Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. Обзор литературы 7
I. Митохондриальные системы гидроксилирования . 7
2. Свойства адренодоксина 9
3. Свойства флавопротеинов 11
4. Свойства адренодоксин-редуктазы 17
.5. Взаимодействие адренодоксин-редуктазы с субстратами 21
6. Реконструкция митохондриальной системы гидрок силирования 27
ГЛАВА II..Методическая часть 34
I. Реактивы 34
2. Приборы 35
3. Методы исследования 36
4. Выделение и очистка белковых препаратов 43
4.1. Получение митохондрий из коры надпочечников . 43
4.2. Очистка адренодоксина 44
4.3. Очистка цитохрома с 45
4.4. Приготовление адренодоксин-сефарозы 49
4.5. Очистка адренодоксин-редуктазы 50
4.6. Выход белковых препаратов 52
4.7. Получение апоформы адренодоксин-редуктазы 52
4.8. Получение апоформы адренодоксина 54
ГЛАВА III. Экспериментальные результаты 56
1. Реконструкция гидроксилирущей цепи 56
2. Свойства адренодоксина и его взаимодействие с детергентами 68
3. Физико-химические свойства адренодоксин-редуктазы 77
4. Определение триптофановых остатков адренодоксин-редуктазы 84
5. Исследование структуры адренодоксин-редуктазы методом селективного тушения флуоресценции . 86
6. Влияние НАДФН на триптофановуго флуоресценцию адренодоксин-редуктазы 96
7. Взаимодействие адренодоксин-редуктазы с адренодоксином 103
ГЛАВА. ІV. Обсуждение результатов 105
выводы 122
описок литературы 124
- Взаимодействие адренодоксин-редуктазы с субстратами
- Реконструкция митохондриальной системы гидрок силирования
- Свойства адренодоксина и его взаимодействие с детергентами
- Исследование структуры адренодоксин-редуктазы методом селективного тушения флуоресценции
Введение к работе
Флавинсодержащие ферменты принадлежат к наиболее распространенным в природе оксидоредуктазам. Они способны катализировать как терминальные, так и нетерминальные окислительно-восстановительные процессы, являясь компонентами электронтранспортных цепей.
НАДФН-адренодоксин редуктаза (E.C.I.6.7.I.), катализирующая восстановление одноэлектронного переносчика (адренодоксина) двух-электронным субстратом (НАДФН), является флавиновым ферментом. Она локализована во внутренней мембране митохондрий ряда органов (печень, почки, надпочечники, семенники, яичники), в которых осуществляются реакции гидроксилирования стероидных соединений.
Изучение механизма функционирования адренодоксин-редуктазы в гидроксилирущей цепи стало актуальным, поскольку адренодоксин-редуктаза катализирует скорость-лимитирующую реакцию электронного переноса в гидроксилирующей цепи. В связи с этим, перед нами была поставлена задача изучения свойств адренодоксин-редуктазы из митохондрий коры надпочечников с целью реконструкции цепи и получения более подробных данных о механизме электронного транспорта между адренодоксин-редуктазой и ее субстратами.
Для решения этой задачи необходимо было располагать высоко-очищенными препаратами всех компонентов митохондриальной системы гидроксилирования, в том числе, кроме адренодоксин-редуктазы, адренодоксином и цитохромом Р-450, который является терминальным акцептором электронов данной системы.
С использованием аффинной хроматографии были получены высо-коочищенные препараты всех компонентов электрон-транспортной цепи. Подробно изучены физико-химические свойства адренодоксин-ре - 6 дуктазы, и в особенности ее оптические магнитные и люминесцентные свойства.
Для изучения роли флавиновой простетической группы и триптофановых остатков в процессе переноса электронов, мы использовали люминесцентные методы исследования этого фермента в сочетании с химической модификацией его триптофановых групп. В ходе проведенных исследований было показано комплексообразование между компонентами цепи и обнаружено, что скорость электронного транспорта в реконструированной системе лимитируется процессами комплексообразования между компонентами. Выявлены кинетические различия при использовании в качестве терминальных акцепторов цитохромов с, и Р-450, изучено влияние среды на скорость электронного транспорта в реконструированной системе митохондриаль-ного гидроксилирования и определена локализация субстрат-связы-вающих участков на адренодоксин-редуктазе.
Взаимодействие адренодоксин-редуктазы с субстратами
Например, в случае старого желтого фермента, только ФМН, а не рибофлавин и ФАД, был способен восстанавливать ферментативную активность. Иначе говоря, для реконструкции требуется только та группа, которая содержится в нативном ферменте.
Среди реакций, катализируемых флавопротеинами: одноэлёк-тронный перенос, реакции с S -содержащими соединениями, гид-роксилирование, окислительное декарбоксилирование и восстановление 02 в перекись водорода и воду. Наиболее характерной особенностью флавопротеинов является их спектр поглощения с пиками на 260 нм, 370 нм и 450 нм. При восстановлении интенсивность двух последних полос падает до 10$ от поглощения окисленной формы.
Флавины способны восстанавливаться как полностью, присоединяя два электрона, так и наполовину, присоединив один электрон. В последнем случае образуется лолувосстановленная, семихи-нонная форма. Таким образом, флавопротеин, содержащий одну молекулу кофермента, способен участвовать в каталитическом процессе, переходя из полностью окисленного в восстановленное состояние, из полностью окисленного в семихинонное, затем из семихи-нона в полностью восстановленное состояние.
В настоящее время известно около 100 флавопротеинов. Исследовалась их видовая специфичность, так как флавопротеины заметно отличаются друг от друга реакционоспособностью флавиновых групп по отношению к различным акцепторам. Эти отличия, по-видимому, обусловлены белковой частью, так как свободные флавины очень легко реагируют со многими акцепторами. Учитывая все многообразие флавопротеинов, Хеммерих и Мэсси ЗО) провели их классификацию, разделив эти белки на 5 классов, согласно типу проводимой ими реакции. Класс I. - Злектрон-трансферазы. В этот класс ферментов входят флаводоксины, участвующие в одноэлектронном переносе. Ферменты этого класса проводят свой каталитический цикл между полностью восстановленным и семихинонннм состоянием. Класс 2. - Трансгидрогеназы. В этот класс входят белки, переносящие 2 электрона отС-С,05, C-JVT, N-N связей. Класс 3. - Дегидрогеназы/оксидазы. Этот класс ферментов де-гидрогенизирует субстрат с одновременным образованием HgC . Класс 4. - Дегидрогеназы/оксигеназы. Этот класс ферментов отличается от предыдущего тем, что пероксид не высвобождается, а переходит в воду. При этом четыре окислительных эквивалента 02 используются следующим образом: два идут на образование воды, а два включаются в другой субстрат энзима. Класс 5. - Дегидрогеназы/электрон-трансферазы. Этот класс ферментов переводит двухэлектронный поток в одноэлектронннй. Все известные в настоящее время редокс цепи содержат представителей этого класса флавопротеинов, функционирующих между восстановленным пиридин нуклеотидом или железо-серным белком. Известно, что в переносе электронов образуется семихинонная форма фяавопротеи-на. Электрон-трансферазы осуществляют простейшую реакцию катализируемую флавопротеинами, одноэлектронннй перенос, в котором принимают участие лишь два редокс состояния флавопротеинов, полностью восстановленное и семихинон. Эта реакция характерна для флаводоксинов из бактерий, принимающих I электрон от низкопотенциального центра и отдающих его на акцептор с более высоким потенциалом (31). Хотя флаводоксины у млекопитающих не обнаружены, - 15 -однако НАДФН-цитохром с, редуктаза проявляет себя типичной элек-трон-трансферазой, содержащей только флавиновый кофактор (32, 33,34). Наиболее характерной и распространенной функцией флавопро-теинов является дегидрогенизация. В зависимости от донора электронов, все известные в настоящее время дегидрогеназы подразделяются на пиридин зависимые и пиридин независимые флавопротеи-ны. Многие из ферментов являются комплексными, т.е. в их состав, помимо одной флавиновой грушш, входят дополнительные редокс активные группы, такие как гем, железо-серный центр или дополнительная флавиновая группа. Флавиновые дегидрогеназы катализируют электронный перенос, проходящий с окислением НАД(Ф)Н с образованием НАД(Ф)+ и переносом гидрида (2 электрона + I протон). Косвенные доказательства о переносе гидрида от восстановленного пиридин нуклеотида были получены в модельных реакциях (35,36). Наблюдается также и прямой перенос электрона в положение 5 изоаллоксазинового кольца у флавинового аналога, 5-деазафлавина. В частности, прямой перенос наблюдался у 7 флавопротеинов, ФАД или ФШ,группы которых были заменены на 5-деазапроизводные (37,38). Результаты исследований показали, что флавиновая группа может быть связана с белковой в такой конфигурации, что возможен прямой перенос 1 от V пиридин нуклеотида на молекулу флавопротеина. При переносе с пиридин нуклеотида на флавопротеин, авторы наблюдали промежуточное соединение, обладающее длинноволновым поглощением. Это поглощение наблюдалось как в белках, так и в модельных соединениях (39, 40). Химическая природа таких соединений определялась как "комплекс с переносом заряда" или бирадикальный комплекс, в котором электроны смещены от пиридин нуклеотида к флавиновой группе. Особое место среди дегидрогеназ занимает класс дегидроге-наз/электрон-трансфераз. К этому классу ферментов относятся те флавопротеины, которые трансформируют двухэлекгронный поток в одноэлектронный. В простейшем случае такой переход может быть представлен на примере восстановления цитохрома &5 микросо-мальным флавопротеином, цитохром о5 -редуктазой, которая после полного восстановления субстратом, НАДН, переносит электроны по одному на цитохром о5 (36).
В большинстве, флавиновые группы этого класса содержат дополнительные редокс группы (41,42,43). Механизм переноса электронов этими ферментами исследовались у флавин-флавиновых, фла-вин-гемовых и флавин-железо-серных флавопротешов (44,45), однако в настоящее время нет однозначных данных о механизме этого переноса.
Наиболее пристальное внимание исследователей занимает изучение механизма взаимодействия флавиновой и железо-серной групп. Показано, что они часто встречаются в одной и той же белковой молекуле, или в тесно ассоциированных ферментных комплексах. Однако изучение их взаимодействия затрудняется присутствием в белке других окислительно-восстановительных групп. В частности, НАДФ-сульфит редуктаза, помимо 4 ФАД и 14-16 Fe -S групп, содержит 4 группы ФМН и 4 атома Fe (46), ксантин-оксидаза содержит не только 2 ФАД и 2 неидентичных Fe -S центра, но и 2 атома Г10 (47).
Реконструкция митохондриальной системы гидрок силирования
Этот белок, как известно, является одноэлектронннм переносчиком в митохондриальной окислительной цепи, переносящей электроны непосредственно на теминальную оксидазу, цитохром о, оксидазу (92,93). Цитохром с, гемопротеин с молекулярной массой 13000 Да легко выделяется из митохондрий различных органов, в том числе и из надпочечников (94). За его восстановлением следили по увеличению d. -полосы при 550 нм.
Прослеживая восстановление цитохрома с в системе , состоящей из донора, НАДФН и переносчиков, адренодоксин-редукта-зы и адренодоксина, Чу и Кимура показали, что максимальная скорость восстановления акцептора достигается при соотношении переносчиков 1:1 (55). Авторы обнаружили, что после достижения этого соотношения, дальнейшее добавление адренодоксина не приводит к изменению скорости восстановления цитохрома с. Исходя из полученных результатов, автор! предложили линейный механизм переноса электронов с НАдан на цитохром с. через адренодоксин-редукта-зу и адренодоксин.
В то же время, Ламбет и сотр. (85) показали, что скорость переноса электронов в реконструированной системе зависит как от соотношения, так и от концентрации компонентов, НАДЩ, комплекса адренодоксин-редуктазы с адренодоксином и цитохрома с. Исследование влияния различных соотношений этих ингредиентов на скорость восстановления цитохрома с показало, что максимальная скорость наблюдается при соотношении восстановителя, НАДЩ, комплекса и цитохрома р., равном 2:1:4 (85,95).
Авторы показали, что комплекс, получая два электрона от донора, ндан, отдает их последовательно на цитохром с с различной скоростью, первый быстро, с константой скорости, /ц=4,6 сек""1, а второй медленно, с константой скорости, =0,II сек"1. По мнению авторов, при соотношении, равном 2:1:4, происходит по-видимому следующее; после того, как первая молекула НАДІН отдала 2 электрона на комплекс, один из электронов быстро восстанавливает одну молекулу цитохрома с еще до того, как комплекс успевает перенести второй электрон на вторую молекулу цитохрома с. Затем к комплексу подходит вторая молекула НАДШ, переносит на комплекс еще два электрона, переводя его в "сверхвосстановлен-ное", трехэлектронсодержащее состояние. С этого комплекса 2 электрона быстро восстанавливают еще две молекулы цитохрома с и медленно, третью молекулу.
Таким образом, комплекс способен восстановить 4 молекулы цитохрома с, из которых 3 восстанавливаются быстро, а четвертая - медленно. Эти результаты были получены кинетическими исследованиями методом остановленной струи; 75$ цитохрома с в реакционной среде восстанавливалось быстро, а 25$ медленно (85).
Авторы предполагают следующую схему восстановления цитохрома с комплексом адренодоксин-редуктаза:адренодоксин. Герен и Милле (96), исследовавшие восстановление цитохрома с методом флуоресценции, показали, что адренодоксин способен при сдабой ионной силе образовать комплекс с цитохромом с в соотношении 1:1. Этот комплекс, аналогично комплексу адренодоксин-редуктаза-адренодоксин при увеличении ионной силы диссоциирует на компоненты. Авторы также показали, что при комплексообразова-нии адренодоксина с цитохромом с происходит перенос энергии с адренодоксина на цитохром с с эффективностью 69$. Модификация лизиновых остатков окружающих гем цитохрома с, приводила к диссоциации комплекса, что свидетельствует о том, что место связывания этих белков лежит в области гема цитохрома с. Ими также рассчитано расстояние между остатком тирозина-82 адренодоксина и о гемом цитохрома с, равное 17-34 А. Авторы предполагают, что восстановление цитохрома с адренодоксином происходит по линейному механизму (96,97). В опытах по восстановлению цитохрома Р-450 Сейберту и сотр. (98) удалось показать, что механизм восстановления этого акцептора отличается от восстановления цитохрома с. В частности, оказалось, что соотношение адренодоксин-редуктаза:адренодоксин, равное 1:1 явно недостаточно для достижения максимальной скорости реакции. Титрование реакционной среды избыточным количеством адренодоксина показало, что скорость восстановления цитохрома Р-450 растет с увеличением концентрации адренодоксина, достигая максимума при соотношении адренодоксин-редуктаза:адренодоксин, равное 1:2 и не меняется при дальнейшем увеличении содержания адренодоксина. Исходя из полученных результатов авторы предположили, что восстановление цитохрома Р-450 несет не линейный характер, как в случае с восстановлением цитохрома с, а адренодоксин функционирует наподобие электрон-переносящего челнока, получая электроны от адренодоксин-редуктазы, отходит от нее и присоединяется к молекуле окисленного цитохрома Р-450. На место этой молекулы адренодоксина встает другая молекула адренодоксина, окисленная. Авторы предложили следующую схему восстановления цитохрома Р-450.
Свойства адренодоксина и его взаимодействие с детергентами
Сефарозу помещали на бюхнеровскую воронку, отсасывали воду, затем суспендировали в равном объеме дистиллированной воды, переносили в стакан и добавляли ВгСМ в расчете 500 мг Br CN на I г замоченной сефарозы. Раствор подщелачивали добавлением 2 М ДОаОНи Р5 реда в процессе реакции поддерживали при 11,0 тем же раствором щелочи. Температуру поддерживали при 20С добавлением льда. Процесс активации сефарозы продолжался в течение 10-15 мин при непрерывном помешивании. Затем суспензию переносили на бюхнеровскую воронку и максимально быстро, за 10-15 сек, промывали ОД М (рН 8,0) переносили в стакан (200 мл) и при непрерывном помешивании добавляли раствор адренодоксина в I мМ фосфатном буфере, рй 7,4, в расчете 50 мг белка на 30 г сефарозы. Суспензию bvEN-сефарозы в растворе J\TaHtOj(jH 8,0), содержащей адренодоксин помещали на магнитную мешалку и помешивали в течение 30 мин в темноте. Связывание адренодоксина на се-фарозе можно было наблюдать по обесцвечиванию раствора и окрашиванию сефарозы в коричневый цвет. Процесс контролировали спектрально, прослеживая за уменьшением поглощения на 415 нм в аликвотах раствора. По завершении процесса связывания, адренодоксин-сефарозу промывали на бюхнеровской воронке раствором 1\ГаНС03 , суспендировали вОДМ МаИСОз, содержащем І М глицина, оставляли на магнитной мешалке на 4 часа в темноте при комнатной температуре для блокирования оставшихся активных групп. При необходимости адренодоксин-сефарозу хранили в этом же растворе при температуре +4С. При этих условиях адренодоксин-сефароза может храниться,по крайней мере, в течение месяца без существенного изменения свойств. Перед употреблением адренодоксин-сефарозу уравновешивали 0,01 М К+-фосфатным буфером, рН 7,4, содержащим 0,07 М КСХ.
Митохондрии коры надпочечников, полученные из 500 г ткани суспендировали в 0,5 литрах 0,01 М буфера, содержащего 0,05 М КС Ей 10 мкМ ЭДТА. Суспензию подвергали озвучиванию порциями по 100 мл на льду в течение 30 сек. Суспензию центрифугировали при 55000 й , 60 минут, осадок удаляли, а надосадочную жидкость желто-коричневого цвета пропускали через колонку с ДЭАЭ-целлю-лозой (2 3 см), уравновешенную 0,05 М буфером. На этой колонке адсорбируется адренодоксин, который не был экстрагирован из ми-тотохондрий при первичной обработке коры надпочечников. Он присоединялся к адренодоксину, очистка которого описана на стр.44-45.
Раствор прошедший через эту колонку фракционировали сульфатом аммония, собирали фракцию между насыщениями 20$ и 70%. При добавлении ( NЩ) 50 , рН поддерживали при 7,4 с помощью 2 М ГНцОН . Осадок растворяли в минимальном количестве 0,01 М буфера (около 20 мл) и диализовали против 100-кратного избытка 2,5 мМ буфера, содержащего 10 мкМ ЭДГА, в течение суток при трехкратной смене диализного буфера и интенсивном помешивании на магнитной мешалке. После завершения диализа раствор центрифугировали при 16000g в течение 20 минут для удаления мути, и прозрачный раствор пропускали через колонку с ДЭАЭ-целлюлозой (1 25 см), уравновешенной 2,5 мМ буфером.
Колонку промывали линейным градиентом буфера от 2,5 мМ до 0,01 М, затем фермент элюировали с колонки 0,05 М буфером. Полученный бледно-желтый раствор концентрировали примерно в 10 раз при помощи ПЭГ 40000, и сконцентрированный раствор, порциями по 4 мл, наносили на колонку с сефадексом G -100 (сверхтонкий, 2 80 см), уравновешенную 0,01 М буфером, содержащим ОД М КСt. На этой стадии на элюционной диаграмме получали три пика, НАДФН-цитохром с редуктазная активность (адренодоксин-редуктаза) обнаружена в среднем пике. Оптический индекс чистоты препарата фермента, полученный на этой стадии, А278А450=-1-2,
Для окончательной очистки белка применяли хроматографию на адренодоксин-сефарозе. Фракцию белка с НАДЩ-цитохром с редук-тазной активностью после предыдущей гель-фильтрации наносили на колонку с адренодоксин-сефарозой 4В (1-7 см), уравновешенную буфером, содержащим 0,07 М КС . Адренодоксин-редуктаза связывалась на колонке с иммобилизованным адренодоксином и после промывания уравновешивающим буфером (100 мл), белок элюировали 0,4 М раствором того же буфера.
Полученный препарат адренодоксин-редуктазы электрофорети-чески гомогенен, имеет оптический индекс чистоты, &278 45(Г& Q (см. рис.17), что превышает по чистоте лучшие препараты, описанные в литературе (56,57).
Активность адренодоксин-редуктазы, выраженная числом оборо - 52 -тов фермента в минутах в реакции восстановления цитохрома с, составляла примерно 300 (при 25С ж рН 7,4). Ферментативная активность препарата сохраняется без изменений, по крайней мере, в течение I месяца при его хранении при -20С.
Исследование структуры адренодоксин-редуктазы методом селективного тушения флуоресценции
Как отмечалось в обзоре литературы, адренодоксин-редукта-за является ключевым ферментом стероидгидроксилирущей цепи в митохондриях коры надпочечников, трансформирующим двухэлектрон-ный поток от субстрата, HAJPH, в одноэлектронный поток к друто-му субстрату, адренодоксину. Как отмечалось, в последнее время опубликовано значительное количество работ, в которых исследовался механизм электронного переноса между этим ферментом и его субстратами (45,84,85,91,95). Однако, несмотря на интенсивные исследования этой системы, механизм трансформации двухэлектрон-ного,потока в одноэлектронный остается неясным. Неясно также, какие конкретные аминокислотные остатки фермента вовлекаются в механизм электронного транспорта, какие аминокислотные остатки адренодоксина участвуют во взаимодействии с адренодоксин-редуктазой, хотя, как указывалось, определенное значение придавалось единственному тирозиновому остатку адренодоксина (87). Однако, кроме тирозинового остатка в механизм электронного транспорта по-видимому вовлекаются также некоторые основные аминокислотные остатки (аргинин, гистидин). Тем не менее, существующая картина еще далеко не является однозначной, поскольку даже в тех случаях, когда определены вовлекающиеся в процесс аминокислотные остатки, не оценены расстояния между ними и простетическими группами, подвергающимися редокс превращениям.
В первом приближении очевидно, что непосредственное взаимодействие НАДФН с флавиновой группой адренодоксин-редуктазы и, соответственно, с железо-серным центром адренодоксина не происходит, поскольку как флавиновая группа, так и железо-серная группа расположены внутри белковых глобул. Иначе говоря, электронный перенос от ІВДШ через ФАД группу адренодоксин-ре-дуктазы к железо-серному центру адренодоксина должен происходить с участием определенных аминокислотных остатков как фермента, так и адренодоксина.
В результате проведенной нами работы было выявлено, что НАДШ присоединяется к такому участку фермента, который нахо о дится на расстоянии 39-40 А от среднего расстояния между содержавшимися в ферменте 10 триптофанами. Ковалентная модификация некоторых триптофановых остатков фермента лишь приводила к увеличению этого расстояния. Поскольку величина расстояния от HAjQ H-связывающего центра до трипто-фанов является лишь средней величиной (для 10 триптофановых остатков), можно предположить, что в нативном белке, по крайней мере, некоторые из этих остатков расположены даже ближе, чем о 39-40 А. С другой стороны, поскольку нам не удалось наблюдать перенос энергии между триптофанами и флавиновой группой адренодок син-редуктазы можно считать, что расстояние между ближайшими о триптофанами и флавиновой группой должно быть не менее 50-60 А. Следовательно, можно заключить, что процесс электронного переноса от триптофановой группы, находящейся ближе всего к НАДШ-связывающему участку до флавиновой группы происходит с вовлечением, по крайней мере, еще одного аминокислотного остатка на молекулу фермента.
Идентификацию этой- группы мы надеялись провести исследуя влияние рН и ионной силы на скорость электронного транспорта в реконструированной системе. При этом оказалось, что при исползовании в качестве тершшальных акцепторов как цитохрома с, так и цитохрома Р-450, рН-оптимум реакции их восстановления расположен при 7,2. Можно было предположить на этом основании, что в перенос электрона вовлекается аминокислотный остаток, имеющий рК около 7,2, Среди аминокислот, которые могут иметь такое значение рК, гистидин и цистеин.
Дальнейшие исследования показали (рис.6), что рй оптимум в реконструированной системе резко смещается в кислую область (по крайней мере, ниже рН 6,0), когда используется трехкратный избыток адренодоксин-редуктазы над адренодоксином. Объяснение этого факта не может быть дано на основании величины рК какой-либо аминокислоты, вовлекающейся в электронный транспорт. По-видимому речь должна идти о другом объяснении наблюдающейся величины рй оптимума. Исходя из имеющихся представлений о включении флавопротеина, адренодоксин-редуктазы, в непосредственную реакцию с кислородом можно допустить (для других флавияо-вых оксидоредуктаз это четко показано) (123), что в ходе этого взаимодействия образуются супероксидные радикалы, рЕ которых расположен при 4,3, и которые, как установлено, способны служить дополнительным восстанавливающим агентом по отношению к цитохрому с взятому в качестве терминального акцептора. К сожалению, из-за экспериментальных трудностей не было возможности провести исследования в более кислой области и точно выявить рй оптимум в условиях высокой концентрации флавопротеина в той серии опытов, где в качестве терминального акцептора брался цитохром Р-450. Стоит еще раз отметить, что наблюдающееся смещение рй оптимума при высоких концентрациях флавопротеина наблюдалось только для цитохрома Р-450, и не было отмечено для цитохрома с.
Поскольку как терминальный акцептор электронов с флавопро-теина, цитохром Р-450 примерно в 5 раз (при эквимолярном соотношении адренодоксин-редуктазы и адренодоксина) менее эффективен, чем цитохром можно считать, что это различие между поведениями обоих цитохромов отражает дополнительное взаимодействие супероксидных радикалов, образующихся при автоокислении флавина с цитохромом с. Иначе говоря, цитохром с быстрее восстанавливается поскольку в его восстановлении участвует не только восстановленный флавопротеин, но и супероксидный радикал. При соотношении адренодоксин-редуктаза - адренодоксин, равном 1:3, различия между скоростями восстановления цитохрома с и цитохрома Р-450 уже практически не обнаруживаются, а при соотношении адренодоксин-редуктаза - адренодоксин, равном 3:1, цитохром Р-450 восстанавливается быстрее, но в этом случае смещается рН оптимум реакции.
