Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 7
I. Биологические пути образования аминов 7
2. Пути катаболизма аминов 13
3. Классификация аминоксидаз 15
4. Медьсодержащие аминоксидазы из микроорганизмов 19
5. Медьсодержащие аминоксидазы в растениях 22
6. Аминоксидазы из почек 26
7. Медьсодержащие аминоксидазы из других органов животных 29
8. Медьсодержащие аминоксидазы из крови и других
жидкостей организма 34
9. Лизилоксидаза - специфическая медьсодержащая аминоксидаза 39
10. Медьсодержащие аминоксидазы из сосудистой ткани 44
ГЛАВА П. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 48
I. Использованные реактивы 48
2. Аппаратура 50
3. Биологический материал 53
4. Определение аминоксидазной активности 56
5. Определение СОД-активности 57
6. Определение белка, лилидов и углеводов и тиоловых групп 58
7. Определение металлов 59
. 8. Электрофорез, гель-фильтрация, хроматография 60
ГЛАВА Ш. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 63
I. Очистка бензиламиноксидазы из аорты 63
2. Очистка бензиламиноксидазы из капилляров мозга 68
3. Макромолекулярные свойства БАО из аорты капилляров * 71
4. Кинетические характеристики фермента и его ингибирование 76
5. Оптические и магнитные свойства БАО из сосудов 84
6. другие медьсодержащие ферменты сосудистой ткани 97
7. Аминоксидаза из плаценты 98
ГЛАВА ІУ. 0БСУ1ЩНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 106
ВЫВОДИ 122
СПИСОК ЦИТИРОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 124
Биологические пути образования аминов
Ароматические и алифатические амины обнаружены во всех без исключения тканях, клетках, во всех организмах. Основным путем образования аминов является ферментативное декарбоксилирование некоторых аминокислот. На рис.1.1 приведены конечные этапы синтеза различных моно- и полиаминов. Путресцин и метионин служат источником образования более высокомолекулярных полиаминов. Согласно общепринятой в настоящее время концепции, метионин в виде активированного при помощи АТФ соединения ( р -аденозилметионин) способен декарбоксилироваться, и продукт декарбоксилирования, взаимодействуя с путресцином, образует спермидин. Повторение этого процесса с использованием спермидина вместо путресцина приводит к образованию спермина. Реакции образования спермина и спермидина приведены на рис.1.2.
Если значение некоторых моноаминов как нейромедиаторов давно уже осознано, то роль других аминов, особенно алифатических полиаминов, стала предметом интенсивного исследования лишь в последнее десятилетие. За это время уже появился ряд обзоров и монографий (1-4), в которых рассматривается биологическое значение полиаминов. Не исключено, что некоторые полиамины могут быть источником синтеза нейромедиаторов или сами являются нейромедиаторами. Недавно было показано, что путресцин может быть использован для синтеза ГАМК (5). Однако, некоторые факты показывают, что не в этом заключается их основная рол
Использованные реактивы
В работе применяли амины фирмы v&bva, (гистамин, трипта-мин, тирамин, спермидин в виде гидрохлоридных солей) без дополнительной очистки, поскольку согласно химической характеристике фирмы они были хроматографически гомогенны. Растворы аминов готовили непосредственно перед опытом. Амины до применения хранили при 4С. Бензиламин в гидрохлоридной форме был отечественного производства марки "ч". Его очищали трех-четырех кратной перекристаллизацией из абсолютного этанола. Критерием чистоты бензил-амина является его характерный спектр, показанный на рис.2.1. Чистому препарату присуще наличие тонкой структуры в УФ-спектре, обусловленной колебательными взаимодействиями С-Н связей бензольного кольца. Кроме того, поскольку окисление бензиламина сопровождается изменением интенсивности поглощения при 250 нм, еще одним спектральным критерием чистоты препарата является отношение полос - 255 220 К0Т0Ре 51 чистого препарата равно 3,5. Тщательная очистка исходного препарата бензиламина была необходима уже потому, что продукт его окисления, как показали дальнейшие исследования, является сильным ингибитором ЕАО.
Очистка бензиламиноксидазы из аорты
Размельченную аорту, обработанную как описано в 3 предыдущей главы, гомогенизировали в 0,04 М фосфатном буфере, содержащем 0,16 М Д/о-СХ- , рН 7,8, охлажденном до 4С в весовом соотношении 1:3, используя размельчитель тканей PT-I. Гомогенизатор работал в следующем режиме: скорость 8000 об/глин, общее время гомогенизации 3 минуты, через каждые 30 сек. были даны минутные перерывы. Полученный гомогенат медленно перемешивали на холоду в течение I часа для более полной экстракции. Затем гомогенат центрифугировали при 6000хо- , 40 минут. Плавающую липидную пленку осторожно удаляли с поверхности, осадок повторно гомогенизировали в тех же условиях I мин. и гомогенат снова центрифугировали. Надосадочные растворы от обоих центрифугирований, представляющие собой красноватые растворы разбавляли в 4 раза тем же буфером. Это разбавление было необходимо для снижения концентрации белка, что позволяет в значительной степени предотвращать быструю агрегацию коллагеноподобных белков. К полученному раствору прибавляли 60 % раствор ПЭГ (молекулярная масса 2 кД) в таком соотношении, чтобы его конечная концентрация в растворе составляла бы 4 %. После добавления ПЭГ смесь инкубировали на холоду в течение 30 минут для более полного формирования осадка. Затем смесь центрифугировали при 10000хй/ , 40 минут. Осадок удаляли, а к над-осадочному раствору вновь при непрерывном перемешивании добавляли 60/6-ый раствор ПЭГа с таким расчетом, чтобы его конечная концентрация на этот раз составляла бы 27 %. Суспензию вновь инку - 64 -бировали при тех же условиях и образовавшиеся за время инкубации крупные хлопья собирали центрифугированием при IOOOOxfl в течение I часа. Содержимое пробирок тщательно освобождали от следов ПЭГ-а и образовавшийся осадок растворяли в 0,2 М буфере, подбирая количество буфера таким образом, чтобы оптическая плотность полученного раствора при 280 нм составляла бы 2,0. По 40 мл полученного раствора наносили на колонку с сефадексом СІ, -200, уравновешенную 0,04 М фосфатным буфером. Полученная на этой стадии элюционная диаграмма приведена на рис.3.1. Электрофорез фермента-тивно-активной фракции показал, что на этой стадии она еще содержит несколько белковых компонентов. Важно отметить, что активные фракции выходят во внешнем объеме этой колонки. Поэтому, хотя на первый взгляд кажется, что гель-фильтрация через сефадекс (X -200 не эффективна, однако, как видно из формы элюционной диаграммы, на этой стадии удается избавиться от сравнительно низкомолекулярных фракций, а также от следов ПЭГ-а. Поэтому эта стадия была совершенно необходима для очистки белка. Более того, как оказалось, ПЭГ, а также сравнительно низкомолекулярная фракция белка в значительной мере ингибирует БА0 активность.
