Введение к работе
Актуальность проблемы. Углеводный метаболизм многих организмов основан
на гликолизе, функционирующем во всех трех доменах - Bacteria, Archaea и Еикагуа. У
большинства из них ключевую стадию этого пути - фосфорилирование фруктозо-6-
фосфата до фруктозо-1,6-бисфосфата, катализирует аллостерически регулируемая
АТФ-зависимая 6-фосфофруктокиназа (АТФ-ФФК). У архей эту реакцию осуществляет
АДФ-зависимый фермент из семейства глюкокиназ, не проявляющий сходства
аминокислотной последовательности с 6-фосфофруктокиназами (ФФК), но имеющий
аналогичную кристаллическую структуру (Sakuraba, Ohshima, 2002; Ronimus, Morgan,
2001; Ito et al., 2001). Однако у ряда про- и эукариот - фототрофных бактерий,
анаэробов, паразитических микроорганизмов, Euglena gracilis, а также у высших
растений присутствует пирофосфат-зависимая 6-фосфофруктокиназа (ПФК),
гомологичная по аминокислотной последовательности АТФ-ФФК. Реакция,
катализируемая ПФК, обратима, что предполагает участие фермента как в гликолизе,
так и глюконеогенезе:
Mg2+ Фруктозо-6-Ф + ФФН < " Фруктозо-1,6-Ф2 + Фн
Причины и следствия замены АТФ на ФФн в ключевой реакции гликолиза неясны. Предложены альтернативные гипотезы, рассматривающие присутствие ПФК как проявление "ископаемого метаболизма", который сохранился в качестве рудимента у небольшого числа организмов, или, напротив, ПФК могли возникнуть из АТФ-зависимых ферментов под давлением условий обитания, и это приобретение явилось адаптивным приспособлением к анаэробным условиям (Bapteste et al., 2003; Siebers et al., 1998; Chi, Kemp, 2000).
Ранее ПФК была обнаружена у аэробных метанотрофов - специализированной группы бактерий, использующих метан в качестве источника углерода и энергии. Считалось, что ПФК нехарактерна для не растущих на метане метилобактерий, что указывало на ее возможную связь с метаболизмом метана (Шишкина, Троценко, 1990; Бесчастный и др., 1992), за исключением актиномицета Amycolatopsis methanolica, растущего на метаноле (Alves et al., 1994). Однако недавно в геномах Methylibium petroleiphilum PMl (Kane et al., 2007) и ризосферных фитосимбионтов Methylobacterium nodularis ORS 2060 и Methylobacterium sp. 4-46 найдены гены-гомологи ПФК.
Метанотрофы и метилобактерий ассимилируют углерод метана и метанола посредством двух альтернативных циклических путей - рибулозомонофосфатного (РМФ) (метанотрофы I типа) или серинового (II тип), в которых первичными продуктами биосинтеза являются, соответственно, Сб-фосфосахара или Сз-соединения. Кроме того, метилобактерий могут ассимилировать углерод метанола после окисления до СОг через цикл Кальвина. Особую группу представляют метанотрофы X типа,
реализующие одновременно три пути Сі-ассимиляции - РМФ, сериновый и минорный
цикл Кальвина, где в числе первых продуктов образуются Св- и Сз-соединения. Как следствие, у метилотрофов с различными путями первичного Сі-метаболизма значение гликолиза в биосинтезе фосфотриоз или фосфогексоз различно, что обусловило их перспективность для изучения функциональной роли ПФК и ФФн. Доступность нуклеотидных последовательностей геномов ряда облигатных метанотрофов и факультативных метилобактерий Methylomicrobium alcaliphilum 20Z (І тип), Methylococcus capsulatus Bath (X тип), Methylosinus trichosporium OB3b (II тип), а также Methylobacterium nodulans ORS 2060, позволила использовать основанную на клонировании современную методологию очистки рекомбинантных ПФК для последующей характеристики и филогенетического анализа.
Цель и задачи исследования. Основная цель данной работы - изучить свойства и роль ПФК в метаболизме метилотрофных бактерий, реализующих различные пути Ср метаболизма. Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:
Очистка и характеристика рекомбинантных ПФК и фруктозо-1,6-бисфосфатальдолазы (ФБА) из Methylococcus capsulatus Bath.
Изучение организации кластера (возможности котранскрипции) теповр/р и hpp в хромосоме Мс. capsulatus Bath.
Очистка и характеристика рекомбинантной ПФК из Methylomicrobium alcaliphilum 20Z.
Очистка и характеристика рекомбинантных ПФК из Methylosinus trichosporium ОВЗЬ и Methylobacterium nodulans ORS 2060.
Проведение филогенетического анализа ПФК.
Научная новизна. Обнаружено, что ПФК Мс. capsulatus Bath, кроме фруктозо-6-фосфата (Фр-6-Ф), фосфорилирует седогептулозо-7-фосфат (С-7-Ф) и рибулозо-5-фосфат (Ру-5-Ф), проявляет наиболее высокое сродство и активность с С-7-Ф, и имеет наибольшее сходство аминокислотной последовательности с ортологами из хемолитоавтотрофных бактерий. Предложена схема модифицированного цикла Кальвина с участием ПФК в реакциях восстановительного пентозофосфатного пути. Впервые установлено, что у Мс. capsulatus Bath гены р/р и hpp, кодирующие ПФК и мембранную Н+-транслоцирующую пирофосфатазу, транскрибируются в виде бицистронной мРНК, на основании чего предположено участие ПФК и ФФн в энергетическом метаболизме данного метанотрофа. Показано, что ФБА Мс. capsulatus Bath обратимо катализирует расщепление как фруктозо-1,6-бисфосфата (ФБФ), так и седогептулозо-1,7-бисфосфата (СБФ).
Доказано, что ПФК Mm. alcaliphilum 20Z высокоактивна в направлении гликолиза и глюконеогенеза, но неэффективна в реакции с С-7-Ф. ПФК Ms. trichosporium ОВЗЬ и Mb. nodulans ORS 2060 проявляют более высокое сродство к ФБФ, чем к Фр-6-Ф, что указывает на преимущественное участие данных ферментов в глюконеогенезе.
Найдено, что ПФК Ms. trichosporium ОВЗЬ ингибируется АМФ и АДФ, что подразумевает участие фермента в регуляции синтеза и распада углеводов в зависимости от энергетического статуса клеток. Индуцибельность ПФК при росте Mb. nodularis ORS 2060 на арабинозе и более высокое сродство с С-7-Ф, чем с Фр-6-Ф, указывают на специфическую функцию фермента при использовании Сахаров в анаэробных условиях фитосимбиоза.
Установлено, что ПФК Мс. capsulatus Bath и Ms. trichosporium ОВЗЬ проявляют наибольшее сходство аминокислотных последовательностей с ортологами хемолитоавтотрофов и принадлежат к филогенетической подгруппе «В2» группы II 6-фосфофруктокиназ. Ферменты Mm. alcaliphilum 20Z и Mb. nodularis ORS 2060 отнесены к ФФК филогенетической подгруппы «Р», для большинства которых доказана гликолитическая функция.
Научно-практическое значение. Благодаря высокой активности и стабильности, ПФК Mm. alcaliphilum 20Z может быть использована в аналитической биохимии как специфический реагент для определения ФБФ в качестве сопрягающего фермента при измерении скорости реакции альдольной конденсации, катализируемой ФБА, а также для измерения скорости образования ортофосфата или пирофосфата. Уникальная способность ПФК Мс. capsulatus Bath обратимо фосфорилировать С-7-Ф может найти применение в синтезе СБФ и С-7-Ф.
Апробация работы. Основные положения диссертации доложены на ежегодных отчетных конференциях ИБФМ РАН (2006-20 Югг), на Всероссийской молодежной школе-конференции «Актуальные аспекты современной микробиологии» (Москва, 2007), на международной научной конференции «Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии» (Минск, 2008), на I и III школе-конференции «Биология: традиции и инновации в 21 веке» (Казань, 2008; Нижний Новгород, 2010), на III и IV международном конгрессе европейских микробиологов (FEMS; Ґетеборг, Швеция, 2009; Женева, Швейцария, 2011), на XIII международной школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2010), на VIII международном конгрессе экстремальных микроорганизмов (Понта-Дельгада, Португалия, 2010), на Всероссийской конференции с элементами научной школы для молодежи «Экотоксикология-2010» (Тула, 2010), на научной конференции «Автотрофные микроорганизмы», посвященной памяти акад. Е.Н. Кондратьевой (МГУ, 2010).
Место проведения работы. Экспериментальная часть работы выполнена в лаборатории радиоактивных изотопов ИБФМ им. Г.К. Скрябина РАН в рамках темы «Экстремофильные и экстремотолерантные аэробные метилотрофы» (№ Госрегистрации 01.20.0403398).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 статей и 10 тезисов.
Благодарности. Автор благодарен сотрудникам ИБФМ РАН и ИБ РАН, способствовавшим выполнению данной диссертационной работы: к.б.н. Мустахимову И.И., к.б.н. Решетникову А.С, к.б.н. Бесчастному А.П., Глухову А.С. Особую признательность автор выражает своим научным руководителям — д.б.н. Хмелениной В.Н. и д.б.н., проф. Троценко ЮЛ.
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 127 стр. и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, заключения, выводов и списка литературы, включающего 197 ссылки, из них 16 на русском и 181 на английском языках, содержит 11 таблиц и 41 рисунок.
