Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы. нейрогуморальная регуляция секреторной функции желудка и экзокринной секреции поджелудочной железы 10
1.1. Регуляция желудочной секреции гормонами пептидной и непептидной природы 12
1.2. Ферменты панкреатического сока и регуляция экзокринной секреции поджелудочной железы 19
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 35
2.1. Технология получения препарата «Панинтестин» и выделения из него биологически активных пептидов 35
2. 2. Постановка эксперимента на животных 36
2.2. 1. Определение содержания пептидов в пробе для расчета дозировки 37
2. 3. Методы исследования 39
2.3.1. Определение молокосвертывающей способности пепсина 40
2. 3. 2. Определение протеолитической активности пепсина 41
2. 3. 3. Определение активности панкреатических протеиназ суммарно 42
2. 3. 4. Определение активности трипсина 44
2. 3. 5. Определение активности химотрипсина 45
2.3.6. Определение активности амилазы 45
2. 4. Статистические методы исследования 46
ГЛАВА 3. Выделение биологически активных пептидов из панинтестина и изучение их основных биохимических свойств 48
3.1. Хроматографическое разделение пептидов панинтестина методом гель-фильтрации 48
3.2. Определение молекулярной массы пептидов, выделенных из панинтестина 51
3.3. Высокоэффективная жидкостная хроматография и ее использование для фракционирования пептида В, выделенного из панинтестина 54
3.4. Разделение и анализ пептида В панинтестина с использованием методов капиллярного электрофореза, масс-спектрометрии и мембранной фильтрации 64
ГЛАВА 4. Действие пептидов, выделенных из панинтестина, на активность пищеварительных ферментов в слизистой желудка, двенадцатиперстной кишки и ткани поджелудочной железы у крыс 77
4.1. Влияние пептидов, выделенных из панинтестина методом гель-фильтрации, на активность пищеварительных ферментов желудка, поджелудочной железы и двенадцатиперстной кишки 77
4.2. Влияние низкомолекулярного пептида Сз, выделенного из пептида В методом мембранной фильтрации, на активность пищеварительных ферментов в органах гастропанкреато-дуоденального комплекса 88
4.3. Сравнение изменения активности пищеварительных ферментов под действием пептида С3, выделенного из панинтестина, и патентованных средств, применяемых для стимуляции или подавления внешнесекреторной деятельности органов гастропанкреатодуоденального комплекса 91
Заключение 100
Выводы 109
Список литературы 111
Приложения 145
- Регуляция желудочной секреции гормонами пептидной и непептидной природы
- Определение активности панкреатических протеиназ суммарно
- Определение молекулярной массы пептидов, выделенных из панинтестина
- Влияние пептидов, выделенных из панинтестина методом гель-фильтрации, на активность пищеварительных ферментов желудка, поджелудочной железы и двенадцатиперстной кишки
Введение к работе
Актуальность исследования. В связи с ростом количества гастроэнтерологических заболеваний, широко распространенных среди взрослого и детского населения и сопровождающихся секреторной недостаточностью желудка, поджелудочной железы, печени, тонкого кишечника, растет и потребность в различных препаратах ферментозаместительной терапии, выпускаемых отечественными и зарубежными фирмами (Златкина А.Р. и соавт., 1998; Ивашкин ВТ., Рапопорт СИ., 1999). Ферментные препараты отличаются друг от друга как сочетанием и дозой содержащихся в них пищеварительных ферментов, так и наличием различных добавок. Успех коррегирующей ферментотерапии зависит от правильного подбора лекарственного средства (Яковенко Э.П., 1998; Охлобыстин А.В., 2001; Di-MagnoE.P., 1999).
Известно (Яковенко Э.П., 1998), что в некоторых из ферментных препаратов содержатся высокие дозировки ферментов заместительной терапии (пепсина, трипсина, химотрипсина, липазы, амилазы), однако и они не могут полностью компенсировать недостающую часть ферментов, так как покрывают только десятые или сотые доли суточной нормы (Сторожук П.Г., Быков ИМ., 1994; Быков И.М., 2001). Несмотря на то, что ферменто-заместительная терапия не может оказывать существенного влияния на процессы пищеварения из-за недостаточного содержания в препаратах пищеварительных ферментов, многие исследователи отмечают положительный терапевтический эффект от применения препаратов ферментозаместительной терапии. Возможно, такие результаты связаны с наличием в препаратах биологически активных пептидов.
На кафедре биохимии Кубанской государственной медицинской академии уже несколько десятилетий разрабатываются технологии получения препаратов ферментозаместительной терапии и изучаются их биохимиче-
ские и физиологические свойства. Профессором Н.П. Пятницким были созданы пепсинсодержащие препараты пепсидил и сальпепсин (А.с. № 200740, 1967; А.с. № 289812, 1970), затем проф. П.Г. Сторожуком и М.М. Мыкртычаном была разработана технология получения нового искусственного желудочного сока - копепсидила (А.с. № 908358, 1982). Позже коллектив сотрудников кафедры биохимии разработал технологию приготовления препарата панинтестин (А.с. № 1476653,1987), предназначенного для лечения заболеваний с секреторной недостаточностью поджелудочной железы и двенадцатиперстной кишки. Технология получения панинтести-на предусматривает введение в гомогенат поджелудочной железы слизистой оболочки тонкой кишки, где содержатся ферменты, активирующие трипсиноген, и заканчивающие гидролиз мелких пептидов трипептидазы, дипептидазы, в результате чего происходит активация всех панкреатических ферментов, гидролиз белков собственных тканей органа с образованием многообразных форм пептидов.
При исследовании препаратов ферментозаместительной терапии было установлено, что они обладают способностью повышать секреторную деятельность желудка, поджелудочной железы и тонкой кишки. Это свойство принадлежит сопутствующим пептидам, которые были выделены из пепсидила и копепсидила (Хангалдова Т.Н., 1977; Быков И.М., 1982). Также было установлено, что препарат панинтестин обладает подобным свойством (Быков И.М., 2001). В связи с этим изучение механизмов действия препаратов заместительной энзимотерапии является одной из актуальных проблем современной гастроэнтерологии. Особое значение она приобретает при хирургическом лечении заболеваний желудка, поджелудочной железы и двенадцатиперстной кишки. Эта проблема актуальна и в педиатрии, так как недостаточность секреторной деятельности пищеварительных желез у детей не позволяет ребенку нормально питаться, что сказывается на его росте и развитии.
Целью настоящей работы является выделение пептидов из панинтестина и исследование их влияния на активность пищеварительных ферментов в желудке, поджелудочной железе и двенадцатиперстной кишке.
В связи с этим перед исследователем стояли следующие задачи:
1. При помощи гель-фильтрации и других современных физико-
химических методов выделить из панинтестина пептиды с различной мо
лекулярной массой, определить их молекулярную массу и идентифициро
вать наиболее активные фракции.
В экспериментах на животных провести исследование влияния высоко- и низкомолекулярных пептидов на активность пищеварительных ферментов в желудке, поджелудочной железе и в слизистой оболочке двенадцатиперстной кишки.
Провести сравнительный анализ воздействия на активность пищеварительных ферментов пептидов, выделенных из панинтестина, современных модуляторов желудочной и панкреатической секреции, применяемых в клинике и научно-исследовательских целях, а также пептидов, выделенных из ткани язвы желудка.
Новизна результатов исследования
Установлено, что препарат панинтестин, разработанный на кафедре биохимии Кубанской государственной медицинской академии и предназначенный для коррекции секреторной недостаточности поджелудочной железы, содержит как высокомолекулярные белки, так и биологически активные пептиды.
Впервые с использованием различных физико-химических методов, из панинтестина выделены пептиды, проведен анализ и определена их молекулярная масса.
Выявлено, что пептиды, входящие в состав панинтестина, обладают биологической активностью по отношению к органам пищеварения. Ис-
следованиями на лабораторных животных установлено, что различные пептиды обладают разнонаправленным действием: одни из них увеличивают активность ферментов желудочно-кишечного тракта, другие -уменьшают. Эффект зависит от молекулярной массы и первичной структуры пептида.
Впервые в острых опытах на крысах показано, что высокая биологическая активность полученных пептидов по своей интенсивности часто не уступает известным стимуляторам секреции желудка и внешнесекретор-ной функции поджелудочной железы (пентагастрин, гистамин).
Основные положения, выносимые на защиту
Из препарата ферментозаместительной терапии панинтестина, технология приготовления которого разработана на кафедре биохимии КГМА, при помощи гель-фильтрации и других современных физико-химических методов выделены биологически активные пептиды, определены их молекулярные массы и идентифицированы наиболее активные фракции.
Установлено, что высоко- и низкомолекулярные пептиды, выделенные из панинтестина, обладают способностью изменять активность пищеварительных ферментов в желудке, поджелудочной железе и в слизистой оболочке двенадцатиперстной кишки экспериментальных животных.
При сравнительном анализе воздействия на активность пищеварительных ферментов пептидов, выделенных из панинтестина, современных стимуляторов и ингибиторов желудочной и панкреатической секреции, применяемых в клинике и научно-исследовательских целях, а также пептидов, выделенных из ткани язвы желудка, показано, что пептиды, полученные из панинтестина, по степени влияния не уступают признанным модуляторам секреции пищеварительных желез.
Теоретическая и практическая значимость работы
Разработана схема хроматографического разделения препаратов ферментозаместительной терапии (ПФЗТ) и получения из них биологически активных пептидов. Это позволит использовать отдельные фракции пептидов для практических целей в качестве стимуляторов и ингибиторов желудочной и панкреатической секреции.
Исследованиями установлено, что при получении ПФЗТ не следует добиваться тщательной очистки ферментов от сопутствующих пептидов, так как от этих примесей зависит биологическая активность препаратов.
Сведения о внедрении результатов исследования в практику
Результаты исследования используются при чтении лекций и проведении практических занятий на кафедрах биохимии и общей химии Кубанской государственной медицинской академии, на кафедре биохимии человека и животных Кубанского государственного университета, в Институте аллергии и астмы.
Апробация работы
Основные положения диссертации доложены на Всероссийской научно-практической конференции «Органосохраняющие принципы в хирургии неотложных состояний» (Ейск, 2001), X юбилейной международной конференции «Новые информационные технологии в медицине и экологии» (Ялта-Гурзуф, 2002), 18-ой Всероссийской научной конференции с международным участием «Физиология и патология пищеварения» (Геленджик, 2002).
Публикации. По материалам проведенных исследований опубликовано 10 печатных работ.
Регуляция желудочной секреции гормонами пептидной и непептидной природы
Одна из основных стадий процесса пищеварения протекает в желудке. Он выполняет ряд важных функций, обеспечивает механическое измельчение нутриентов, необходимое для их гидролиза, и ферментообразование (Мосолов В.В., 1971; Геллер Л.И., 1975; Коротько Г.Ф., 1980; Григорович О.А., 1998; Duthie H.L., Wormsley K.G., 1979; Ittah А., 1980). Основными ферментами, образующимися в желудке, являются протеиназы, другие же - желудочная липаза, (3-глюкуронидаза и некоторые другие - не играют столь значительной физиологической роли (Геллер Л.И., 1975; Canaan S. et al., 1999). Число протеиназ - ферментов, способных катализировать гидролиз пептидных связей, весьма велико. Это в известной мере обусловлено разнообразием задач, решаемых этими ферментами, и множественностью субстратов, последовательно образующихся при расщеплении компактной белковой глобулы до коротких пептидов, а затем - до аминокислот. Однако в желудке синтезируется небольшое число протеолитических ферментов: Международной комиссией по ферментам в 1966 году утверждено четыре главных желудочных фермента, относящихся к подклассу протеиназ - пепсин ( КФ 3.4.4.1), гастриксин (КФ 3.4.4.1а), пепсин В (КФ 3.4.4.2) и реннин (КФ 3.4.4.3), отсутствующий у человека. Главными клетками слизистой желудка синтезируется группа пепси-ногенов, подразделяющаяся на восемь фракций, входящих в две иммуно-логически гетерогенные группы - пепсиноген I и пепсиноген II (Амиров Н.Ш., Антонов Д.В., 1983; Панасюк Е.Н. и соавт., 1990; Samloff I., Lieb-man W„ 1973; Weinstein W. et al., 1977; Defize J., Meuwissin S.G.M., 1987; Lanas A.L. et al., 1994; Kageyama Т., 2002). Основное место продукции пеп-синогенов - главные клетки, но пепсиноген II синтезируется и в мукоцитах (Chang Е.В., Sitrin М., 1996). При активации пепсиногенов образуются проявляющие свою активность в кислой среде протеазы: пепсин с оптимумом рН 1,5-2,0, гастриксин с оптимумом рН 3,3-3,5 (Вафин А.З., 1967; Коротько Г.Ф., 1980; Hirschowitz B.I., 1984; Baron J.H., 2000; Kageyama Т., 2002). Наиболее вероятным считается предположение, что процесс активации является последовательным и протекает в присутствии соляной кислоты по механизму аутокаталитического действия самого пепсина путем отщепления пептидных фрагментов. Пепсин и гастриксин образуются почти исключительно в желудке и ни в каких других органах и тканях не обнаружены (Мосолов В.В., 1971;MaiwaldL., 1979).
Можно отметить, что эти ферменты отличаются по термостабильности, аминокислотному составу, молекулярной массе и электрофоретиче-ской подвижности, на которой основано их разделение (Seijffers M.J. et al., 1963; Chiang L. et al., 1967; Samloff I., 1971), а также по интенсивности расщепления некоторых белковых субстратов (Chiang L. et al., 1966). Пепсин наиболее активен в отношении пептидных связей, образованных при участии карбоксильной группы ароматических или дикарбоновых аминокислот (Шлыгин Г.К., 1985; Тимофеева Н.М., 1993; Erickson R.H., Kim IS., 1990; Fruton J.S., 2002).
Эти два фермента являются эндопептидазами и суммарно обеспечивают около 95% протеолитической активности желудочного сока. При их действии из длинных полипептидных цепей пищевых белков образуются более короткие пептиды и небольшое количество свободных аминокислот (Ленинджер А., 1985; Шубникова Е.А., Коротько Г.Ф., 1986; Герасимов В.К. и соавт., 1989; Тимофеева Н.М., 1993; Николаев А.Я., 1998; Buchs S., 1974; Frenhani Р.В., Burini R.C., 1999).
Регуляция секреторной деятельности желудка подробно освещена в работах отечественных и зарубежных исследователей. Желудочная секреция определяется влиянием как центральной нервной системы, гипоталамо-гипофизарных факторов, так и эндокринного аппарата, в том числе и гастроинтестинальных гормонов (Уголев A.M., 1978; Гроссман М., 1981; Климов П.К., 1983; Радбиль О.С., Федорова М.В., 1985; Климов П.К., Ткаченко Е.И., 1995; Polak J.M., Bloom S.R., 1979; Yagi Y. et al., 1984; Feldman M., Richardson СТ., 1986; Korshak O.L., Kotsiuba V.L., 2000; Lamberts R., 2000; Hildebrand P. et al., 2001).
В сложном процессе возбуждения и торможения желудочной секреции принимают участие разнообразные эндогенные биологически активные вещества, такие как гастрин, ацетилхолин, гистамин, соматостатин, ионы кальция, цАМФ, серотонин, секретин, холецистокинин, глюкагон, ВИП, бомбезин, энкефалины, гастрин освобождающий пептид, желудочный ингибиторный пептид и другие. При этом необходимо отметить, что указанные регуляторные факторы вызывают различные ответы со стороны главных и обкладочных клеток желудка (Геллер Л.И., 1975; Сторожук П.Г. и соавт., 1981; Гроссман М., 1981; Шедрунов В.В. и соавт., 1985; Уголев A.M., Радбиль ОС, 1995; Хропычева Р.П и соавт., 2000; Loud F.B. et al., 1985; Lanas A.I. et al., 1994; Okayama N. et al., 1995; Beales I.L., 2002; Waldum H.L., Sandvik A.K., 2002; Yang H., 2002).
Об активном участии гистамина в возбуждении обкладочных клеток говорят многочисленные факты (Ивашкин В.Т., 1981; Хропычева Р.П. и соавт., 2000; Vatier J., Bonfils S., 1983; Parsons M.F., 1985; Hirschowitz B.I., 1985). При этом T.P. Douse, R.R. Dozois (1977) и M.F. Parsons (1985) считают, что любая стимуляция обкладочных клеток опосредуется через гистамин. Некоторые экспериментаторы отрицают эту взаимосвязь (Соловьева И.А., Климов ПК., 1977; Ивашкин В.Т., 1981; Grossman M.J., Konturek S.J., 1974; Simon В., Kather Н., 1977; Kwiecien S. et al., 2001).
Под влиянием гистамина происходит интенсивное отделение желудочного секрета с низкой концентрацией пепсина (Salganik R. et al., 1979).
Нет единого мнения о путях биосинтеза гистамина у человека. Одни считают, что гистамин вначале образуется в кишечнике из гистидина пищи под влиянием микрофлоры (Duncan J., Waton N., 1969), а затем, всосавшись в кровь, поступает к тучным клеткам слизистой желудка, где происходит его накопление (Hakanson R. et al., 1969). По мнению других исследователей, гистамин образуется в слизистой оболочке желудка путем де-карбоксилирования гистидина при участии специфической гистидинде-карбоксилазы (Эйдельман Ф.М., 1971; Prinz С. et al., 1999).
Из регуляторов пептидной природы наиболее изучено действие гаст-рина. Гастрин был открыт еще в 1905 г. (Edkins J.S., 1906), в настоящее время расшифрована его первичная структура и установлено, что существует несколько различных форм гастрина, различающихся по количеству входящих в их состав аминокислот, и преобладающей стойкой формой является большой гастрин (G-34), состоящий из 34 аминокислотных остатков (Rehfeld J.F., Stadil F., 1973; Gregory R.A., Tracy H.J., 1975; Walsh J.H., 1981; Dockray G.J. et al, 2001). С-концевая аминокислотная последовательность гастрина G-34 идентична гептадекапептиду G-17 (малому гастрину) и тетрадекапептиду G-14 (минигастрину) (Адриан Т.Е. и соавт., 1988; Yalow R.S., Benson S.A., 1970; Walsh J.H., 1992). Биологической активностью обладают также и С-концевой гептапептид гастрина (Раппе-quin J. et al., 2002), и С-концевой тетрапептидамид, а при блокировании аминогрупп на N-конце сила его действия увеличивается (Anderson Н.С. et al., 1964).
Определение активности панкреатических протеиназ суммарно
Под хроматографическим процессом следует понимать процесс дви жения хроматографируемого вещества в системе двух фаз, одна из кото рых неподвижна, а вторая перемещается относительно первой. Это пере мещение увлекает вещество и обуславливает его миграцию, в ходе которой оно непрерывно перераспределяется между двумя фазами. Скорость ми грации зависит от соотношения степени сродства вещества к неподвижной и подвижной фазам. Если эти соотношения для компонентов исходной смеси не одинаковы, то они мигрируют с разными скоростями и их удается физически отделить друг от друга, после того как они пройдут достаточно длинный для такого разделения путь (Бидлингмейер Б. и соавт., 1990; Столяров Б.В. и соавт., 1998; Харитонов Ю.А., 2001; Ravindranath В., 1989; ChuracekJ., 1993). Гель-фильтрация, или, точнее, гель-проникающая хроматография, наряду с электрофоретическими и некоторыми другими методами отно сится к наиболее широко применяемым способам выделения и очистки белков и пептидов. Принцип метода основан на разделении смеси белков и пептидов в зависимости от молекулярной массы с использованием хрома тографических колонок, заполненных гелеобразными носителями, в част ности, сефадексами различных марок. Носитель представляет собой от крытую поперечно-сшитую трехмерную молекулярную сетку, сформированную в виде шариков (гранул) для удобства наполнения колонок (Ос-терман Л.А., 1985). Поры внутри гранул имеют такие размеры, что некоторые из них недоступны для крупных молекул, тогда как более мелкие молекулы могут проникать во все поры. Недоступность пор обусловлена тем, что они или слишком узки для молекул, или если даже достаточно широки, то не имеют каналов, выходящих на поверхность гранул. Неподвижной фазой при гель-фильтрации является жидкость, находящаяся внутри пористых, хо рошо смачиваемых гранул носителя, заполняющих колонку, а подвижной - какой-либо элюент, подбираемый индивидуально в зависимости от типа разделяемой смеси белков и пептидов, поставленной задачи и пр. Поскольку в пределах гомогенной серии макромолекул размеры и молекулярная масса тесно связаны, элюционные объемы глобулярных белков в значительной степени определяются их молекулярными массами (ММ), но не зависят от концентрации белка, ионной силы раствора и только для не которых белков зависят от температуры (Скоупс Р., 1985; Березкин В.Г., 1999; Scopes R.K., 1994). Гель-фильтрацию применяют также и для определения молекулярной массы белков, поскольку существует линейная зависимость между логарифмом ММ белка и его элюционным объемом (V3) (Остерман Л.А., 1985; Сакодынский К.И. и соавт., 1993). Для выделения низкомолекулярных пептидов использовали вытяжку из гомогената поджелудочной железы крупного рогатого скота. Подтовку гомогената проводили согласно Авт. свид. СССР № 1476653. Разделение пептидов вели методом гель-хроматографии по методике (Остерман Л.А., 1985) с применением различных марок сефадексов при температуре ниже 10С. Для приготовления геля суспензию сефадекса G-100 (фирмы Pharmacia Fine Chemicals, Швеция) в дистиллированной воде нагревали на кипящей водяной бане в течение 5 часов и оставляли для окончательного набухания на 12 часов при комнатной температуре. Заполненную гелем колонку уравновешивали 0Д5М раствором NaCl, для чего через нее пропускали элюент в количестве 2-3 общих объемов колонки (500-700 мл). На колонку размером 70x2,5 см, заполненную се-фадексом G-100, наносили вытяжку из гомогената ПЖ в количестве 12-15 мл. В качестве элюента использовали 0,15М раствор хлорида натрия. Скорость подачи элюирующего раствора (50 мл/час) регулировали с помощью перистальтического насоса фирмы LKB (Швеция). Отдельные фракции собирали автоматическим коллектором LKB по 8-10 мл. Наличие белков и полипептидов в отдельных фракциях определяли при помощи спектрофотометра СФ-46 при і=280 нм. При анализе хроматограммы (рис. 3.1) установлено, что пик максимального свето-поглощения лежит в области 6-23 фракций. Таким образом в результате хроматографического разделения получили фракцию очищенных поли-пептидов с объемом элюции V3= 140 мл. Очищенные полипептиды помещали в емкости для сушки и сушили лиофильным методом. Режим сушки: содержимое емкостей вначале замораживали до минус 10-15С, после чего давление в камере постепенно по-нижали до 10" мм ртутного столба. Через 48-54 часа вакуум постепенно уменьшали до атмосферного давления, вскрывали камеру и проверяли степень сушки объекта. Высушенный препарат представлял собой однородный порошок или мелкие кристаллы светло-коричневого цвета.
Полученную этим способом фракцию полипептидов подвергали повторной очистке и разделению по вышеописанной методике. Для этого высушенный полипептид растворяли в 0Д5М NaCl (концентрация раствора полипептида составляла 15 мг/мл). Колонку заполняли сефадексом G-25 (той же фирмы), предварительно суспендированным в дистиллированной воде на кипящей водяной бане в течение 1 часа и выдержаным 12 часов при комнатной температуре. Колонку уравновешивали 0Д5М раствором хлористого натрия. На колонку размером 75x2,5 см, заполненную сефадексом G-25, наносили 7 мл раствора очищенного полипептида. Отдельные фракции по 7-8 мл собирали автоматическим коллектором фракций, наличие белков и пептидов определяли спектрофотометрически. В результате повторной гель-фильтрационной очистки было получено несколько фракций полипептидов (рис. 3. 2), которым соответствовало максимальное свето-пог лощение.
В результате рехроматографирования было выделено три фракции полипептидов, соответствующих объемам элюции 75, 190 и 270 мл (на хроматограмме фракции 10-11, 25-27 и 35-37 соответственно), которые условно были обозначены как А, В и С. Все полученные гель-фильтрацией очищенные фракции были исследованы на наличие ферментативной активности: ни один из пептидов не обладал ни протеолитической, ни ами-лолитической активностью.
Определение молекулярной массы пептидов, выделенных из панинтестина
В качестве другого, независимого, метода применяли капиллярный электрофорез, в основе которого лежит способность заряженных частиц перемещаться в растворе под влиянием электрического поля с различной скоростью. Различие скоростей перемещения может быть обусловлено двумя причинами: во-первых, молекулы (как низкомолекулярные, так и макромолекулы) несут на себе заряды неодинаковой величины и поэтому при наложении электрического поля могут ускоряться в различной степе ни, во-вторых, их перемещению препятствует различающееся по величине сопротивление трения. В случае классического электрофореза применяются гели или полоски бумаги, пропитанные электролитами для того, чтобы уменьшить помехи, вызванные конвекцией, а также увеличить сопротивление трения мак ромолекул с незначительными различиями в зарядах и тем самым усилить эффект разделения. С помощью кварцевого капилляра с внутренним диа метром 50-100 мкм удается достигнуть высокоэффективного разделения белков, при котором из-за сравнительно большого отношения поверхности к объему значительно уменьшается влияние мешающей разделению тер мически индуцированной конвекции (Волощук A.M., 1996). Капиллярному электрофорезу подвергали как исходный пептид В для разделения входящих в его состав пептидов, так и рехроматографированные фракции 1-5 с целью более детального анализа. Разделение проводили на приборе фирмы АВ1 (модель 270А), капилляр диаметром 75 мкм. В качестве буфера использовали фосфат натрия рН 11, температура 38С, напряжение 30 кВ. Результаты электрофореза исходного препарата представлены на рис.3.16, результаты анализа фракций 1-5 - на рис. 3.17-3.20.
На представленных электрофореграммах видно, что под действием электрического поля движение компонентов, входящих в состав выделенного гель-фильтрацией из панинтестина пептида В, происходит с различной скоростью. Таким образом, метод электрофоретического разделения подтверждает, что взятый для изучения пептид не однороден по составу, а включает в себя несколько различных пептидов, различающихся по физико-химическим свойствам, в частности по величине заряда и, возможно, молекулярным массам. Величины пиков на электрофореграмме исходного пептида (рис. 3. 16) значительно различаются между собой, тогда как на электрофореграммах отдельных рехроматографированных фракций (рис. 3. 17- 3. 20) таких отличий не наблюдается. Сравнивая результаты капиллярного электрофореза (рис. 3. 20) и жидкостной хроматографии (рис. 3. 4), можно также отметить, что преобладающей фракцией в составе пептида В является фракция 5.
Для детального анализа хроматографированных фракций использовали метод масс-спектрометрии, который широко применяют для идентификации и установления структуры органических соединений. Сущность метода заключается в том, что анализируемое вещество подвергают ионизации (в случае исследования органических соединений используют химическую ионизацию или лазерное излучение), а затем ионизированные молекулы и атомы разделяют в масс-спектрометре по их массам. При ионизации молекулы образуется большое количество осколков. Появление молекулярного иона в масс-спектре наблюдается при энергии электронов, соответствующей энергии ионизации органического соединения. Вероятность образования и устойчивость молекулярного иона для разных соединений различна.
Масс-спектрометрия позволяет определить молекулярную массу и структуру органических соединений. Молекулярную массу удобно устанавливать по пику молекулярного иона. В тех случаях, когда пик молеку лярных ионов в масс-спектре достаточно интенсивен, можно приближенно рассчитать валовую (брутто) формулу органического соединения по числу атомов каждого вида (Карасек Ф., Клемент Р., 1993; Геккелер К.Е., Эк-штайн X., 1994; Золотов Ю.А., 2000; Churacek J., 1993).
Современные хромато-масс-спектрометрические системы получают данные посредством непрерывного сканирования масс-спектров элюата, выходящего из хроматографической колонки. При этом можно получить хроматограмму зависимости изменения суммарного ионного тока во вре мени, отмечая выход каждого компонента смеси из колонки. Для построе ния масс-хроматограммы берут интенсивности пиков нескольких ионов из каждого записанного масс-спектра и строят график зависимости этих ин тенсивностей от номера масс-спектра, соответствующего времени удержи вания того или иного компонента. Наличие на масс-хроматограмме пика с точно заданной массой и определенным временем удержания для конкретного соединения является доказательством его при сутствия в образце. Масс-спектры MALDI снимали на приборе Vision-2000 (Thermo Bioanalysis Corp., Англия). Источник возбуждения - азотный лазер (337 нм). Максимальная энергия возбуждения - 250 мкДж. В качестве матрицы была использована дигидроксибензойная кислота. Данный метод применяли для анализа рехроматографированных фракций, полученных методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Масс-спектры отдельных фракций, выделенных из пептида В, представлены на рисунках 3.21-3.24. Использование масс-спектрометрии подтверждает, что образец В обладает значительной неоднородностью и состоит из компонентов, различающихся по молекулярной массе. В масс-спектрах есть пики с массами 347-497, что соответствует 3-4-5-членным пептидам.
Влияние пептидов, выделенных из панинтестина методом гель-фильтрации, на активность пищеварительных ферментов желудка, поджелудочной железы и двенадцатиперстной кишки
Для оценки стимулирующего действия выделенных из панинтестина пептидов был проведен сравнительный биохимический анализ влияния пептида Сз, полученного методом мембранной фильтрации, и препаратов, применяемых в качестве модуляторов секреции экзокринных желез пищеварительного тракта - пентагастрина, гистамина, даларгина.
Пентагастрин - пептид, в котором N-концевая блокирующая группа (третичный бутилоксикарбонил) и 3-аланин связаны с С-терминальным тетрапептидамидом гастрина, и гистамин используются в клинических и исследовательских целях для стимуляции желудочной секреции. Оба эти препарата значительно повышают секрецию соляной кислоты и, в меньшей степени, выделение пепсина. Даларгин же, являющийся структурным аналогом лей-энкефалина, напротив, ингибирует как секрецию соляной кислоты, так и пепсина, а также снижает синтез ферментов в поджелудочной железе.
Для сравнительного анализа использовали также биологически активные пептиды, выделенные из ткани свежеиссеченной язвы желудка. Ульцерозная ткань была получена при реконструктивных и органосохра-няющих операциях, проводимых в Российском центре функциональной хирургической гастроэнтерологии. Пептиды выделяли методом колоночной гель-хроматографии из вытяжки ткани язвы с использованием сефа-дексов G-100 и G-50 по методике, описанной в главе 3. Полученные пептиды были обозначены как гастроульцерозный пептид GUP-1 (однократная очистка на сефадексе G-100) и GUP-2 (повторное хроматографирование на сефадексах G-100 и G-50). Молекулярная масса этих пептидов, определенная по маркерным белкам (подробная методика описана в п. 3. 2), составляла приблизительно 4500-5500 кДа у пептида GUP-1 и 2500-3500 a-yGUP-2.
Опыты были поставлены на семи группах крыс-самцов массой 150-200 г (п=30), условно обозначенных как I, II, III, IV, V, VI и VII. В качестве контроля использовали физиологический раствор. После 24-часового голодания при свободном доступе к воде крысам I группы (контрольной) внутрибрюшинно вводили физиологический раствор, крысам II группы -раствор пентагастрина в физиологическом растворе в дозе 6 мкг/кг масс крысы, крысам III - гистамин в дистиллированной воде из расчета 200 мкг/кг, IV - 100 мкг/кг даларгина, V - раствор пептида Сз в 0,9%-ном хлористом натрии (6 мкг пептида на кг массы животного). Крысы VI и VII групп получали растворы пептидов GUP-1 и GUP-2.
Крыс IV группы, получавших даларгин, подвергали декапитации через 10 минут, т. к. даларгин оказывает кратковременное действие и быстро инактивируется. Крыс остальных шести групп забивали после обычной 60-минутной экспозиции. Из брюшной полости животных извлекали желудок, поджелудочную железу и двенадцатиперстную кишку, из которых по вышеописанным методикам готовили 10%-ные гомогенаты. В гомогенатах желудка определяли протеолитическую активность пепсина, в гомогенатах поджелудочной железы и ДІЖ - активность трипсина, амилазы и суммарную протеолитическую активность. Результаты биохимических анализов обработаны статистически и сведены в табл. 4. 8, 4. 9 и 4. 10.
Из полученных данных видно, что по сравнению с контролем, принятым за 100%, при введении исследуемых препаратов наблюдаются различные изменения активности ферментов.
Так у крыс II группы под действием пентагастрина активность трипсина в гомогенате поджелудочной железы статистически достоверно (р 0,001) увеличивается на 39%, а суммарная протеолитическая активность - на 24%. Активность амилазы в ПЖ под влиянием пентагастрина статистически достоверно (р 0,01) растет, достигая 122%.
Активность пищеварительных гидролаз в слизистой двенадцатиперстной кишки у крыс II группы в ответ на введение пентаграстрина также изменяется: активность трипсина возрастает на 24% (р 0,05), суммарная активность протеиназ - на 40%, а активность амилазы растет статистически недостоверно. Протеолитическая активность пепсина в гомогенате желудка увеличивается на 35% по сравнению с контрольной группой.
Гистамин изменяет ферментообразование в органах желудочно- кишечного тракта у крыс (III группа) следующим образом: активность пепсина статистически достоверно (р 0,01) увеличивается на 26% в сравнении с контролем, активность трипсина в гомогенате поджелудочной железы возрастает до 163% (р 0,001), а в гомогенате ДІЖ - до 128% (р 0,02). Изменение суммарной протеолитической активности у этой группы крыс не столь существенно: в гомогенате поджелудочной железы СПА возрастает на 20%, а в гомогенате ДІЖ - на 24% (статистическая достоверность в первом случае составляет р 0,01, а во втором р 0,5). Активность амилазы увеличивается на 65% в гомогенате ПЖ, а в гомогенате двенадцатиперстной кишки прирост в 14% статистически недостоверен.
Введение даларгина снижает активность всех пищеварительных ферментов желудочно-кишечного тракта у крыс IV группы: активность пепсина снижается на 37%, активность трипсина в гомогенате поджелудочной железы уменьшается на 28%, а в гомогенате двенадцатиперстной кишки - на 24%. Активность амилазы и СПА в ответ на введение даларгина изменяются не столь значительно: в гомогенате ДІЖ активность амилазы составляет 89% от контрольной, а суммарная активность протеиназ -87%, однако статистическая достоверность этих результатов составляет р 0,5. В гомогенате поджелудочной железы изменения активности этих ферментов также статистически недостоверны.
Пептид Сз, введенный крысам V группы, вызывает следующие изменения ферментативной активности: в гомогенате поджелудочной железы активность трипсина растет, достигая 151% по сравнению с контролем; суммарная активность протеиназ не дает статистически достоверного прироста (р 0,5), а активность амилазы возрастает даже существеннее, чем при стимуляции пентагастрином (до 184 против 122%). На активность пепсина данный пептид влияния не оказывает.
Похожие диссертации на Выделение пептидов из панинтестина и изучение их биологических свойств
