Содержание к диссертации
Введение
Глава I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Явление рестрикции-модификации 9
1.2. Номенклатура и классификация ферментов систем рестрикции-модификации 10
1.3. Рестриктазы I типа 13
1.3.1. Специфичность ферментов I типа 13
1.3.2. Взаимодействие ферментов I типа с ДНК.... 14
1.4. Ферменты рестрикции-модификации Ш типа 16
1.4.1. Специфичность ферментов Ш типа 17
1.4.2. Механизм действия ферментов Ш типа 19
1.5. Рестриктазы П типа 20
1.5Л. Специфичность рестриктазы П типа 21
1.5.2. Свойства ферментов рестрикции П типа .... 28
1.5.3. Влияние условий культивирования и состава среды на содержание рестриктаз в биомассе...40
1.5.4. Выделение и очистка рестриктаз П типа ... 42
Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Аппаратура 52
2.2. Материалы 52
2.3. Бактериальные штаммы и бактериофаг 53
2.4. Среды 53
2.5. Использованные в работе буферные растворы.. 53
2.6. Получение ДНК бактериофага 54
2.7. Выращивание и разрушение мицелия штамма s. albus G для выделения рестриктазы .... 55
2.8. Применение математических методов планирования экспериментов 56
2.9. Электрофорез ДНК 56
2.10. Определение активности рестриктазы Sal GI 5б
2.11. Определение концентрации белка 57
2.12. Приготовление 10% (об./об.) раствора полиэтиленимина 58
2.13. Подготовка сорбентов для колоночной хроматографии 58
2.14. Очистка рестриктазы Sal GI 58
2.15. Оценка неспецифических нуклеаз 59
2.16. Электрофорез белков 59
2.16.1. Электрофорез в денатурирующих условиях 59
2.16.2. Электрофорез нативных белков 60
2.17. Определение молекулярной массы методом гель-фильтрации 60
2.18. Изоэлектрическое фокусирование 61
2.19. Определение оптимальных условий для эндонуклеазной реакции 62
2.20. Определение Km И Vmecc 62
Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 64
3.1. Изучение условий культивирования 64
3.1.1. Исследование влияние фазы роста на содержание рестриктазы Sal GI в биомассе. . 64
3.1.2. Оптимизация состава питательной среды математическими методами планирования эксперимента 65
3.2. Исследование условий осаждения ДНК 69
3.2.1. Фракционирование рестриктазы sal GI и белка стрептомицин-сульфатом 69
3.2.2. Фракционирование рестриктазы sal GI и белка полиэтиленимином 70
3.3. Исследование условия фракционирования сернокислым аммонием белка и рестрик
тазы Sal GI 70
3Л. Выделение и очистка рестриктазы Sal GI 73
3.4.1. Получение суспензии белков и фермента 73
3.4.2. Хроматография рестриктазы Sal GI на фосфоцеллюлозе РП 75
3.4.3. Хроматография рестриктазы sal GI на ДЭАЭ-трисакриле 75
3.4.4. Хроматография рестриктазы Sal GI
на гепаринсефарозе 77
3.4.5. Исследование чистоты ферментного препарата 81
3.4.5.1. Чистота препарата рестриктазы Sal GI 81
3.4.5.2. Определение электрофоретической гомогенности 81
3.5. Физико-химические и каталитические свойства рестриктазы Sai GI 83
3.5.1. Молекулярная масса 83
3.5.2. Определение изоэлектрической точки .. 86
3.5.3. Исследование влияния различных факторов на активность фермента 89
3.5.3.1. Изучение условий оптимальных для проявления активности рестриктазы
Sal GI 85
3.5.3.2. Влияние концентрации субстрата на скорость его расщепления рестрик-
тазой Sal GI 95
3.5.3.3. Изучение влияния ионов двухвалентных металлов на активность рестриктазы Sal GI 98
ВЫВОДЫ ЮЗ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 105
- Явление рестрикции-модификации
- Бактериальные штаммы и бактериофаг
- Исследование влияние фазы роста на содержание рестриктазы Sal GI в биомассе.
Введение к работе
Актуальность темы.
Открытие ферментов рестрикций-модификаций оказало значительное влияние на исследование в области нуклеиновых кислот.
На сегодняшний день из двух составляющих систем рестрикций-модификаций наибольшее практическое применение нашли реет-рикционные эндонуклеазы П типа. Рестриктазы в наши дни стали важнейшими инструментами молекулярной биологии, поскольку они дали возможность расщеплять ДНК у специфических нуклеотидных последовательностей. Благодаря этому стало возможным бурное развитие физического картирования ДНК, определение ее нуклео-тидной последовательности и, что самое важное, открыло широкие возможности для развития генной инженерии. Все эти успехи стали реальностью в большой степени благодаря открытию рестрикционных эндонуклеаз П типа.
Применение в широких масштабах рестрикционных эндонуклеаз делает актуальным поиск новых методов их очистки с целью получения чистых ферментов с большим выходом и за более короткое время. Поэтому большое научное и практическое значение имеют исследования по поиску продуцентов рестриктаз, изучению условий их выделения и очистки.
В настоящее время, несмотря на то, что известно большое количество рестриктаз, применяемых в генной инженерии, их свойства недостаточно изучены. Также мало сведений о факторах, влияющих на их биосинтез в клетке, так как в основном рестрик-ционные эндонуклеазы П типа используются в качестве аналитических инструментов. Важно отметить и то, что производство чистых препаратов рестриктаз мало развито и поэтому разработка _ 7 - технологии получения данных ферментов является задачей важной и актуальной для дальнейшего развития биотехнологии и методов генной инженерии.
Цель и задачи работы.
Целью настоящей работы являлось изучение факторов, влияющих на накопление рестриктазы sal gi культурой strepto-myces aibus g, а также разработка методов выделения и очистки из ее биомассы рестриктазы sal gi и изучение некоторых ее свойств.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи: - изучение влияния фазы роста на содержание рестриктазы Sal gi в биомассе; оптимизация состава питательной среды, обеспечивающей максимальное накопление фермента; изучение условий выделения и очистки рестриктазы Sal gi ; исследование некоторых физико-химических и каталитических свойств фермента.
Научная новизна.
Впервые проведена оптимизация состава питательной среды методами математического планирования экспериментов, обеспечивающая высокое накопление рестриктазы sal gi и установлена взаимосвязь между фазой роста культуры s. aibus G и ее способностью накапливать в биомассе максимальное количество фермента.
Разработана простая и эффективная схема выделения и очистки рестриктазы Sal gi до электрофоретически гомогенного состояния и впервые показана применимость хроматографии на
ДЭАЭ-трисакриле вместо ДЭАЭ-целлюлозы, который ранее не применялся для очистки рестриктаз. Определены Km и vmax фермента и впервые установлена изоэлектрическая точка для рестриктазы Sal GI ИЗ Streptomyces albus G.
Определены оптимальные для действия фермента условия проведения реакции, и изучены влияния ионов двухвалентных металлов на активность рестриктазы sal gi .
Практическая ценность работы.
В результате проведенных исследований оптимизированы условия культивирования продуцента рестриктазы sal gi : streptomyces albus g и разработан способ выделения в высокоочищенном виде этого фермента. Получены исходные данные, необходимые для создания лабораторного регламента по получению эндонуклеазы рестрикции. Выполненные исследования могут послужить основой для развертывания в КНДР и СССР выпуска этого фермента. Помимо этого, изучение и оптимизация условий осуществления реакции гидролиза ДНК даст возможность более широко и эффективно применять рестриктазу sal gi в генноинженерных экспериментах.
Явление рестрикции-модификации
Первые описания явления рестрикции-модификации относятся к началу 1950-х годов (28,100), когда было открыто явление феноти-пической вариации у бактериофагов, заключающееся в изменении эффективности посевов фага на различных штаммах бактерий в зависимости от хозяина, на которых выращивался фаг. Эффективность посева максимальна на том штамме, на котором фаг выращивался в последний раз, на других штаммах эффективность посева может варьироваться в пределах нескольких порядков. Однако, если взять фаг из негативной колонии, выросшей на рестриктирующем хозяине, то он уже не ограничивается на этом хозяине. Фаг приобретает модификацию. Если же модифицированный фаг пропустить через цикл роста на исходном штамме, то модификация утрачивается и фаг снова будет ограничиваться рестрикцирующим хозяином.
Последующие исследования этого явления, выполненные в основном „ Арбером с соавт. (18,22,54) и рядом других исследователей (92,108) привели к раскрытию состава и особенностей функционирования штаммоспецифической системы рестрикции и модификации ДНК. В эту систему входят два специфичных для определенного штамма фермента - модифицирующий (метилаза цитозиновых или адениновых остатков ДНК) и расщепляющий (рестриктаза). Эти ферменты узнают определенные короткие последовательности нуклеотидов в ДНК. Метилаза, модифицируя участки узнавания внутриклеточных ДНК, защищает ее от действия рестриктазы, узнающей эту же нуклеотидную последовательность. Ограничение проникновения в бактериальную клетку чужеродной, немодифицированной соответствующим образом ДНК, обусловлено ее чувствительностью к действию штаммоспецифической рестриктазы. Таким образом, специфические модификационные вариации и рестрикция фага определяются клеткой - хозяином и не являются генетическими изменениями фагового генома.
Бактериальные штаммы и бактериофаг
В работе использованы следующие основные приборы: ультразвуковой дезинтегратор "UD - II" ПНР; комплект хроматогра-фического оборудования (холодильная камера "comhicoidra її", коллектор фракций " uitrorack ", самописец, «увикорд, колонки), аппаратура для изоэлектрофокусирования, рН -метр" Orion Research "» прибор для электрофореза "Мультифор", спектрофотометр " Ultrospec 4-050", ДенСИТОМетр "Ultroscan" фирмы " LKB ", Швеция; ультрацентрифуга "MSE Superspeed 65", Англия; фотоэлектроколориметр типа ФЭК-56М, ультрафиолетовый осветитель типа "Хромотоскоп", фотоаппарат "Зенит" - СССР.
Материалы.
В работе использованы следующие материалы и реактивы: агароза, бромфенол голубой, кумасси голубой н 250 и G 250, этидий бромистый-фирмы "LKB ", Швеция; трис-гидроксиметил-аминометан - фирмы " Serva ", ФРГ; додецилсульфат натрия фирмы " Bio Rad ", США; Диализные МеШКИ - фирмы " Sigma ", США;
Акриламид,к ,N -метилен-бисакриламид, глицин, надсернокислый аммоний, N,N,N ,N - тетраметилендиамин - фирмы " Reanal », Венгрия; бычьий сывороточный альбумин и лизоцим - фирмы "Cai-biochem ", Швейцария; стандарты молекулярных масс для электрофореза - фирмы " Bio Rad ", США; стандартны молекулярных масс для гельфильтрации - фирмы "Serva », ФРГ; Панкреатические ДНКаза и РНКаза - фирмы " Serva », ФРГ.
Хроматографические материалы: фосфоцеллюлоза PII - фирмы "Whatman ", Англия; ультрагель АсА34 и ДЭАЭ - трисакрил фирмы " LKB " у гепарин-сефароза CL-6В - фирма "Pharmacia", Швеция. Остальные использованные в работе реактивы были производства СССР марки ХЧ или ОСЧ.
Исследование влияние фазы роста на содержание рестриктазы Sal GI в биомассе.
Так как рестрикционные эндонуклеазы П типа служили в качестве аналитических инструментов, практически мало исследованы факторы, влияющие на накопление этих рестриктаз в биомассе, такие как фаза роста культуры, компоненты питательной среды и др.
Кроме того, процесс получения препаратов рестриктаз включает, в первую очередь, выращивание биомассы штаммов-продуцентов, содержащих высокоактивные рестриктиругощие ферменты, а затем уже выделение и очистку этих ферментов, поэтому первый этап биологической работы был связан с подбором оптимальных условий культивирования штаммов.
В данном разделе изучено влияние условий культивирования на накопление рестриктазы Sal GI в биомассе и оптимизирован состав питательной среды с использованием математических методов планирования эксперимента.
Исследование влияния фазы роста на содержание рестриктазы Sal GI в биомассе.
Целью работы явилось изучение связи фазы роста s. aibus G с накоплением в биомассе рестриктазы, Sal GI.
Культуру s.aibusG выращивали в качалочных колбах на круговой качалке (см. разд. 2.7). Во всех вариантах опытов посев проводили из 4-5 суточной стационарной отдельной колонии, выращенной на твердой питательной среде СР-б (см. разд. 2.4).
Замороженные клетки суспензировали в 2-4 мл буфера А. К суспензий клеток добавляли лизоцим и инкубировали (см. разд. 2.7). Клетки разрушали ультразвуком (5 раз по 30 сек. с перерывом 30 сек.) и определяли активность рестриктазы sal Gi в бесклеточных экстрактах. Параллельно проводилось определение оптической плотности и сырой массы мицелия, накапливающегося в различных точках кривой роста культуры. Результаты эксперимента представлены на рис. I. При выборе оптимальной фазы роста культуры s.aibusG установили, что максимальное количество рестрик-тазы Sal GI накапливается в биомассе в середине логарифмической стадии роста на 18-20 часу в бесклеточном экстракте, затем относительное содержание фермента начинает снижаться. Не обнаружены рестриктазной активности в бесклеточном экстракте биомассы, собранной в стационарной фазе роста. Вероятно, к началу стационарной фазы в клетках заметно повышается содержание неспецифических нуклеаз (125).
Стремление иметь биомассу максимально обогащенную ферментами, послужило аргументом для принятия решения сбора биомассы в логарифмической фазе на 18-20 час ее роста.
