Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Общая характеристика аэробных метилотрофных бактерий 8
1.1. Таксономическое разнообразие аэробных метанотрофов 8
1.2. Пути окисления Q - соединений у метилотрофных бактерий 9
1.3. Система транспорта электронов и окислительное фосфорилирование 13
1.4. Пути ассимиляции С]-соединений . 14
1.5. Центральный метаболизм 20
Глава 2. Энзимологические аспекты метаболизма неорганического пирофосфата 21
2.1. Пути образования и локализация ФФ в клетках 21
2.2. Пирофосфатзависимые ферменты микроорганизмов 24
2.3. Характеристика и метаболическая роль неорганических пирофосфатаз 25
2.4. Свойства и метаболическая роль ПФК 27
2.5. Филогенетический анализ и эволюция ПФК 35
Глава 3. Объекты и методы исследования 41
3.1. Объекты исследований 41
3.2. Культивирование бактерий 41
3.3. Методы разрушения клеток и получения бесклеточных экстрактов 42
3.4. Измерение активности ферментов 43
3.5. Очистка ПФК из М. methanica 12 47
3.6. Очистка пирофосфатазы из Mmethamca 12 47
3.7. Электрофоретические методы. 49
3.8. Иммуноцитохимическое выявление ПФК в клетках M.methanica 12 50
3.9. Гель-хроматография 51
3.10. Определение кинетических параметров ПФКиФФ,газы 52
3.11. Включение3 Р-ортофосфатав ФФ„ и Фр-1,6-Ф2 в реакции ПФК in vitro 52
3.12. Молекулярно-биологические методы 54
3.12.1. Манипуляции с хромосомной ДНК М. methanica 12 54
3.12.2. Методы с использовашем ПЦР 55
3.12.3. Выделение плазмид из рекомбинантных клонов 57
3.12.4. Секвенирование ПЦР - продуктов 58
3.12.5. Филогенетический анализ генов ПФК и АТФ-ФФК 58
3.12.6. Клонирование, экспрессия и очистка рекомбинантной ПФК 58
3.13. Аналитические методы 60
Глава 4. Результаты и обсуждение. 63
4.1. Распространение ПФК у аэробных метилотрофных бактерий 63
4.2. Влияние условий культивирования М. methanica на активность ПФК и ФФ,газы 66
4.3. Вігутриклеточная локализация ФФн-зависимых ферментов M.methanica 12 74
4.4. ОчисткаихарактериегикаПФКЛ/те//гашсй12 81
4.5. Очистка и характеристика неорганической пирофосфатазы М. methanica 12 90
4.6. Секвенирование гена ПФК М. methanica 12 , 97
4.7. Клонирование и экспрессия гена ПФК М. methanica 12 102
4.8. Метод биосинтеза ФФН, меченного фосфором Р 103
Заключение , 109
Выводы 114
Список литературы 115
- Пути окисления Q - соединений у метилотрофных бактерий
- Свойства и метаболическая роль ПФК
- Включение3 Р-ортофосфатав ФФ„ и Фр-1,6-Ф2 в реакции ПФК in vitro
- Влияние условий культивирования М. methanica на активность ПФК и ФФ,газы
Введение к работе
Актуальность проблемы. Бактерии, использующие метан в качестве источника углерода и энергии (метанотрофы), вносят существенный вклад в глобальный круговорот углерода и азота биосферы. Метанотрофы представляют потенциальный интерес для производства кормового белка и различных полезных продуктов, а так же биодеградации, биотрансформации алифатических и ароматических поллютантов, снижения содержания метана в угольных шахтах, создания биосенсоров и энергетических биоэлементов [Малашенко с соавт., 1978,1993; Murrell, Dalton, 1992; Гальченко, 2001; Троценко с соавт., 2006]. Очевидно, что для эффективной реализации биотехпологического потенциала метанотрофов и понимания их роли в различных экосистемах необходимы детальные знания об организации и регуляции метаболизма у данных бактерий. Хотя интенсивные исследования биохимии метанотрофов привели к расшифровке специфических путей окисления и ассимиляции Сі-соединений, тем не менее, остаются мало изученными метаболизм и функции неорганического пирофосфата (ФФН). При этом следует отметить существенные изменения в представлениях о метаболической роли ФФ„. Установлено, что у высших растений и ряда микроорганизмов энергия ФФ„ не теряется при гидролизе неорганической пирофосфатазой (ФФ„-азой), а используется в ряде ферментативных реакций. Это подтвердили открытие пирофосфатзависимых ферментов, биосинтеза ФФ„ в процессе фотосинтеза и окислительного фосфорилирования; потребление экзогенного ФФН и стимулирующее действие на рост некоторых микроорганизмов [Kulaev, Vagabov, 1983; Кулаев с соавт., 2005].
40 лет назад классические исследования группы Квейла в Шеффилдском
университете (Англия) привели к открытию нового метаболического пути -
рибулозомонофосфатного (РМФ) цикла ассимиляции Сі-соединений у метанотрофов.
Первые две реакции данного цикла катализируют специфические ферменты 3-
гексулозофосфатсинтаза (ГФС) и фосфо-3-гексулоизомераза (ФГИ):
ГФС ФГИ
НСНО + Рибулозо-5Ф *г [Р-арабино-]Згексулозо-6Ф *- Фруктозо-6Ф
Предполагалось, что последующее фосфорилирование фруктозо-6-фосфата до фруктозо-1,6-бисфосфата катализирует АТФ-зависимая 6-фосфофруктокиназа (ФФК), являясь ключевой регуляторной стадией РМФ цикла. Однако факт очень низкой (2-8 мЕ/мг белка) активности ФФК у метанотрофов ставил под сомнение реальность и значимость гликолитического варианта РМФ цикла. Наличие небольших активностей ферментов пути Энтнера-Дудорова у данных бактерий привело к модификации схемы РМФ цикла, которая учитывала одновременное функционирование двух путей регенерации первичного
акцептора формальдегида (рибулозо-5-фосфата). Это позволяло считать проблему «замкнутости» РМФ цикла условно решенной [Strom ct al., 1974]. Однако обнаружение активности пирофосфатзависимой 6-фосфофруктокиназы (ПФК) и высокой внутриклеточной концентрацией ФФН у облигатных метаноторофов [Шишкина, Троценко, 1990; Trotsenko, Shishkina, 1990] реанимировало интерес к изучению особенностей организации и регуляции РМФ цикла, и, в частности, роли ПФК в Сі-метаболизме данных бактерий, что требовало экспериментальной проверки. Кроме того, изучение свойств ПФК облигатных метапотрофов важно для понимания структурно-функционального разнообразия и эволюции данного фермента.
Цель и задачи исследования. Основная цель данной работы - определить свойства и роль пирофосфатзависимой 6-фосфофруктокиназы в метаболизме облигатного метанотрофа Melhylomonas methanka 12. Для достижения указанной цели были поставлены и решались следующие задачи:
Определить активности ФФН - и АТФ -зависимой 6-фосфофруктокиназы, а также пирофосфатазы у аэробных метилобактерий различных таксономических групп.
Исследовать влияние условий культивирования на активности и локализацию ПФК, пирофосфатазы и щелочной фосфатазы у M.methctnica 12.
Выделить и изучить свойства ПФК и пирофосфатазы М. methanica 12.
Идентифицировать и секвенировать ген pfk, кодирующий ПФК М. methanica 12. Научная новизна. Установлено, что высокая активность ПФК сопровождается
низкой активностью ФФн-азы и отсутствием ФФК у облигатных метанотрофов I, И и X типов. Напротив, у не использующих4"' метилобактерий разного таксономического положения, независимо от реализуемых путей С [-ассимиляции, активность ФФ„-азы выше, а ПФК отсутствует. Исключением является факультативный метилотоф Amycolalops'is melhanolica, обладающий небольшими активностями ПФК, ФФК и ФФ„-азы.
Выявлено высокое содержание ФФц в клетках M.methanica 12 при различных условиях культивирования, даже на среде, дефицитной по фосфору, наряду с присутствием конститутивных ПФК и ФФ„-азы, что доказывает участие ФФН не только в резервировании фосфата, но и в конструктивном и энергетическом метаболизме данного метанотрофа. Найдена сскретируемая ЩФ, индуцируемая дефицитом фосфора. Обнаружено, что активность ФФн-азы М. methanica 12 локализуется в цитоплазме и в мембранах в разном соотношении в зависимости от условий роста клеток. Растворимая ФФ„-аза М. methanica 12 впервые очищена до гомогенного состояния и охарактеризована. Получены доказательства регуляторной природы растворимой ФФ,газы (олигомерная структура, положительная кооперативное^, низкое сродство к ФФК, а также активирующее действие Mg ).
Иммуноцитохимическим методом обнаружено присутствие ПФК в ассоциированном виде наряду с равномерным распределением в цитоплазме клеток М. methamca 12.
Впервые очищена и охарактеризована ПФК М. methanica 12, близкая по основным молекулярным свойствам аналогичным ферментам других микроорганизмов (кроме ПФК из A, meihanolica), но отличается наибольшей удельной активностью, Секвснировап ген pjk М. methamca 12, кодирующий белок с высокой степенью дивергенции относительно ПФК Methylococcus capsulatus Bath и A. meihanolica, но близкой ферменту из Propionibacterium freudcnreichii. Предложен новый вариант РМФ цикла, сопряженного с ПФК, что имеет принципиальное значение для понимания метаболической организации и эволюции метанотрофов.
Научно-практическое значение. Определены условия культивирования для максимального проявления активности и разработана схема очистки ПФК, что позволяет рассматривать Ы. methanica 12 в качестве эффективного продуцента данного фермента для определения ФФ„, С использованием препарата ПФК разработан простой метод биосинтеза меченного Э2[Р]ФФН для научных исследований. Установлена способность М. methanica 12 расти на ФФН, что может найти применение в процессах биосинтеза и биоремедиации.
Апробация работы. Основные положения диссертации доложены па симпозиумах «Рост микроорганизмов на С] -соединениях» (Уорик, Англия, 1992; Сан-Диего, США, 1995), научных конференциях "Биосинтез и деградация микробных полимеров" (Пущино, 1995), "Автотрофные микроорганизмы", посвященной памяти акад. Е.Н. Кондратьевой (МГУ, 1996) и отчетных конференциях ИБФМ РАН.
Благодарности. Автор благодарен сотрудникам ИБФМ, способствовавшим выполнению данной диссертационной работы: д.б.н. Крупянко В.И., д.б.н. Дорониной Н,В., к.х.ц, Шляпникову М.Г., к.б.н. Ивашиной Т.В., к.б.н. Сузиной Н.Е., к.б.н. Шабалину Ю.А., к.б.н. Решетникову А.С., к.б.н. Ешииимаеву Б.Ц., асп. Мустахимову И.И., вед. инж. Петрову Н.Н, и Забирову Р.Х, Особую признательность автор выражает своим наставникам и учителям —Д.6.Н., проф. Троценко Ю.А. и д.б,н. Хмелениной В.Н.
Место проведения работы. Экспериментальная часть работы выполнена в лаборатории радиоактивных изотопов ИБФМ им. Г.К. Скрябина РАН в рамках темы «Структурно-функциональное и таксономическое разнообразие аэробных метилотрофов» (№ Госрегистрации 01.20.0403398) и в рамках целевых конкурсных грантов РФФИ «Исследование роли неорганического пирофосфата в метаболизме аэробных метилотрофных бактерий» (95-04-12514а), «Экстремофильные аэробные метилотрофы: физиолого-биохимические особенности и филогения» (98-04-48144а), а также грантов Дж. Сороса «Pyrophosphate metabolism in aerobic methylotrophic bacteria» (NJ 2000 и NJ 2300).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 6 статей и 4 тезисов. Структура и объем работы. Диссертация изложена на 134 стр. и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части и обсуждения, заключения и выводов, списка литературы, включающего 270 ссылку, из них 37 на русском и 233 на английском языках, содержит 19 таблиц и 31 рисунок.
Пути окисления Q - соединений у метилотрофных бактерий
Бактерии, использующие метан в качестве источника углерода и энергии (метанотрофы), вносят существенный вклад в глобальный круговорот углерода и азота биосферы. Метанотрофы представляют потенциальный интерес для производства кормового белка и различных полезных продуктов, а так же биодеградации, биотрансформации алифатических и ароматических поллютантов, снижения содержания метана в угольных шахтах, создания биосенсоров и энергетических биоэлементов [Малашенко с соавт., 1978,1993; Murrell, Dalton, 1992; Гальченко, 2001; Троценко с соавт., 2006]. Очевидно, что для эффективной реализации биотехпологического потенциала метанотрофов и понимания их роли в различных экосистемах необходимы детальные знания об организации и регуляции метаболизма у данных бактерий. Хотя интенсивные исследования биохимии метанотрофов привели к расшифровке специфических путей окисления и ассимиляции Сі-соединений, тем не менее, остаются мало изученными метаболизм и функции неорганического пирофосфата (ФФН). При этом следует отметить существенные изменения в представлениях о метаболической роли ФФ„. Установлено, что у высших растений и ряда микроорганизмов энергия ФФ„ не теряется при гидролизе неорганической пирофосфатазой (ФФ„-азой), а используется в ряде ферментативных реакций. Это подтвердили открытие пирофосфатзависимых ферментов, биосинтеза ФФ„ в процессе фотосинтеза и окислительного фосфорилирования; потребление экзогенного ФФН и стимулирующее действие на рост некоторых микроорганизмов [Kulaev, Vagabov, 1983; Кулаев с соавт., 2005]. лет назад классические исследования группы Квейла в Шеффилдском университете (Англия) привели к открытию нового метаболического пути рибулозомонофосфатного (РМФ) цикла ассимиляции Сі-соединений у метанотрофов. Первые две реакции данного цикла катализируют специфические ферменты 3 гексулозофосфатсинтаза (ГФС) и фосфо-3-гексулоизомераза (ФГИ): ГФС ФГИ НСНО + Рибулозо-5Ф г [Р-арабино-]Згексулозо-6Ф - Фруктозо-6Ф Предполагалось, что последующее фосфорилирование фруктозо-6-фосфата до фруктозо-1,6-бисфосфата катализирует АТФ-зависимая 6-фосфофруктокиназа (ФФК), являясь ключевой регуляторной стадией РМФ цикла. Однако факт очень низкой (2-8 мЕ/мг белка) активности ФФК у метанотрофов ставил под сомнение реальность и значимость гликолитического варианта РМФ цикла. Наличие небольших активностей ферментов пути Энтнера-Дудорова у данных бактерий привело к модификации схемы РМФ цикла, которая учитывала одновременное функционирование двух путей регенерации первичного акцептора формальдегида (рибулозо-5-фосфата). Это позволяло считать проблему «замкнутости» РМФ цикла условно решенной [Strom ct al., 1974]. Однако обнаружение активности пирофосфатзависимой 6-фосфофруктокиназы (ПФК) и высокой внутриклеточной концентрацией ФФН у облигатных метаноторофов [Шишкина, Троценко, 1990; Trotsenko, Shishkina, 1990] реанимировало интерес к изучению особенностей организации и регуляции РМФ цикла, и, в частности, роли ПФК в Сі-метаболизме данных бактерий, что требовало экспериментальной проверки. Кроме того, изучение свойств ПФК облигатных метапотрофов важно для понимания структурно-функционального разнообразия и эволюции данного фермента. Цель и задачи исследования. Основная цель данной работы - определить свойства и роль пирофосфатзависимой 6-фосфофруктокиназы в метаболизме облигатного метанотрофа Melhylomonas methanka 12. Для достижения указанной цели были поставлены и решались следующие задачи: 1. Определить активности ФФН - и АТФ -зависимой 6-фосфофруктокиназы, а также пирофосфатазы у аэробных метилобактерий различных таксономических групп. 2. Исследовать влияние условий культивирования на активности и локализацию ПФК, пирофосфатазы и щелочной фосфатазы у M.methctnica 12. 3. Выделить и изучить свойства ПФК и пирофосфатазы М. methanica 12. 4. Идентифицировать и секвенировать ген pfk, кодирующий ПФК М. methanica 12. Научная новизна. Установлено, что высокая активность ПФК сопровождается низкой активностью ФФн-азы и отсутствием ФФК у облигатных метанотрофов I, И и X типов. Напротив, у не использующих4" метилобактерий разного таксономического положения, независимо от реализуемых путей С [-ассимиляции, активность ФФ„-азы выше, а ПФК отсутствует. Исключением является факультативный метилотоф Amycolalops is melhanolica, обладающий небольшими активностями ПФК, ФФК и ФФ„-азы. Выявлено высокое содержание ФФц в клетках M.methanica 12 при различных условиях культивирования, даже на среде, дефицитной по фосфору, наряду с присутствием конститутивных ПФК и ФФ„-азы, что доказывает участие ФФН не только в резервировании фосфата, но и в конструктивном и энергетическом метаболизме данного метанотрофа. Найдена сскретируемая ЩФ, индуцируемая дефицитом фосфора. Обнаружено, что активность ФФн-азы М. methanica 12 локализуется в цитоплазме и в мембранах в разном соотношении в зависимости от условий роста клеток. Растворимая ФФ„-аза М. methanica 12 впервые очищена до гомогенного состояния и охарактеризована. Получены доказательства регуляторной природы растворимой ФФ,газы (олигомерная структура, положительная кооперативное , низкое сродство к ФФК, а также активирующее действие Mg ). Иммуноцитохимическим методом обнаружено присутствие ПФК в ассоциированном виде наряду с равномерным распределением в цитоплазме клеток М. methamca 12. Впервые очищена и охарактеризована ПФК М. methanica 12, близкая по основным молекулярным свойствам аналогичным ферментам других микроорганизмов (кроме ПФК из A, meihanolica), но отличается наибольшей удельной активностью, Секвснировап ген pjk М. methamca 12, кодирующий белок с высокой степенью дивергенции относительно ПФК Methylococcus capsulatus Bath и A. meihanolica, но близкой ферменту из Propionibacterium freudcnreichii. Предложен новый вариант РМФ цикла, сопряженного с ПФК, что имеет принципиальное значение для понимания метаболической организации и эволюции метанотрофов. Научно-практическое значение. Определены условия культивирования для максимального проявления активности и разработана схема очистки ПФК, что позволяет рассматривать Ы. methanica 12 в качестве эффективного продуцента данного фермента для определения ФФ„, С использованием препарата ПФК разработан простой метод биосинтеза меченного Э2[Р]ФФН для научных исследований. Установлена способность М. methanica 12 расти на ФФН, что может найти применение в процессах биосинтеза и биоремедиации. Апробация работы. Основные положения диссертации доложены па симпозиумах «Рост микроорганизмов на С] -соединениях» (Уорик, Англия, 1992; Сан-Диего, США, 1995), научных конференциях "Биосинтез и деградация микробных полимеров" (Пущино, 1995), "Автотрофные микроорганизмы", посвященной памяти акад. Е.Н. Кондратьевой (МГУ, 1996) и отчетных конференциях ИБФМ РАН. Благодарности. Автор благодарен сотрудникам ИБФМ, способствовавшим выполнению данной диссертационной работы: д.б.н. Крупянко В.И., д.б.н. Дорониной Н,В., к.х.ц, Шляпникову М.Г., к.б.н. Ивашиной Т.В., к.б.н. Сузиной Н.Е., к.б.н. Шабалину Ю.А., к.б.н. Решетникову А.С., к.б.н. Ешииимаеву Б.Ц., асп. Мустахимову И.И., вед. инж. Петрову Н.Н, и Забирову Р.Х, Особую признательность автор выражает своим наставникам и учителям —Д.6.Н., проф. Троценко Ю.А. и д.б,н. Хмелениной В.Н.
Свойства и метаболическая роль ПФК
Показано, что реакция зависит от ионов магния. При рН 7,0 и 2,5 мМ MgCb были получены следующие значения кажущихся Кц к субстратам прямой и обратной реакции: ФФН - 14 мкМ; фруктозо-6-фосфату - 38 мкМ; фруктозо-1,6-бисфосфату - 18мкМ; к ортофосфату - 800 мкМ. Значения Vmax прямой и обратной реакции были одинаковы. Сообщалось также о присутствии в экстрактах Е. histolytica в следовых количествах АТФ-ФФК, причем данная активность зависела от условий получения экстрактов и не выдерживала лиофилизации. Разрушение биомассы ультразвуком приводило к потере этой активности, тогда как ПФК сохранялась. В пользу того, что эта реакция катализируется двумя разными ферментами, авторы приводили результаты фракционирования АТФ- и ФФн-зависимых активностей колоночной хроматографией на Bio-Gel Р-300, при этом АТФ-зависимый фермент осаждался при ультрацентрифугировании 100000 g в течение 4 ч. Кроме того, была показана невозможность замещения ФФН на АТФ, ГТФ, УТФ, ЦТФ и типолифосфат в реакции, катализируемой ПФК. Предполагалось, что ПФК у Е. hystolhka играет главную роль в гликолизе, так как наблюдаемой активности АТФ-зависимого фермента было явно недостаточно для роста. Были определены также внутриклеточные концентрации (мМ): ФФН - 0,18; фруктозо- 6-фосфата - 0,16; фруктозо-1,6-бисфосфата -0,13; ортофосфата -2,8; АТФ - 0,65. Значимость ФФН в метаболизме данного организма следует, по мнению авторов, во-первых, из сопоставимой с другими метаболитами концентрации, а во-вторых, из факта присутствия еще двух ФФн-зависимых ферментов: пируват-ортофосфатдикиназы и фосфоенолпируваткарбоксикиназы. Однако обратимость реакции, катализируемой ПФК, и отсутствие аллостерических эффекторов оставили открытым вопрос о регуляции гликолиза у Е. hystolitka [Reeves et al., 1974]. Изучая энергетику реакции гидролиза пирофосфата, Wood (1977) предположил, что концентрация магния может изменять соотношение скоростей прямой и обратной реакций и определять, таким образом, направление реакции, катализируемой ПФК, но экспериментального подтверждения этой гипотезы пока нет.
В 1975 г появилось первое сообщение о присутствии ПФК у Propionibacterium shermanii [O Brien et al., 1975]. Фермент был выделен и охарактеризован, М.м. нативного белка по данным ультрацентрифугировапия составляла 95 кДа (коэффициент седиментации 5,1 S). ДСН-электрофорез показал, что ПФК P. shermanii состоит из двух одинаковых субъединиц с м.м. 48 кДа. Была установлена субстратная специфичность фермента по отношению к фруктозо-6-фосфату и фруктозо-1,6-бисфосфату. АТФ, ИТФ, ГТФ, ЦТФ, УТФ не замещали ФФ, - Слабая активность, наблюдаемая с некоторыми из этих субстратов, после их предварительной обработки дрожжевой пирофосфатазой, исчезала. В обратном направлении ортофосфат может замещаться арсенатом, при этом значение Км для арсената выше, чем для Ф„, но Vmax оставалась без изменений. Были определены значения Км при рН 7,4 к; ФФК - 69 мкМ; ФрбФ - 100 мкМ; Ф„ - 600 мкМ; Фр1,6Р2 -51мкМ, а также к Mg иМп в прямой и обратной реакции - 83 и64мкМ, соответственно. У max прямой реакции - 25 S мкмоль/ мин на мг бело, а обратной - 232мкмо ль/мин х мг. При росте P. shermanii на глюкозе отмечалось снижение удельной активности ПФК, по сравнению с клетками, выращенными на глицерине или лактате. Были также исследованы активности АТФ-ФФК и фруктозо-1,6-бисфосфатазы, но их активности были в 5-6 и 10-20 раз, соответственно, ниже, чем активность ПФК, что указывало на энергетическую роль ФФ„ у P. shermanii и Е. histolytica. Обнаружение гшруват-ортофосфатдикиназной активности и ПФК у Е, histolytica является примером использования энергии ФФ„ для субстратного фосфорилирования. Авторы предполагают функционирование ПФК как в гликолизе, так и глюконеогенезе у P. shermanii, что определяется природой ростового субстрата (Q- или Сз- сахара) [O Brien et al,, 1975].
В качестве возможных источников ФФ„ для ПФК приводятся реакции, катализируемые пируват-ортофосфатдикиназой и ФЕП-карбокситрансфосфорилазой. Однако их активности в бесклеточных экстрактах невысоки, в связи чем было предположено, что необходимый ФФ„ также образуется при НАДН-зависимом восстановлении фумарата до сукцината, связанном с ЭТЦ, а также при синтезе жиров, углеводородов, белков и нуклеиновых кислот. Кроме того, в данной работе подчеркнута важность понимания регуляции ПФК и связанные с этим трудности. Поскольку па активность фермента не оказывали влияния 1 мМ АТФ, АМФ, ФЕП, малат, пируват или цитрат, был сделан вывод об отсутствии аллостерической регуляции ПФК[0 Вгіеп et al., 1975].
Reeves с соавт,, (1976) более детально исследовали механизм реакции, катализируемой ПФК, при этом интерес к этому ферменту авторы объясняли важностью катализируемой реакции в регуляции гликолиза. Так как АТФ-ФФК у Е. histolytica присутствует в следовых количествах, а активность ПФК на порядок выше, чем наблюдаемая скорость гликолиза, предполагалось, что ПФК должна участвовать в его регуляции. Гель-фильтрацией на сефадексе G-200 определена м.м. нативного фермента - 83 кДа. рі в пределах рН 5,8-6,0. Ни один из проверенных субстратов: ацетилфосфат, карбамоилфосфат, три полифосфат, полифосфат (п=15), АДФ и АТФ не замещали ФФ„. Только в обратной реакции арсенат натрия замещал ортофосфат, при этом, Км к арсенату была в 4 раза выше, чем к Фн. Подтверждена абсолютная зависимость реакции от катионов двухвалентных металлов. По стимулирующему эффекту па прямую реакцию при концентрации 10 мкМ они располагались в следующем порядке: Mn2+ Mg2+ Со2+. Напротив Са2+, Ni2+, Zn2+ ингибировали прямую и обратную реакции даже в присутствии Mg2+, Сродство фермента к ФФН зависело от концентрации магния в среде, определены Км к Mg2+ для прямой (8 мкМ) и обратной (500 мкМ) реакций. На основании отсутствия существенного изотопного обмена между Ф„ и ФФ„ или между фруктозо-6-фосфатом и фруктозо-1,6-бисфосфатом в отсутствии третьего субстрата была исключена возможность образования промежуточной фосфорилированной формы фермента и "пинг-понг" механизма реакции. Исследуя взаимодействие субстратов и продуктов, авторы сделали вывод о неупорядоченном механизме реакции. ФФН, Фн и фруктозо-1,6-бисфосфат являются конкурентами фруктозобисфосфата, ФФН и фруктозо-б-фосфата, соответственно. Фруктозо-б-фосфат и ортофосфат были неконкурентными ингибиторами в отношении друг друга. Эти данные указывали па возможность образования "тупиковых" комплексов в реакции, катализируемой ПФК. На основании определенных констант равновесия и концентраций субстратов ПФК в клетках Е. histolytica и P. shermanii установлено равновесное состояние реакции in vivo, что не позволяет считать ее ключевым регуляторным пунктом гликолиза.
Чтобы обосновать функционирование ПФК Е. histolytica в гликолизе, были предложены три возможных реакции в качестве источника ФФН: 1) катализируемая ФЕП-карбокситрансфосфорилазой, 2) приводящие к синтезу гликогена, белков и нуклеиновых кислот и 3) катализируемая ФФ,гзависимой ацетаткиназой. Сообщалось также, что у Е. histolytica нет АТФ- ФФК, а имеется только ПФК. Наблюдавшуюся ранее АТФ-ФФК вызывала активность ПФК, что объяснялось образованием ФФ„ из АТФ в ходе последовательных реакций, катализируемых ассоциированными с гликогеном ферментами:
Включение3 Р-ортофосфатав ФФ„ и Фр-1,6-Ф2 в реакции ПФК in vitro
Все эксперименты с использованием радиоактивного фосфора-32, включая синтез меченного пирофосфата и его очистку, проводили в снабженных крышками пластиковых микропробирках (Eppendorf) объемом 1,5 мл. Реакционная смесь (0,5 мл) для синтеза (32Р)ФФи содержала 20 мМ MES-NaOH (рН 7,0); от 2 мМ до 10 мМ фруктозо-1,6-бисфосфата; от 1 мМ до 16 мМ MnCh; от 0,18 мМ до 8 мМ NaH2P04 в смеси с Р-ортофосфорной кислотой (5000 мКю/мкмоль, ГНЦ "Физико-энергетический институт", Обнинск). Радиоактивность полной смеси составляла в среднем 5x10 имп/мин в 1 мл. При изучении субстратной специфичности ПФК вместо фруктозо-1,6-бисфосфата в смесь вносили глюкозо- 1,6-бисфосфат или рибулозо-1,5-бисфосфат (1 мМ). Реакцию начинали очищенной ПФК М. methanica 12 (0,2 Е). Синтез проводили в течение 30 мин при 18С.
Образующийся после внесения в инкубационную смесь ПФК осадок отделяли центрифугированием (5 мин, 5000 g). В опытах по определению условий максимального включения 32Р-ортофосфата в синтезируемый пирофосфат готовили инкубационные смеси с различными концентрациями Na PO (с постоянной удельной радиоактивностью), МпСЬ и фруктозо-1,6Ф2. Отбирали по 20 мкл каждой смеси до внесения ПФК и высушивали па фильтрах из стекловолокнистой бумаги (Whatman GF/F), которые помещали во флаконы со сцинтилляциошюй жидкостью и измеряли исходную радиоактивность. После инкубации в течение 30 мин и центрифугирования, определяли радиоактивность супернатанта. Количество образовавшегося (32Р)ФФн определяли по разности между радиоактивностью инкубационной смеси и супернатантом после отделения осадка. Неспецифическую преципитацию Фн определяли в отдельных опытах (контролях) при всех использовавшихся концентрациях, исключив из инкубационной смеси фермент. Если в контроле имелась "неспецифическая" преципитация, ее величину вычитали из радиоактивности пирофосфата, полученную в опыте с реакционной смесью данного состава. Кроме того, исследовалось распределения 32Р среди продуктов реакции ПФК методом ТСХ, как описано ниже.
Распределение метки среди продуктов реакции ПФК анализировали ионообменной ТСХ на пластинах бхб см с ПЭИ-целлюлозой "Schleicher & Schull" (Германия), В качестве растворителя использовали 0,8 М LiCl в 1 М НСООН. Положение радиоактивных соединений определяли методом авторадиографии. Их идентифицировали по положению на хроматограммах соответствующих эфиров фосфорной кислоты, которые проявляли, опрыскивая хроматограмму, смесью 30% хлорная кислота + 1 N НС1 + 4% молибдат аммония + Н2О (10:10:25:55). Участки хроматограмм, соответствующие пятнам па радиоавтографе, вырезали и помещали во флаконы с 5 мл сцинтилляциошюй жидкости (4 г ППО, 50 мг ПОПОП на 1 л толуола). Радиоактивность проб измеряли па жидкостном сциитилляциоппом спектрометре «Intertechnique SL-30» (Франция).
Время окончания реакции в оптимизированной инкубационной смеси определяли по кинетике образования радиоактивных продуктов. Для этого после внесения ПФК из инкубационной смеси периодически отбирали аликвоты по 2 мкл и немедленно наносили па пластины 6x6 см с ПЭИ-целлюлозой, хроматографировали и определяли распределение радиоактивной метки среди продуктов реакции.
Очистка синтезированного 32ФФ„. Полученный в оптимизированной нами инкубационной смеси осадок дважды ресуспендировали в 100 мкл деионизовашюй воды, центрифугировали (5 мин, 5000 g) и суперпатант отбрасывали. Затем осадок растворяли в 100 мкл 0,1 н НС1 и так же центрифугировали. Суперпатант переносили в чистую микропробирку и нейтрализовали 15 мкл 1 М NaHCCb. Вновь образовавшийся осадок отделяли и промывали 100 мкл воды центрифугированием при указанных выше условиях. Промытый осадок ресуспендировали в 100 мкл 10 мМ натрий-бикарбонатного буфера рН 9,5 и наносили на уравновешенную тем же буфером колонку (0,9 х 15) с Амберлитом CG-50II(Serva) BNa-форме. Элюцига проводили тем же буфером при скорости 0,15 мл/мин. Из собранных фракций (0,3 мл) отбирали аликвоты по 5 мкл для определения радиоактивности. Фракции, содержавшие 32ФФН, объединяли.
Для оценки биологической активности синтезированного 32ФФ() определяли скорость и полноту его гидролиза неорганической пирофосфатазой из пекарских дрожжей Saccharomyces cerevisiae (Sigma, США). Инкубационная смесь (0,5 мл) включала: 50 мМ трис-HCl (рН 8,0), 1 мМ MgCb, 0,ЗмМ синтезированного 32ФФ„, переведенного в Na-форму. Реакцию начинали внесением препарата пирофосфатазы (20 мЕ), Смесь инкубировали на водяной бане при 30С и отбирали пробы по 0,1 мл. Пробы немедленно вносили в микропробирки, содержащие 0,6 мл реактива для определения Фн и 0,1 мл НгО, реакция при этом останавливалась. Контрольная инкубационная смесь имела тот же состав, но содержала коммерческий Na4P207, Для определения полноты гидролиза 32ФФМ, из инкубационной смеси отбирали аликвоты по 5 мкл и хроматографировали, как указано выше. Кроме того, сопоставляли концентрацию ФФН, рассчитанную по данным гидролиза в 1 N HCI, с количеством Фн, образовавшимся при его гидролизе пирофосфатазой,
Для выделения ДНК, клетки М. methanica 12 в экспоненциальной фазе роста осаждали центрифугированием при 4500 об/мин 15 мин, дважды отмывали ТЕ-буфером (10 мМ трис - НС1 и 1 мМ ЭДТА, рН 8,0), содержащим 1% NaCl и рссуспендировали в этом буфере. ДНК из клеток экстрагировали и очищали модифицированным методом [Marmur, 1961], Выделенную хромосомную ДНК, свободную от белков и РНК, растворяли в ТЕ-буфере и хранили при -20С.
Расщепление ДНК М. methanica 12 эндонуклеазами. Гидролиз ДНК различными эндонуклеазами проводили, используя для каждой эндонуклеазы рекомендованный буфер и соответствующий температурный режим, согласно инструкциям фирм "СибЭнзим" (Россия) и "Fermentas" (Литва). Для рестрикции ДНК М. methanica 12 использовали рестриктазы EcoRI с сайтом рестрикции GJAATTC, НраїІ с сайтом рестрикции CJCGG, Ndel с сайтом рестрикции CAJ.TATG и Hind Ш с сайтом рестрикции AJ.AGCTT. Рестрикцию ДНК проводили в 20 мкл раствора, содержащего 14 мкл деиоиизоваииой воды, 100 мкг исследуемой ДНК, 10х буфер для рестриктазы и 10 единиц рестриктазы. Выдерживали 60 мин, при 37С, затем инактивировали рсстриктазу при +65С в течение 10 мин. Фрагментированную ДНК осаждали добавлением 2,5 объема охлажденного до -20С 96% этанола и 0,1 объёма 3 М ацетата К, перемешивали и выдерживали 20 мин. при -20С. Центрифугировали, осадок промывали последовательно 70%, 80%, 96% этанолом и подсушивали на воздухе. Далее ДНК ресуспендировали в 50 мкл ТЕ-буфера и хранили при -20С.
Влияние условий культивирования М. methanica на активность ПФК и ФФ,газы
Исследования фосфорного метаболизма M.methanica 12 показали, что данный организм при росте на метане имеет высокую активность ПФК и аккумулирует значительные количества ФФН, независимо от условий культивирования и присутствия в клетках активностей ФФн-азы и ЩФ. Учитывая, что облигатпые метанотрофы имеют развитую систему ВЦМ, участвующих в энергетическом и окислительном С]-метаболизме [Четииа, Троценко, 1981; Четипа и др., 1988], представлялось логичным исследовать распределение основных ферментов метаболизма ФФИ в растворимой и нерастворимой (мембранах) фракциях при дефиците Ф„ в среде. До сих пор подобные исследования для облигатных метанотрофов не проводились.
Предварительные эксперименты по определению локализации ФФ„-азы М methanica 12 ограничивались двумя фракциями - растворимой и мембранной, получаемых при разрушении клеток ультразвуком или экструзией из замороженного состояния. Оказалось, что активность ФФн-азы находилась преимущественно в растворимой фракции (40-70 мЕ/мг белка), тогда как в мембранах - в следовых количествах (0,1 мЕ/мг белка), независимо от способа разрушения клеток. Разрушение клеток в присутствии иеиоиных детергентов (Тритон Х-100 или Твин 80) до 2% или их добавление в буфер к уже полученным мембранам (для солюбилизации пирофосфатазы, если этот белок интегрирован в мембраны), не влияло па активность ФФн-азы в мембранной фракции.
Поскольку наиболее мягким способом, позволяющим получать наименее поврежденные нативные мембраны, считается лизис осмотически чувствительных форм бактерий [Kaback, 1971], мы получали сферопласты с использованием лизоцима в присутствии 1 мМ ЭДТА по методу Mizushima et al. (І966) с последующим субклеточным фракционированием. Ранее этот метод успешно применялся для изучения метаболической роли ВЦМ и внутриклеточной локализации ферментов окисления метана у М.methanica 12 [Четииа, Троценко, 1981]. Однако известно, что для солюбилизации периферических мембранных белков достаточно 0,1-1 мМ ЭДТА, так как они могут фиксироваться на поверхности мембран за счет двухвалентных катионов [Findlay, Evans, 1987]. Кроме того, ЭДТА может ингибировать и/или ускорять денатурацию металл-зависимых ферментов, которыми являются, в частности, ПФК, ЩФ и ФФн-аза. Учитывая это, мы также получали сферопласты в отсутствии ЭДТА, но с увеличенной концентрацией Mg + (10 мМ) и лизоцима (0,5 мг/мл). Основываясь па результатах [Четина, Троценко, 1981] и данных электронно-микроскопической цитохимии [Четина и др., 1988], активности НАДП-дегидрогеназы и НАД+-зависимой формиатдегидрогеназы использовали в качестве критериев чистоты получаемых мембранной и цитоплазматической фракций, соответственно. Эксперименты проводили на клетках М. methanica 12, выращенных на среде "П" и среде без фосфатов в течение 24 ч. Результаты экспериментов приведены в табл. 8 и 9.
При анализе сферопластов, полученных в присутствии 1 мМ ЭДТА, основная активность ФФ„-азы (97%) и вся ЩФ (100%) находились в растворимой (цитоплазматической) фракции клеток М. methanica 12. Только 2,6% ФФа-азы от общего содержания в клетках, с удельной активностью 2,4 мЕ/мг белка, была ассоциирована с фракцией суммарных мембран и 0,3% - в периплазме. Активность ПФК в периплазме и мембранах не превышала 2% в каждой из фракций, что можно считать следствием неполного отделения этих фракций от цитоплазмы. Максимальная удельная активность (1,6 Е/мг белка) и общее количество ПФК были обнаружены в цитоплазме. Активность НАД+- зависимой формиатдегидрогеназы (980 мЕ/мг белка) была также сосредоточена в цитоплазме, но отсутствовала в мембранной фракции, что согласуется с результатами Четиной и Троценко (1981). Незначительная активность этого фермента (0,3%), присутствовавшая в периплазме, очевидно, являлась следствием примеси цитоплазматической фракции. Активностью НАДН-дегидрогеназы в равном процентном отношении и одинаковой удельной активностью ( 1000 мЕ/мг белка) обладали цитоплазма и мембранная фракция, тогда как периплазма - следовыми количествами (0,8%). Увеличение продолжительности центрифугирования лизированных сферопластов при 150000 g до 120 мин для отделения мембран от цитоплазмы не влияло на распределение этой активности, из чего можно заключить, что полученные результаты не являются следствием неполного отделения мембран от цитоплазмы. В цитированной работе [Четина, Троценко, 1981] данные по активности НАДН-дегидрогеназы в цитоплазме при субклеточном фракционировании М. methanica 12 не приводились. Однако НАДН-дегидрогеназа использовалась как один из маркеров нативности мембран при оптимизации условий их получения и фракционирования [Четина, Троценко, 1982]. Установленные удельные активности этого фермента в мембранах от 654 до 2624 мЕ/мг белка (в зависимости от типа мембран) согласуются с нашими результатами для суммарных мембран (600 - 1000 мЕ/мг белка). Вместе с тем показаны значительные колебания данной активности в мембранах при разных способах разрушения клеток и фракционирования. Так, при разделении мембран в присутствии 5% NaCI, активность НАДН-дегидрогеназы, ассоциированная с мембранами, снижалась до 66-170 мЕ/мг белка. К сожалению, причины этого явления не обсуждаются и не приводятся данные об активности НАДН-дегидрогеназы в растворимой фракции клеток, так как основной задачей работы было получение максимально активных мембран с целью выяснения их функций в энергетическом метаболизме М methanica 12. Но было показано, что активность метанолдегидрогеназы и формальдегиддегидрогеназы у Ы. methanica 12 и Methyhcystis echinoids присутствуют как в растворимых (периплазма, цитоплазма), так и мембранных фракциях. Аналогично, активностью ферментов окисления метанола и формиата обладали растворимая и мембранная фракции Methylococcus capsulalus [Wadzinski, Ribbons, 1975]. Напротив, при субклеточном фракционировании Methyhsinus irichosporium, ключевые ферменты метилотрофного метаболизма (за исключением АТФ-азы и НАДН-цитохром-с-редуктазы) находились исключительно в растворимой фракции [Weaver, Dugan, 1975]. Предположение, что данные белки находятся на поверхности мембран, и, вследствие непрочной связи способны легко солюбилшироваться [Истина, Троценко, 1981], было подтверждено методом электронно-микроскопической цитохимии клеток М. meihanica 12 [Четинаидр.,1988].
