза L-2-гидроксикислот (гликолат: 02-оксидоредуктаза, КФ 1.1.3.15). Она окисляет различные 2-гидроксикислоты, но более специфична к гликолату (Tolbert N. Е., 1980; Canvin D. Т., 1990; Iwamoto К., 1992).
Акцептором электронов с гликолата может служить ФМН или ФАД, от которого они далее переносятся на Ог с образованием Н; 02. Флавин не всегда прочно связан с белковой частью, в некоторых объектах ГО после очистки должна быть активизирована добавлением ФМН, который частично может быть заменен па ФАД, но не рибофлавин. Ключевую роль в распознавании этих сходных флавиновых аналогов играет 5 - фосфатная группировка в ФМН или ФАД (Kerr M.W., 1975). Показано, что транспорт электрона на ФМН в ходе гликолатоксидазной реакции является рН-зависимьш и сопровождается переносом протона в молекуле фермента (Расе С, 1984). Неорганический фосфат является конкурентным ингибитором по отношению к ГО, конкурируя с ФМН за центр связывания (Wang W. J., 2000).
Помимо флавиновой ГО, сообщалось о присутствии в этиолированных и зеленых листьях пшеницы альтернативной формы ГО, акцептором электронов в которой служит не флавин, а ферредоксин {Backer АХ., 1967). Она локализована в цитозоле и является очень нестабильной. Общепринято считать, что ГО локализирована в пероксисомах, причем в их матриксе, так как она легко солюбилизируется из органелл при осмотическом шоке. Поступление образующегося в хлоропластах гликолата в пероксисомы происходит благодаря наличию в мембране пероксисом специфических переносчиков (Recalcati S., 2001) и приводит к тому, что его окисление флавинзависимым ферментом сопряжено с детоксикацией Н2О2 каталазой, локализованной в этих же органоидах. Однако не исключается возможность, что некоторый пул фермента имеется в цитоплазме (Backer A.L., 1967), причем он может возрастать при старении листьев (Колесников П.А., 1985). При выращивании растений в среде, содержащей нитраты, увеличивается доля ГО, ассоциированной с микротельцами (Soldatini G.F., 1979). Нитраты и соли аммония индуцируют ГО в растениях (Roch-Bejerano N., 1973; Тищенко Н.Н., 1985). Если в растениях фермент окисляет преимущественно гликолат, то в животных тканях эквивалентный фермент, локализованный в микротельцах, окисляет короткоцепочечные алифатические гидроксикислоты. В геноме мыши идентифицирована с - ДНК, кодирующая белок, высокогомологичный ГО из растений. Рекомбинантный белок, экспрессированный в бактерии, продемонстрировал ферментативную активность ГО (Kohler S.A., 1999). В клетках печени человека изолирована с - ДНК, кодирующая белок со свойствами ГО. 370 аминокислотных остатков этого белка сходны с последовательностью АК в ГО из печени мыши на 89% и на 53% - со свойствами фермента из шпината и арабидопсиса (Williams Е., 2000). У большинства водорослей пероксисомы не связаны с гликолатным путем, ферменты которого локализованы в митохондриях (Frederick S.E., 1973). Вместо ГО у них присутствует только ГДГ, а гликолат выделяется в окружающую среду. У некоторых водорослей, например, Rhodophyceae (красных) в пероксисомах обнаруживается ГО - активность. У Wolffia также обнаружено наличие гликолатного пути, хотя активность его ферментв, включая ГО, очень низка (Bykova N. V., 1998).В некоторых работах показана возможность существования нескольких изоформ ГО, обладающих различными свойствами и имеющих разную локализацию (HavirE.A., 1983).
Значение гликолатного пути в метаболизме
Фотодыхание как фотоактивируемый процесс выделения С02 и поглощения Ог в листьях как будто бы не имеет непосредственного отношения к фотоактивации митохондриального дыхания. Но постулированное Ю.СКарпиловым и И.Л. Новицкой участие митохондрий в фотодыхании С4-растения побуждает рассмотреть энергетический подход к фотодыханию, если учесть работу на свету внутриклеточной мембранной энергосистемы (Карпилов Ю.С., 1974). Предположительно у С4-видов должна функционировать энергетическая цепь, объединяющая в единую систему хлоропласты и митохондрии и позволяющая трансформировать энергию НАДФ Н2 в макроэргические связи АТФ. Такая система, по мнению авторов, должна быть полезной для обеспечения стехиометрии энергетических продуктов, необходимой для восстановления СОг Благодаря фотодыханию, связанному с хлоропластами, пероксисомами, митохондриями и клеточным ядром осуществляется интеграция фотосинтетического и дыхательного метаболизма. Предполагается, что фотодыхание является источником органических кислот для цикла Кребса, работающего на свету (Singh Р., 1984). Многие исследователи связывают фото дыхание с гликолатом, считая гликоле вую кислоту основным субстратом фотодыхания; транспортируется она через мембраны хлоропластов с помощью предполагаемого специфического переносчика. По гликолатному пути происходит очень интенсивная циркуляция углерода, в несколько раз превышающая скорость поступления углерода извне. А.И. Маслов и А.Н, Кузьмин допускают, что в определенных условиях фотодыхание может обеспечивать субстратом митохондриальное дыхание на свету для синтеза АТФ (Маслов А.И., 1987). На свету дыхательная цепь осуществляет те же реакции, что и при темповом дыхании, только дыхательным субстратом является глицин фотодыхания. Эта гипотеза предполагает участие фотодыхания в энергетике зеленой клетки на свету как заменителя обычного темнового дыхания. При интенсивном фотодыхании глиоксилат, образующийся в пероксисомах, может выходить из них в цитоплазму (Игамбердиев А. У., 1992), наряду с этим в условиях интенсивного фотосинтеза возможна сверхпродукция сукцината в митохондриях за счет модификации работы ЭТЦ и ЦТК. При этом сукцинат и глиоксилат утилизируются в синтазной реакции цитоплазматической ИЦЛ с образованием далее глутамата и других соединений или подвергаются альтернативным превращениям. Пероксисомальный метаболизм в этих условиях может быть связующим звеном в обеспечении взаимосвязи хлоропластного и митохондриалыюго метаболизма, что особенно важно для согласованной работы ЭТЦ в этих органеллах (Бекина Р. М,, 1986; Асамов Д. К., 1991). По заключению Кремера и соавторов, окислительное фосфорилирование в митохондриях является весьма важной функцией в обеспечении цитозоля АТФ во время фотосинтеза (Kromer S., 1991).
Исследования различных авторов показывают возможность не только нефотосинтетичєского, то есть посредством окислительного фосфорилирования, запасания световой энергии в зеленой растительной клетке на свету, но и при совместном функционировании нециклического фотофосфорилирования и митохондриального транспорта электронов (Raghavendra A. S., 1998). Участие фотодыхания в обеспечении митохондриального дыхания субстратом для синтеза АТФ - возможно энергетическая роль фотодыхания. Также гликолатный путь осуществляется и в освещенных этиолированных проростках в отсутствии фотосинтеза, но при наличии в нефотосинтезирующих тканях экзогенного гликолата. Вопрос о том, почему одни растения способны к фотодыханию, а другие нет, до конца еще не выяснен. Одно из объяснений заключается в том, что фотодыхание устраняет избыточную энергию, возникающую за счет фотохимических процессов, и таким образом предотвращает фотоингибирование фиксации СО2, которое может вызываться фотоокислением и разрушение фотохимического аппарата. Фотодыхание защищает растение от фото деструкции в тех случаях, когда ограничение доступа СОг выражено особенно сильно во время недостатка воды и при высокой температуре. Так, например, при очень низкой концентрации СОг энергия рассеивается без реальной фиксации СОг (Krause G.Y. [et ah], 1978).В окислительной ветви фотодыхания (гликолатном пути) энергия рассеивается в фосфогликолатфосфотазной и гликолатоксидазной реакциях, а в восстановительной (глицератный путь) - энергия затрачивается на восстановление гидроксипирувата в пероксисомах и фосфорилирование глицерата в хлоропластах (Маслов А. И., 1991). Образующийся при окислении рибулозо-1,5-бисфосфата фосфогликолат превращается в хлоропластах в гликолат, который мигрирует в пероксисомы, где в присутствии Ог окисляется до глиоксилата гликолатоксидазой. Еще один источник образования гликолата - транскетолазная реакция цикла Кальвина (когда скорость карбоксилирования РуБФ превышает потенциальные возможности использования триозофосфатов в биосинтетических реакциях и в реакции окисления органических кислот под действием 02 ) (Кээрберг О.Ф., 1989). У С4- растений основной путь фотодыхательного метаболизма осуществляется по ЩУК-оксидазному механизму с участием только восстановленных форм кислорода (Любимов В. Ю., 1985).
Также показана возможность синтеза гликолиевой кислоты из пирувата с участием цитоплазматической ИЦЛ в листьях табака на свету (Zelitchl., 1988). Образование гликолата служит началом фото дыхания. Дальнейшее его превращение происходит в хлоропластах, пероксисомах и митохондриях. Фото дыханию отводится некоторая положительная роль в обеспечении клеток промежуточными веществами (глутамат, у-глугаровая кислота, глицин, серии, глицерат и т.п.), важными для дальнейших синтезов (Leegood R. С. [et al.], 1995). Все это свидетельствует о том, что фотодыхание нельзя рассматривать как бесполезный или вредный процесс. Интенсивность метабол изации гликолата может определяться не только регуляцией синтеза ГО, но и модуляцией ее активности соотношением ингибиторов, активаторов, в частности путем диссоциации и ассоциации субъединиц (Магомедов И. М., 1985). Путь окисления гликолата возможен и в цитоплазме: через ЛДГ, которая специфична и к гликолату, вероятно, существует и цитоплазматический пул ГО. Фотодыхание способствует поддержанию постоянства СО2 внутри листа, У растений С типа существует другой механизм поддержания концентрации С02 (фиксация его ЩУК). Фотодыхание тесно связано с общим метаболизмом в зеленой клетке, оно часто усиливается при уменьшении потребности растений в продуктах фотосинтеза и, в принципе, направлено на поддержание активности ферментативных систем и функции хлоропластов и митохондрий (Мокроносов А.Т., 1983). Глиоксилат, образующийся из гликолата, может аминироваться до глицина, из двух молекул которого в митохондриях образуется серии, при этом выделяется С02 (Havir Е. А., 1986). В фотосинтезирующей растительной клетке глиоксилат, оксалат, формиат и другие фотодыхательные интермедиаты участвуют в регуляции
Методы определения активности ферментов
Для выделения ферментов из целых листьев растительный материал измельчали и тщательно растирали с кварцевым песком в среде следующего состава: 50 мМ трис - НС1 буфер, рН - в зависимости от растительного объекта (7,5 - 7,8 для кукурузы, 7,8 - для САМ - растений, 8,0 - для С3 - растений), 3 мМ MgCb, 1 мМ ЭДТА, 3 мМ 3 — меркаптоэтанол. Полученный экстракт фильтровали через 4 слоя марли и центрифугировали при 3000g 10 минут. Для определения активности изучаемых ферментов и дальнейшей очистки использовали полученный супернатант. Для разделения клеток обкладки и мезофилла зеленые листья 18 -дневных проростков кукурузы измельчали в бленд ере в течение 5сек. при t = 0 -4С в среде выделения следующего состава: 50 мМ трис - НС1 буфер, рН 7,5, 1 мМ MgCl2, 1 мМ ЭДТА, 3 мМ р — меркаптоэтанол. Гомогенат фильтровали через 8 слоев марли и центрифугировали при 300g в течение 5 мин. Полученный супернатант, содержащий клетки мезофилла, использовали в дальнейшем для очистки и изучения свойств ГО из данного типа клеток. Неразрушенные ткани, полученные после отжимания гомогената, промывали в среде выделения в течение 2 мин. Эту процедуру проводили для освобождения осадка от клеток мезофилла. Оставшиеся ткани проводящих пучков тщательно растирали с кварцевым песком в фарфоровой ступке на холоде в среде выделения того же состава в соотношении 1:3, затем центрифугировали при 5000g в течение 10 мин. Полученный супернатант использовали в дальнейшем для очистки и изучения свойств ГО из клеток обкладки. Для определения перекрестного загрязнения тканей при очистки ГО из клеток обкладки и мезофилла кукурузы в качестве маркерных ферментов исследовали активность ФЕП - карбоксил азы (для клеток мезофилла) и НАДФ — МДГ (для клеток обкладки). Активность ГО (КФ 1.1.3.15) определяли спектрофотометрически. Реакционная среда содержала 50мМ трис - НС1 буфер, рН 7,5(для кукурузы) или 7,8 - 8,0 (для пшеницы и САМ - растений), 5 мМ MgCl2, 0,5 мМ ЭДТА, 1 мМ ДТТ, 5 мМ гликолата, 4 мМ фенилгидразина - НС1, 0,1 мМ ФМН. Реакцию инициировали внесением ферментного препарата. Об активности ГО судили по увеличению поглощения при 324 нм, обусловленному образованием комплекса глиоксилата (продукта реакции) с фенилгидразином. Активность ГО рассчитывали по формуле:
Определение активности аконитазы (К.Ф, 4,2.1.3) основан на учете разности поглощения цитрата и изоцитрата по сравнению с цис - аконитовой кислотой. Активность АГ определяли спектрофотометрически. Реакционная среда содержала 0,1 М трис - НС1 буфера, рН 8,0, 20мМ цитрата Na. Реакцию инициировали внесением ферментной вытяжки. Об активности судили по увеличению оптической плотности при 240 нм, обусловленному образованием цис - аконитата. Активность аконитазы рассчитывали по формуле: Активность ФГ (К.Ф. 4.2.1.2) определяли спектрофотометрически. Фермент катализирует обратимую гидратацию фумарата с образованием малата в результате присоединения Н и ОН в транс — положении по двойной связи фумаровой кислоты. Среда выделения и спектрофотометрирования содержала 0,1 М фосфатного буфера, рН 7,6, 0,3 мМ малата или 0,43 мМ фумарата. Реакцию инициировали внесением ферментного препарата. Об активности фермента судили по изменению оптической плотности при 240 нм. Активность фумаразы рассчитывали по формуле: 0,972 - коэффициент экстинции; D — оптическая плотность в опытной кювете; Do - оптическая плотность в контрольной кювете; t - время, мин; V - объем ферментной вытяжки, мл; Vo - внесенный объем ферментной вытяжки в кювету, мл. Активность ФЕП - карбоксил азы определяли спектрофотометрически. Реакционная среда содержала 100 мМ три с - НС1 буфер, рН 8,0, 5 мМ MgCl2s 50 мМ NaHC03, ЮмМ ФЕП, МДГ - 1 Е/мл, 0,25 мМ НАДН. Реакцию инициировали внесением НАДН. Об активности фермента судили по падению плотности при 340 нм за счет расходывания НАДН в реакции с ЩУК для образования малата. 6,22 - коэффициент экстинции, определяющий изменение оптической плотности при 340 нм, происходящее при окислении или восстановлении 1 мкМ фермента, находящегося в 1 мл исследуемой смеси, D — оптическая плотность в опытной кювете; Do — оптическая плотность в контрольной кювете; t - время, мин; V - общий объем ферментной вытяжки, мл; Vj - внесенный объем ферментной вытяжки в кювету, мл; V2 - объем раствора в кювете с 1 см - гранью, мл. Очистку проводили при 0 - 4 С в несколько стадий. Стадия 1. Получение гомогената. При выделении ГО из целых листьев растительный материал гомогенизировали в среде выделения (50 мМ трис-HCI буфер, рН 7,8 - 8,0, 3 мМ MgCl2, 1 мМ ЭДТА, 3 мМ р - меркаптоэтанол). Затем фильтровали через 4 слоя марли и центрифугировали 15 минут при 3000 g. Для дальнейших исследований использовали полученный супернатант. Стадия 2. Фракционирование (NH4)2 S04. Белки из надосадочной жидкости дифференциально высаливали с применением (NH4)2 S04 (65 - 75 % насыщения). Для этого в ферментную вытяжку добавляли в течение 15 минут сухого (NH4)2S04 при постоянном помешивании магнитной мешалкой. Количество добавляемого (NH4)2S04 на объем вытяжки рассчитывали по таблице Гродзинского (Гродзинский А. М, 1973). В процессе высаливания осуществляли постоянный контроль рН среды, добавляя при необходимости 1 М NaOH, поскольку под действием сульфата аммония может подкисляться среда, что, в свою очередь, приводит к инактивации фермента и снижению его выхода в ходе фракционирования.
Осадок собирали центрифугированием в течение 40 минут при 8000 g, растворяли в 10 мМтрис-НО буфере, рН 7,8, содержащем І мМ ДТТ. Стадия 3. Гель-фильтрация. Для проведения гель — фильтрации использовали сефадекс G-25 (medium) (Pharmacia, Sweden). Колонки готовили из стекла, оттягивая один конец, при этом стремились к наличию минимального холостого объема. Сефадекс G-25 набухал не менее трех часов в 5 мМ трис - НО буфере, рН 7,5. Колонки хранили в холодильнике при =2С с добавлением 0,5 мМ азида натрия и промывали перед использованием для опытов соответствующими средами элюции. Для освобождения от (NH4)2S04 и низкомолекулярных примесей полученную фракцию наносили на колонку с G-25 (1,3x20 см) и элюировали со скоростью 0,5 мл/мин. 20 мМ трис-НС1 буфером, содержащим 1 мМ ДТТ, 0,5 мМ MgClj. Отсутствие NH4+ в активных фракциях элюата проверяли при помощи реактива Несслера. Стадия 4. Ионно-обменная хроматография на ДЭАЭoyoperl (Тоуо — Soda, Japan). Раствор фермента наносили на колонку из ДЭАЭ- Toyoperl (1x20 см), уравновешенную тем же буфером и элюировали фермент линейным градиентом KCI (от 0 до 200 мМ). Скорость элюции составила 0,3 мл/мин.
Очистка ГО из С3 - и С4 - растений
Для изучения каталитических и некоторых регуляторних свойств ГО из растений с различным типом метаболизма была проведена очистка изучаемого фермента из целых зеленых листьев Сз - растений пшеницы и С4 - растения кукурузы. Очистку ГО из листьев пшеницы проводили для сравнения свойств изучаемого фермента в растениях Сз - и С4 - типом метаболизма.Исследование свойств ГО из зеленых листьев пшеницы проводили после предварительной очистки фермента, результаты которой представлены в таблице 4. Применение сульфата аммония позволило очистить фермент из листьев пшеницы по сравнению с фракцией гомогената в 10 раз, Уд. активность возросла с 0,048 до 0,48 Е/ мг белка. Максимум активности ГО осаждался в 65 - 75% фракции сульфата аммония, выход при этом составил 90%. Обессоливание ферментного препарата производили с помощью гель - фильтрации на сефа-дексе G - 25. Колонку предварительно уравновешивали 10 мМ трис - НС1 буфером, рН 7,8, содержащим 1 мМ дитиотрейтола и 1 мМ MgC - Удельная активность при этом увеличивалась незначительно (до 0,75 Е/ мг белка) за счет, очевидно, освобождения от низкомолекулярных примесей, Для последующей очистки белковую фракцию наносили на колонку с ДЭАЭ — Toyoperl. В результате элюции линейным градиентом KCI (0 - 300 мМ) показано, что в зеленых листьях пшеницы обнаруживается только один пик активности изучаемого фермента (Рис. 3). Удельная активность ГО из листьев пшеницы в результате проведенной очистки составила 2,06 Е/ мг белка. Фермент был очищен в 43 раза, выход составил 40 %. Для изучения и сравнения каталитических, и регуляторних свойств ГО из различных типов клеток С4 - растения кукурузы была проведена предварительная очистка ГО из целых листьев кукурузы, результаты которой представлены в таблице 5. Для очистки фермента из целых листьев кукурузы использовали преципитацию сульфатом аммония, гель - фильтрацию через сефадекс G -25 и ион -обменную хроматографию на ДЭАЭ — Toyoperl.
Применение фракционирования сульфатом аммония позволило очистить ферментный препарат по сравнению с гомогенатом в 3 раза, удельная активность при этом возросла с 0,013 до 0,039 Е/ мг белка, выход составил 34,8%. Меньший выход ГО при преципитации сульфатом аммония в кукурузе по сравнению с пшеницей может быть связан с инактивацией фермента из С4 - растения кукурузы в присутствии сульфата аммония, а также нестабильностью самого фермента из данного вида растений. Для обессоливания применяли гель — фильтрацию на сефадексе G - 25. Колонку с сефадексом G - 25 предварительно уравновешивали 10 мМ Трис -НС1 буфером, рН 7,5, содержащим 1 мМ ДТТ и 1 мМ MgCb- Удельная активность возрастала незначительно за счет удаления низкомолекулярных соединений. Отсутствие в полученной белковой фракции ионов аммония проверяли с помощью реактива Несслера. Для дальнейшей очистки ферментный препарат с удельной активностью 0,059 Е/ мг белка наносили на колонку с ДЭАЭ - Toyoperl. В результате элюции линейным градиентом КС1 (0 — 300 мМ) показано, что в С4- растении кукурузе наблюдается 3 пика активности ГО (рис. 4). Первый пик активности изучаемого фермента (в дальнейшем ГО і) из целых листьев кукурузы эллируется при 50-70 мМ КС1, второй - при 190-220 мМ КС1 (ГО2) и третий пик активности ГО обнаруживается при 250 - 270 мМ КС1 (Г03). Удельная активность различных изоформ ГО составила 1.6,0.72 и 0.48 Е/мг белка, что соответствует степени очистки в 123, 55,4 и 36,9 раза, выход изоформ ГО составил 6,8, 2,3 и 2,9% соответственно. Для дальнейшего изучения свойств ГО из различных типов клеток С4 -растений была проведена очистка фермента отдельно из клеток обкладки и мезофилла кукурузы. Она состояла из следующих стадий: разделение клеток обкладки и мезофилла, гель - фильтрация на сефадексе G - 25 и ионобменная хроматография на ДЭАЭ — Toyoperl. Для очистки ГО из клеток обкладки и мезофилла кукурузы не использовали фракционирование сульфатом аммония в связи с сильным ингибирующим эффектом последнего. При очистке ГО из клеток обкладки кукурузы разделение двух типов тканей производили по разработанной в ходе эксперимента методике, описанной выше. В результате чего получили белковую фракцию с удельной активностью ГО 0,027 Е/мг белка. Далее ее наносили на колонку с сефадсксом G - 25, уравновешенную предварительно 10 мМ Трис - НС1 буфером, рН 7,5, содержащим 1 мМ ДТТ и 1 мМ MgCl2. Гель - фильтрацию на сефадексе G - 25 применяли для удаления низкомолекулярных примесей. Для дальнейшей очистки белковый препарат с удельной активностью 0,05 Е/мг белка наносили на ДЭАЭ - Toyoperl. При элюции КС1 (0 - 300 мМ) в клетках обкладки кукурузы обнаружено 2 пика активности ГО. Первый пик активности, соответствующий пику ГОї из целых листьев кукурузы, элюировался при 50-70 мМ КС1 с удельной активностью 1,26 Е/мг белка. Степень очистки этой изоформы ГО составила 46,7 раза, а выход - 7,5%. Второй (минорный) пик активности изучаемого фермента обнаруживался при 190 - 220 мМ КО (рис. 5). Удельная активность ГС 2 составила 0,55 Е/ мг белка, степень очистки — 20,4 раза, выход 3,0 %. Обнаружение этого пика в клетках обкладки скорее всего связано с перекрестным загрязнением этого типа клеток мезофиллом (Табл. 6). Очистку ГО из мезофилла кукурузы проводили по той же схеме, что и очистку ГО из клеток паренхимной обкладки. Результаты типичной очистки представлены в таблице 7. После гель - фильтрации на сефадексе G - 25 белковую фракцию с удельной активностью ГО 0,015 Е/мг белка наносили на колонку с ДЭАЭoyoperl для ионобменной хроматографии. При элгоции линейным градиентом КС1 (0 — 300 мМ) было получено 3 пика активности ГО. Первый пик активности фермента соответствовал элюции ГОІ из клеток обкладки. Удельная активность его составила 0,32 Е/мг белка, степень очистки - 58,2 раза, а выход - 3,1%. Т. к. общая активность ГОї в клетках обкладки значительно выше, чем в мезофилле кукурузы (0,184 и 0,025 Е соответственно), то, вероятно, обнаружение ГО і в мезофилле кукурузы связано с перекрестным загрязнением этого типа клеток обкладкой (около 8 %). Это означает, что изоформа ГО локализована исключительно в клетках обкладки. Второй пик активности ГО, элюируемый при 190 - 220 мМ КО, соответствующий ГОг из целых листьев кукурузы, обнаруживается как при очистке ГО из клеток обкладки, так и мезофилла кукурузы. Удельная активность Г02 из мезофилла составила 0,43 Е/мг белка, степень очистки - 78,2 раза, выход — 9,5% (табл. 7). Третий пик активности изучаемого фермента, элюируемый при 250 -270 мМ КС1, обнаруживается только при очистке ГО из мезофилла и соответствует пику Г03 из целых листьев кукурузы (Рис. 6). Изоформа Г03 из мезофилла была очищена в 81,8 раза, удельная активность составила 0,45 Е/мг белка., а выход- 11,0%. Т. о., очистка ГО из целых листьев кукурузы и клеток обкладки и мезофилла этого же растения показала наличие 3 изоформ фермента.
Первая изоформа (ГОї) элюируемая при 50 - 70 мМ КС1, локализована преимущественно в клетках обкладки. Обнаруживаемая активность ГО в мезофилле кукурузы связана, скорее всего, с перекрестным загрязнением тканей в результате процедуры очистки, что подтверждается значительными различиями в значениях общей активности ГОї в клетках обкладки и мезофилла кукурузы - почти в 7,5 раз. Вторая изоформа (Г02), которая элюируется при 190 - 220 мМ КС1, имеет двойственную локализацию, причем общая активность Г02 в клетках обкладки и мезофилле отличается незначительно (0,184 и 0,077 Е соответственно). Третья изоформа (ГОз), элюируемая при 250 - 270 мМ КО, локализована исключительно в мезофилле кукурузы. Для дальнейшего изучения кинстичнских свойств ГО из различных типов тканей использовали очищенные белковые препараты ГО і и ГОз.
