Введение к работе
s I .
гІ Актуальность темы. Согласно международной номенклатуре в настоящее время известно около 2500 ферментов, из которых на класс гидролаз приходится наибольшее количество. Из этого класса с точки зрения практического применения особый интерес представляют те эстеразы и протеазы, которые можно по механизму действия и строению активного центра объединить понятием "Сернновые гидролазы".
Сернновые гидролазы широко используются в народном хозяйстве страны (кислая и щелочная фосфатазы как диагностические препараты в медицине, холинэстераза - в химической промышленности для индикации фосфорорганических соединений, протеазы как лекарственное средство в медицине и в пщєеой промышленности для ускорения созревания продуктов и многих других отраслях).Сфера расширения использования этих ферментов ограничена недостаточной сырьевой базой. Проблема выпуска гидролаз требует поиска новых природных источников сырья и эффективных способов их выделения.
Ферменты из органов и тканей гидробионтов в промышленных масштабах не производятся. ПостановлениемПравительства было поручено ТИНРО разработать из отходов рыбопереработки технологии очистки многих ценных биологически активных веществ (БАБ) и среди них ферментов класса гидролаз: кислая и щелочная фосфатазы (КФ и Ш), холинэстеразы (ХЭ), протеазы, в том числе трипсин (Тр) и химотрип-син (ХТр). Известно, что морское сырье при обработке на пищевые цели используется не более, чем на 60 %. Выпускаемый небогатый ассортимент промышленных препаратов гидролаз из теплокровных имеет невысокую удельную активность. Это не позволяет использовать многие из них как лекарственное средство. Таким образом, актуальность этого направления работ не вызывала сомнения.
Другой аспект работы - использование данных субстратной и ин-гибиторной специфичностей в качестве характерных биохимических признаков для уточнения таксономии отдельных видов гидробионтов, в частности, кальмаров. Актуальность этого направления для биологов-прогнозистов очевидна, так как правильная систематика является основой более точного прогноза, воспроизводства и рационального ЕЫЛОЕа.
При сравнительном изучении сеойств гидролаз животных, стоящих на разных ступенях эволюции, имелась уникальная возможность дать ответ на вопрос, какой из ферментов является конститутивным.
Согласно теории S.M. Крепса те из ферментов,, которые играют .
важную жизненную функцию, наиболее защищены от влияния внешней среды, что сказывается на более медленном изменении их структуры. Таким образом, это давало возможность прилокить теорию Е.М. Крепса. применительно к сериноЕым гидролазам, что является актуальным с теоретической точки зрения.
Важным моментом поиска стабильных гидролаз есть изучение их термостабильноста. В этой связи было важно сравнить полученные нами данные с теорией В.Я. Александрова по обоснованию различий в термостабильности белков тепло- и хладолюбиЕЫХ организмов. Актуальность этого раздела работ состоит в том, что на основе теоретических гипотез можно было предсказать правильное направление поиска наиболее термостабильных препаратов.
Данная работа рассматривает комплексную технологию выделения ЕАВ на примере трех крупнейших групп гидробионтов: беспозвоночные, рыбы, млекопитающие. При этом, каждая группа представлена именно тем видом, который является для рыбной отрасли, наиболее Еажным объектом или с точки зрения его объема, или стабильности и технической возможности вылова. Исходя из этого, в основном, из беспозвоночных рассматривается кальмар; из рыб - минтай; лосось; из млекопитающих - ластоногие.
Целью работы является сравнительное комплексное изучение свойств сериновых гидролаз: фосфатаз, ХЭ, протеаз морских гидробионтов и сравнение полученных экспериментальных данных с аналогичными "реперними" ферментами, наземных животных. Требовалось, разработать эффективные технологичные методы выделения и очистки ферментов на основании полученных данных сравнительной энзимологии. Была поставлена задача создания приоритетных способов уточнения систематического ранга особей с использованием данных субстратного и ингибиторного анализа ферментов и испытание разработанного метода в практике определения таксономической принадлежности кальмаров.
Научная новизна работы. В диссертации впервые подробно проведен скрининг гидролазной активности органов и тканей различных морских организмов, в результате которого выявлены новые перспективные источники ферментов. На основе системного подхода к изучению физико-химических свойств гидролаз разработаны эффективные методы выделения и очистки фосфатаз, холинэстераз, протеаз и по-
лучены препараты, по удельной активдости не уступающие коммерческим препаратам отечественных и зарубежных фирм. Научная новизна и оригинальность методов выделения и очистки ферментов, их применение защищены 21 авторскими свидетельствами на изобретение. Обнаруженная высокая концентрация гидролаз во многих органах и тканях гидробионтов является основанием для использования морских организмов как сырья для промышленного получения этих ферментов.
Видовое разнообразие свойств фермента дает возможность разработать принципиально новый "способ уточнения таксономии водных организмов", приоритет которого защищен тремя авторскими свидетельствами на изобретение. Применение этого способа позволило уточнить систематическое древо кальмаров Бартрама, командорского и др., что в сбою очередь, используется для рекомендаций по их промышленному вылову.
На основе исследований по термостабильносги ферментов сделан еывод о том, что теплолюбивые особи имеют менее чувствительные к изменению температуры ферментные системы.
Нами высказано предположение, что субстратная специфичность, которая является наиболее важным физиологическим свойством фермента, изменяется медленнее в процессе эволюции, чем ингибиторная. Таким образом, первая может дать значительные различия лишь при сравнении "молодых" и "древних" видов, б то время как вторая -при исследовании на значительно более низком таксономическом уровне.
Практическая ценность работы; Рекомендованы новые промышленные источники сырья для получения гидролитических ферментов - не используемые ранее внутренности промысловых морских гидробионтов: рыб, беспозвоночных, млекопитающих. Разработаны методы выделения и очистки гидролаз, используемые для их промышленного получения. Налажено производство препаратов и заготовка сырья в опытно-промышленном масштабе на многих предприятиях страны. Экономическая эффективность от внедрения составляет 5 млн. рублей. Разработанный способ уточнения таксономии головоногих моллюсков для популя-ционной дифференциации видов на основе свойств гидролаз используется биологами в рвбной промышленности с целью выдачи правильных рекомендаций по рациональному вылову определенной группировки кальмаров во избежании снижения ее численности. На основе теоретических предпосылок экспериментально найдены наиболее термо - и рН стабильные гидролазы из многих органов и тканей гидробионтов.
Положения, выносимые на защиту;
морские организмы по содержанию гидролаз превосходят наземных животных и, .таким образом, являются промышленным экономически выгодным источником сырья для наработки ферментов;
характеристика субстратной и ингибиторной специфичности гидролаз органов и тканей гидробионтов значительно отличается от аналогичной характеристики "классических" ферментов наземных лсивогнш
субстратно-ингибиторные показатели каталитических свойств конститутивного фермента являются характерным биохимическим признаком особи, не зависящим от ее физического состояния, времени вылова и т.д.;
теплолюбивые особи имеют менее чувствительные к изменению температуры ферментные система;
субстратная специфичность, являющаяся наиболее важным физиологическим свойством фермента, изменяется много медленнее в процессе ЭЕ0люции,чем ингибиторная;
субстратно-ингибиторный анализ каталитических свойств фермента может быть использован при уточнении систематики кальмаров, а значит, и при рекомендациях по, рациональному вылову и воспроизводству вида;
при разработке методов выделения гидролаз гидробионтов необходимо прежде всего учитывать их физико-химические свойства и отличия от ранее известных таковых наземных кивотных. Эти характеристики говорят, как правило, в пользу большего различия свойств гидробионтов ог наземных животных, чем внутри морских организмов, что следует использовать при разработке новых методов выделения гидролаз и применения ферментов в народном хозяйстве.
Публикации и апробация работы. Всего по теме диссертации опубликовано 39 работ и получено 21 авторских свидетельств на изобретение.
' Результаты работы доложены на 4-ой Всесоюзной конференции по изучению моллюсков (Ленинград, ЗИН АН СССР, 1975 г.); Всесоюзной конференции по исследованию промысловых беспозвоночных на пищевые, кормовые и технические цели (Одесса, ИНЫМ АН УССР, ноябрь, 1977 г.); 2-ой Всесоюзной конференции по морской биологии (Владивосток, Институт биологии моря АН СССР, сентябрь, 1982 г.); 4-ой Всесоюзной конференции "Методы получения и анализа биохимреактиЕов" (Рига, НПО "Биохимреактив", 1982 г.); 5-ом Всесоюзном биохимическом съезде (Киев, январь, 1985 г.);
1-ом Всесоюзном совещании "Биологически активные вещества при комплексной утилизации гидробионгов" (Владивосток, ТИНРО, май, 1988 г.); 6-ой Всесоюзной конференции "Методы получения, анализа и применения ферментов" (Рига, НПО "Биолар", декабрь, 1990 г.); 2-ом Всесоюзном совещании "Биологически активные вещества гидро-бионтов" (Владивосток, ТИНРО, 1991 г.); Всесоюзном совещании "Рациональное использование рыб, беспозвоночных, водорослей" (Владивосток, ТИНРО, 1991 г.).
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения и 4 глав, в каждой из которых имеется обзор литературы по рассматриваемой проблеме, описание материалов и методов исследования, изложение экспериментальных данных, их обсуждение и выводы. Отдельно приведены общие выводы и заключение. Список используемой литературы Еключает 740 наименований. Работа изложена на 425 страницах. Текст диссертации иллюстрирован 55 рис. и 84 табл.
