Содержание к диссертации
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 6
ВВЕДЕНИЕ 8
1 .ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 13
1.1 .Современные представления о врожденном иммунитете млекопитающих 13
1.1.1 .Системы распознавания врожденного иммунитета млекопитающих 13
1.1.2.Гуморальные и клеточные эффекторы врожденного иммунитета млекопитающих 16
1.2.Нейтрофильный гранулоцит в защитных реакциях организма 18
1.2.1 .Хемотаксис нейтрофильных гранулоцитов 18
1.2.2.Адгезия нейтрофильных гранулоцитов на поверхности объектов фагоцитоза 19
1.2.3.Эндоцитоз, формирование фаголизосомы, инактивация и киллинг фагоцитированных микробных клеток 20
1.3 .Микробоцидные факторы нейтрофильных гранулоцитов 20
1.3.1 .Кислородзависимые факторы инактивации микроорганизмов 21
1.3.2.Кислороднезависимые факторы инактивации микроорганизмов 22
1 ААнтимикробные пептиды как молекулярные факторы врожденного иммунитета
млекопитающих 24
1.4.1 .Классификация антимикробных пептидов 24
1.4.2.Общие структурные особенности антимикробных пептидов млекопитающих
и механизмы их антимикробного действия 26
1.4.3.Свойства антимикробных пептидов отличные от антимикробной активности 34
1.4.4.Гены антимикробных пептидов, их экспрессия и посттрансляционная
модификация антимикробных пептидов млекопитающих 36
1.4.5.Экспрессия антимикробных пептидов в клетках и тканях организма млекопитающих 41
1.5.Антимикробные пептиды как возможные фармакологические агенты 45
2.МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 46
2.1 .Получение лейкоцитарной массы, обогащенной нейтрофильными гранулоцитами 46
2.2.Экстрагирование катионных пептидов из лейкоцитов павиана гамадрила 46
2.3.Ультрафильтрация экстрактов 46
2.4.Выделение и очистка о-дефенсинов из экстракта лейкоцитов человека 47
2.4.Выделение и очистка а-дефенсинов из экстракта лейкоцитов кролика
2.5.Выделение и очистка тета-дефенсина RTD-1 из экстракта лейкоцитов макаки резус 47
2.6.Методы электрофоретического разделения и анализа пептидов 48
2.6.1 .Электрофорез в полиакриламидном геле в кислой буферной системе 48
2.6.2.Электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия 48
2.6.3.Препаративный электрофорез в полиакриламидном геле в кислой буферной системе 50
2.7.0бращенно-фазовая высокоэффективная жидкостная хроматография 51
2.8.Методы определения молекулярной массы пептидов 51
2.8.1.Определение молекулярной массы методом электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия 51
2.8.2.0пределение молекулярной массы методом масс-спектрометрии MALDIOF 52
2.9.0пределение аминокислотного состава пептидов 52
2.10.Определение аминокислотной последовательности в молекулах пептидов 53
2.11.Определение наличия дисульфидных связей в молекулах пептидов с помощью
окисления надмуравьиной кислотой 53
2.12.Определение количества дисульфидных связей в молекулах пептидов с помощью их восстановления и последующего алкилирования 53
2.13.Методы определения концентраций пептидов 54
2. Н.Методы определения антимикробной активности пептидов 54
2.14.1.Микроорганизмы 54
2.14.2.0пределение антимикробной активности методом наложения гелей 55
2.14.3.Определение антимикробной активности методом радиальной диффузии пептидов в агарозном геле 56
2.14.4.0пределение минимальных ингибирующих концентраций пептидов 56
2.14.5.0пределение микробоцидного действия полученных пептидов 57
2.15.Определение влияния пептидов на проницаемость наружной и цитоплазматической мембран Е. coli ML3 5р 57
2.16.Определение гемолитической активности пептидов 59
2.17.Статистическая обработка результатов 60
З.РЕЗУЛЬТАТЫ 61
3.1.Получение лейкоцитарной массы обезьян, обогащенной нейтрофильными
гранулоцитами
3.2.Выделение и очистка антимикробных пептидов из лейкоцитарной массы
павиана гамадрила 61
3.3. Определение молекулярных масс выделенных пептидов методом масс спектрометрии MALDIOF 71
ЗАОпределение наличия и количества дисульфидных связей в молекулах
выделенных пептидов 76
3.5.0пределение аминокислотного состава выделенных пептидов 77
З.б.Определение первичной структуры выделенных пептидов 79
ЗЛ.Выделение и очистка циклического 6-дефенсина RTD-1 из экстракта лейкоцитов макаки резус 80
3.8.Изучение антимикробных свойств выделенных пептидов 85
3.8.1.Определение минимальных ингибирующих концентраций выделенных пептидов 85
3.8.2.Микробоцидное действие выделенных пептидов 90
3.8.3.Изучение влияния различных условий среды на антимикробную активность выделенных пептидов 93
3.8.Изучение влияния выделенных пептидов на проницаемость наружной и внутренней мембран Е. coli ML 3 5р 97
3.9.Изучение гемолитической активности выделенных пептидов в отношении эритроцитов человека 100
4.0БСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 102
4.1.Получение лейкоцитарной массы обезьян, обогащенной нейтрофильными гранулоцитами 102
4.2.Выделение и очистка антимикробных пептидов из лейкоцитарной массы павиана гамадрила 102
4.3 .Определение первичных структур выделенных пептидов павиана гамадрила 103
4.4.Выделение и очистка циклического 0-дефенсина RTD-1 из лейкоцитов макаки резус 112
4.5.Изучение антимикробных свойств выделенных пептидов 113
4.5.1.Определение минимальных ингибирующих концентраций и микробоцидной
активности выделенных пептидов 113
4.5.2.Влияние различных условий среды на антимикробную активность выделенных пептидов 116
4.5.2.1.Изменение антимикробной активности выделенных пептидов в зависимости от содержания NaCl в среде 116
4.5.2.2.Изменение антимикробной активности вьщеленных пептидов в зависимости от рН среды 117
4.5.2.3.Изменение антимикробной активности вьщеленных пептидов при добавлении в среду сыворотки крови 118
4.6.Влияние вьщеленных пептидов на проницаемость наружной и внутренней мембран Е. coli ML 3 5р 118
4.7.Гемолитическая активность вьщеленных пептидов в отношении эритроцитов
человека 120
5.ВЫВОДЫ 122
6.СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Введение к работе
Актуальность проблемы
Использование обезьян в разнообразных медико-биологических исследованиях обусловлено их уникальным биологическим сходством с человеком по ряду генетических и физиологических параметров, что делает их подчас незаменимыми экспериментальными животными. Одним из наиболее перспективных направлений использования обезьян в биомедицинских исследованиях является инфекционная патология. На обезьянах удается воспроизвести в относительно адекватной форме большое количество инфекционных заболеваний, присущих человеку, причем значительная часть таковых не воспроизводится ни на одном другом животном. Наиболее широко используются в экспериментальной медицине низшие узконосые обезьяны макака резус (Масаса mulatto) и павиан гамадрил (Papio hamadryas), относяшиеся к семейству мартышкообразных приматов (Лапин и др., 1987). Основой изучения инфекционных заболеваний в опытах на обезьянах является создание и сравнительное исследование той или иной модели инфекции и установления сходства и различия с аналогичными заболеваниями человека. При моделировании инфекционных процессов на обезьянах необходимо учитывать, что защитные факторы низших обезьян могут отличаться от таковых человека. В этой связи несомненный интерес представляет сравнительное изучение факторов врожденного иммунитета у низших обезьян и человека, в частности, катионных антимикробных пептидов (АМП) лейкоцитов крови. Накопленные к настоящему моменту данные позволяют сделать вывод о том, что эти пептиды являются одними из ключевых молекулярных компонентов системы врожденного иммунитета млекопитающих (Кокряков, 2006; Bevins, 2003). Для понимания закономерностей их возникновения и отбора в процессе эволюции необходимо дальнейшее накопление знаний о структурных и функциональных свойствах АМП у разных видов животных. Несмотря на то, что общее число известных АМП постоянно растет и уже превысило 1000, количество изученных АМП млекопитающих относительно невелико (http://www.bbcm.univ.tries te.it/). Подавляющее большинство охарактеризованных пептидов у животных этого класса образуют два семейства: дефенсины (Lehrer et al., 1993) и кателицидины (Zanetti et al., 1995; Lehrer, Ganz, 2002). Среди высших приматов из лейкоцитарных АМП наиболее полно изучены а-дефенсины лейкоцитов крови человека (Schneider et al., 2005). Среди низших узконосых обезьян а-дефенсины из лейкоцитов крови были выделены, очищены и охарактеризованы по структурным и антимикробным свойствам только у макаки резус (Tang et al., 1999b). Поиск лейкоцитарных АМП у макаки резус привел, кроме того, к открытию нового подсемейства дефенсинов: 9-дефенсинов, которые по структурным и функциональным свойствам существенно отличаются от других АМП млекопитающих (Tang et al., 1999а; Leonova et al., 2001). Во-первых, 0-дефенсины являются макроциклическими пептидами, циклическая структура которых формируется пептидными, а не дисульфидными связями, как у d- и р-дефенсинов. Ранее пептиды с такой макроциклической структурой были описаны только у бактерий (Salomon, Farias, 1992; Martinez-Bueno et al., 1994) и высших растений (Derua et al., 1996). Во-вторых, мРНК для пептидной цепи 9-дефенсина RTD-1 (rhesus theta defensin) макаки резус (первого открытого представителя 6-дефенсинов) транскрибируется с двух различных генов и зрелая молекула пептида образуется в результате соединения пептидными связями двух молекул-предшественниц (Tang et al., 1999а). Таким образом, был открыт принципиально новый способ образования пептидных молекул посредством пост-трансляционной рекомбинации пептидов-предшественников. В третьих, молекулы 0-дефенсинов лишены амфипатичности, свойства, присущего практически всем известным АМП и, согласно современным воззрениям, необходимого для осуществления ими микробоцидной функции. Это может означать, что и механизмы антимикробного действия этих пептидов отличны от уже изученных.
Поиск новых АМП представляет интерес и с практической точки зрения, поскольку АМП животного происхождения могут послужить химическими матрицами новых антимикробных препаратов. Появление многочисленных микробных штаммов устойчивых к классическим антибиотикам заставляет искать новые классы антимикробных агентов. Широкий спектр антимикробной активности, которая сохраняется и при повышенном содержании в среде NaCl, низкая цитотоксичность в отношении клеток макроорганизма, небольшой размер молекул и легкость синтеза делает 0-дефенсины привлекательными объектами в этом смысле. Специальный интерес представляют антивирусные свойства 0-дефенсинов. Обладая способностью связывать гликопротеины вирусных оболочек 0-дефенсины in vitro предотвращают заражение клеток вирусами гриппа, герпеса, иммунодефицита человека. В настоящий момент активно и всесторонне изучаются антивирусные свойства ретроциклинов, химически синтезированных на основе знания структуры псевдогенов 0-дефенсинов человека, у которого трансляция этих пептидов невозможна из-за наличия стоп-кодона, локализованного в той части мРНК, которая кодирует сигнальную последовательность молекулы-предшественницы (Cole et al., 2004; Leikina et al., 2005). Поскольку на уровне пептидного продукта 9-дефенсины были найдены пока только у макаки резус, представляет интерес поиск других представителей этого нового и недостаточно изученного подсемейства дефенсинов у родственных видов обезьян. Эти данные могут быть полезны для понимания закономерностей возникновения и формирования разнообразия АМП дефенсинового семейства у приматов, в том числе и у человека.
Цель и задачи исследования
Целью настоящей работы были поиск и изучение физико-химических и функциональных свойств антимикробных пептидов из лейкоцитов крови павиана гамадрила. Для достижения этой цели необходимо было решить следующие задачи: 1 .Выделить и очистить до гомогенного состояния антимикробные пептиды из лейкоцитов павиана гамадрила;
2.Изучить физико-химические свойства, определить первичную структуру выделенных антимикробных пептидов;
3.Изучить антимикробные свойства выделенных пептидов в отношении тестовых микроорганизмов в зависимости от условий среды;
4.Изучить изменение проницаемости внешней и цитоплазматической мембран грамотрицательной бактерии E.coli под воздействием выделенных антимикробных пептидов;
5.Изучить гемолитическую активность выделенных пептидов в отношении эритроцитов человека.
Научная новизна
В результате проведенного исследования из лейкоцитов крови павиана гамадрила выделены три новых антимикробных пептида, относящихся к подсемейству а-дефенсинов и названных PHD1-3 (Papio hamadryas defensin). Получены приоритетные данные об антимикробной активности PHD1-3 в отношении грамположительных бактерий Listeria monocytogenes и Staphylococcus aureus, грамотрицательной бактерии Escherichia coli и низшего гриба Candida albicans, сопоставимое с антимикробной активностью а-дефенсина человека HNP1. Наряду с этим, выделены два новых антимикробных пептида, которые по ряду признаков (молекулярная масса, аминокислотный состав, характер антимикробной активности) принадлежат к недавно открытому подсемейству 0-дефенсинов. Определены минимальные ингибирующие концентрации выделенных 9-дефенсиноподобных пептидов павиана гамадрила в отношении 4-х микроорганизмов, в том числе и в зависимости от различных условий среды. Впервые показано, что а-дефенсины и 9-дефенсин RTD-1 макаки резус взаимодействуют с цитоплазматической мембраной грамотрицательной бактерии Ecoli различным образом. Получены данные о гемолитической активности выделенных пептидов. Предложен метод получения 6-дефенсина RTD-1 макаки резус и 0-дефенсиноподобных пептидов из лейкоцитов крови павиана гамадрила.
Основные положения, выносимые на защиту І.Из лейкоцитов крови павиана гамадрила выделено и охарактеризовано по физико-химическим свойствам шесть катионных антимикробных пептидов. На основании результатов определения первичной структуры доказана принадлежность трех пептидов к семейству а-дефенсинов. Структурно-функциональный анализ двух пептидов позволяет отнести их к семейству 9-дефенсинов.
2. х-Дефенсины PHD1-3 и 0-дефенсино-подобные Пептиды 2054 и 2047 павиана гамадрила являются эффективными антимикробными агентами с широким спектром микробоцидного действия.
3.Антимикробная активность а-дефенсинов PHD1-3 и 0-дефенсино-подобных Пептидов 2054 и 2047 павиана гамадрила различается в присутствии повышенных концентраций NaCl.
4.Антимикробная активность а-дефенсина PHD3 и 0-дефенсино-подобного Пептида 2054 павиана гамадрила не изменяется в широком диапазоне рН, но ингибируется при добавлении в среду сыворотки крови.
5.а-Дефенсины и 0-дефенсины взаимодействуют с цитоплазматической мембраной E.coli различным образом.
б.а-Дефенсин PHD3 и 0-дефенсино-подобные Пептиды 2054 и 2047 павиана гамадрила не вызывают гемолиза эритроцитов человека при концентрациях, на порядок превышающих минимальные ингибирующие концентрации.
Структура и объем диссертации
Диссертация изложена на 142 страниц машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов работы, результатов собственных исследований, их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы из 237 источников, из них 227 - зарубежных авторов. Работа проиллюстрирована 48 рисунками и 7 таблицами.
Апробация работы
По теме диссертации опубликовано 6 научных работ в отечественных журналах и сборниках по материалам трудов СПбГУ и научных конференций. Материалы работы докладывались и обсуждались на заседании Отдела общей патологии и патофизиологии ГУ НИИЭМ РАМН, кафедры биохимии СПбГУ, Ученого Совета НИИ физиологии им. Ухтомского в 2004-2006 гг., а также на научной конференции «Актуальные проблемы фундаментальных исследований в области биологии и медицины» (Россия, Санкт-Петербург, 2000) и объединенном иммунологическом форуме (Россия, Екатеринбург, 2004).
