Содержание к диссертации
Введение
2. Обзор литературы 8
2.1. Общие представления О ДНКазах эукариот 8
2.1.1. Классификация ДНКаз 8
2.1.2. Распространенней функциональная роль ДНКаз 10
2.2. Свойства и первичная структура металлозависимых ДНКаз... 12
2.2.1. Физико-химические свойства щелочных ДНКаз .12
2.2.2. Ферментативные свойства щелочных ДНКаз 13
2.2.3. Первичная структура и активные центры метаплозависимых ДНКаз 21
2.3. Свойства и первичная структура кислых ДНКаз 24
2.3.1. Физическо-химические свойства кислых ДНКаз 24
2.3.2. Ферментативные свойства кислых ДНКаз 25
2.3.3. Первичная структураи активные центры кислых ДНКаз 31
2.4. ДНКазы как участники апоптотического процесса 34
2.4.1. Молекулярные механизмы апоптоза 34
2.4.2. ДНКазы - участники апоптотического процесса 36
2.5. Апоптотический процесс в половых клетках 42
2.5.1. ДНКазы в мужских репродуктивных органах и половых клетках 42
2.5.2. Апоптотический процесс в половых клетках 43
3. Материалы и методы исследования 49
4. Результаты исследования и их обсуждение 57
4.1. Выделение и свойства ДНКаз спермиев морского ежа 57
4.1.1. Очистка ДНКаз из спермиев морского ежа 57
4.1.2. Физико-химические и ферментативные свойства ДНКаз из спермиев морского ежа 60
4.2. Специфичность ДНКаз спермиев морского ежа 79
4.2.1. Специфичность Са, Mg-ДНКазы из спермиев морского ежа. 79
4.2.2. Специфичность Са, Мп-ДНКазы из спермиев морского ежа 86
4.2.3. Специфичность К-ДНКазы из спермиев морского ежа 89
4.3. Биологическая роль ДНКаз семенников и спермиев морского ежа 92
4.3.1. Исследование участия ДНКаз в резорбции половых клеток в гонадах морского ежа .92
4.3.2. Исследование участия Са, Mg-ДНКазы в апоптотическом процессе спермиев морского ежа 99
5. Выводы 111
6. Список литературы 113
- Распространенней функциональная роль ДНКаз
- Первичная структураи активные центры кислых ДНКаз
- Очистка ДНКаз из спермиев морского ежа
- Специфичность К-ДНКазы из спермиев морского ежа
Введение к работе
Актуальность проблемы. Особый интерес к изучению дезоксирибонуклеаз (ДНКаз) обусловлен получением убедительных доказательств их участия в программируемой гибели клеток или апоптозе. Многочисленные исследования механизмов реализации апоптоза в различных клетках и поиск возможных путей его модулирования выдвинули проблему исследования ДНКаз, являющихся одними из основных участников апоптотического процесса, в ряд наиболее актуальных задач современной биохимии.
К настоящему времени выявлены два типа ДНКаз, принимающих участие в апоптозе: металлозависимые (Mg2+- и Са2+, Mg2+-зависимые ДНКазы) и катион-независимые кислые ДНКазы.
Современные исследования показали, что физиологическая гибель дефектных или «лишних» мужских половьж клеток млекопитающих в течение сперматогенеза является апоптотическим процессом. У морских беспозвоночных функцию контроля количества и качества развивающихся половьж клеток выполняет процесс резорбции. Однако, исследований механизмов, лежащих в основе процесса резорбции половьж клеток в ходе их созревания в морских организмах, с точки зрения апоптотического процесса, до сих пор не проводилось.
В настоящее время информация об апоптотическом процессе в зрельж мужских половьж клетках весьма ограничена. В существующих единичньж работах по исследованию апоптоза в сперматозоидах млекопитающих не изучались ни механизмы его реализации, ни ДНКазы, участвующие в этом процессе. Исследование апоптоза в половьж клетках морских организмов было проведено только в одной работе, выполненной на яйцеклетках морского ежа, в которой авторы так же не определяли ДНКазы в апоптотическом процессе. Исследования участия ДНКаз в апоптотическом процессе в репродуктивных органах или сперматозоидах ограничиваются единственной работой, в которой было показано вовлечение кислой ДНКазы в апоптоз клеток яичника китайского хомячка.
На сегодняшний день существуют всего несколько работ, посвященньж исследованию ДНКаз в мужских половьж продуктах. Непосредственно в мужских половьж клетках кислая ДНКаза II была обнаружена только в сперматозоидах вьюна Misgurnusfossilis L. В то же время было показано, что спермин кролика не содержат активностей Д Н Каз.
Таким образом, цель данного исследования определили следующие факторы: недостаточность и противоречивость информации о присутствии ДНКаз в сперматозоидах разньж организмов; данные об инициации апоптотического процесса в зрельж сперматозоидах млекопитающих; отсутствие исследований процесса резорбции в морских беспозвоночных с точки зрения апоптоза.
Цель и задачи исследования. Целью работы явилось исследование ДНКаз репродуктивных органов и половьж клеток самцов морского ежа Strongylocentrotus intermedius и определение их функциональной роли.
В соответствии с целью работы, были поставлены следующие задачи:
Выявить присутствие ДНКаз в спермиях морского ежа S. intermedius и разработать схему очистки для выделения индивидуальных препаратов ферментов.
Определить основные физико-химические и ферментативные свойства выделенных ферментов.
РОС НАЦИОНАЛЬНАЯ]
БИБЛИОТЕКА |
Исследовать специфичность действия ферментов спермиев с использованием синтетических олигонуклеотидов различной нуклеотидной последовательности и длины.
Определить уровень удельной активности эндогенных щелочных и кислых ДНКаз в репродуктивных органах самцов морского ежа в течение годового репродуктивного цикла.
Выявить корреляцию процессов резорбции половых клеток в семенниках морского ежа в ходе репродуктивного цикла с изменением уровня активности эндогенных ДНКаз.
Выявить наличие в зрелых транскрипционно неактивных спермиях морского ежа S. intermedius программы физиологической гибели клеток (апоптоза) и показать участие в этом процессе эндогенных ДНКаз.
Положения, выносимые на защиту:
Спермин морского ежа S. intermedius содержат активности двух щелочных металлозависимых и одной кислой катион-независимой дезоксирибонуклеаз.
Выделенные ДНКазы спермиев морского ежа обладают индивидуальными физико-химическими и ферментативными свойствами и отличаются по специфичности действия.
Транскрипционно неактивные спермин морского ежа имеют программу физиологической гибели клеток (апоптоза), индукция которой происходит в результате замораживания-оттаивания спермиев, находящихся в смеси 20%-ный глицерин-морская вода.
В реализации программы апоптотической гибели спермиев принимает участие эндогенная Са2+, Mg2+- зависимая ДНКаза.
Научная новизна и практическая ценность. В результате проведенных исследований впервые показано, что в спермиях морского ежа S. intermedius присутствуют три эндодезоксирибонуклеазы, принадлежащие к двум типам: две щелочные металлозависимые и кислая катион-независимая ДНКазы. Разработана схема очистки, которая позволила выделить в индивидуальном виде препараты трех ДНКаз, не содержащие примесей других нуклеаз. Определены их основные физико-химические и ферментативные свойства.
С использованием метода фут-принтного анализа определена специфичность выделенных ДНКаз спермиев. Впервые исследована специфичность фермента, принадлежащего к группе Са2+, Мп2+- зависимых ДНКаз эукариот, - Са, Мп-ДНКазы спермиев морского ежа. Показано, что синтетические одноцепочечные олигонуклеотиды абсолютно устойчивы к действию Са, Mg-ДНКазы спермиев морского ежа.
Впервые установлена корреляция процесса резорбции половых клеток морского ежа в течение репродуктивного цикла с изменением уровня удельной активности эндогенных щелочных и кислых ДНКаз.
Впервые показано, что в спермиях морского ежа, несмотря на то, что они находятся в транскрипционно и трансляционно неактивном состоянии, существует программа реализации апоптотической гибели клеток.
Впервые с использованием электронной микроскопии исследована кинетика морфологических изменений спермиев морского ежа в течение процесса апоптоза.
Новизна выбранного подхода для решения поставленных задач заключается в комплексном исследовании: с одной стороны, выделение и определение свойств ДНКаз спермиев морского ежа, как потенциальных участников программируемой
гибели клеток, с другой стороны, получение доказательств их участия в апоптотическом процессе.
Са, Mg-ДНКаза спермиев, в связи со способностью сохранять активность в природной морской воде, может быть рекомендована для использования в биологическом тестировании уровня загрязненности морской воды ионами тяжелых металлов. Выявленная строгая специфичность Са, Mg-ДНКазы к двухцепочечному субстрату, позволит использовать данный фермент для генно-инженерных работ. Спермин морского ежа могут использоваться в качестве удобной модели для исследования способности различных веществ являться модуляторами апоптотического процесса Проведенное изучение процесса апоптоза в спермиях морского ежа вносит существенный вклад в развитие дальнейших исследований его молекулярных механизмов и определение путей его регуляции, с целью решения проблемы мужской стерильности.
Апробация работы. Результаты работы были представлены на 10th International symposium on Marine Natural Products (Nago, Okinawa, 2001); Первой Международной конференции "Морские прибрежные экосистемы: водоросли, беспозвоночные и продукты их переработки" (Москва, 2002), 23 rd International symposium on the chemistry of natural products (Florence, Italy, 2002); 1-ом съезде Общества клеточной биологии (Санкт-Петербург, 2003).
Публикации. По материалам исследований опубликовано 7 печатных работ (3 статьи и 4 тезисов конференций).
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Список литературы включает 194 публикации. Диссертация изложена на 128 страницах машинописного текста, содержит 4 таблицы и 27 рисунков.
Распространенней функциональная роль ДНКаз
ДНКазы присутствуют в клетках всех представителей живого мира, в прокариотах и эукариотах, в различных тканях и органах. Принято считать, что ДНКазы, в связи со своим повсеместным распространением практически во всех тканях организмов, входят в группу так называемых «ферментов домашнего хозяйства» или «house-keeping enzyme».
В настоящее время достаточно хорошо изучены ДНКазы бактерий и фагов. Развитие молекулярной биологии способствовало выяснению роли отдельных ДНКаз бактерий в процессах репликации, репарации, рекомбинации и рестрикции. Современные исследования ДНКаз эукариот показали, что эти ферменты, так же как и бактериальные ДНКазы, участвуют в таких важнейших процессах функционирования генетического аппарата клетки как репликация и репарация ДНК (Mishra, 2002).
Локализация кислых ДНКаз в лизосомах, содержащих многие гидролазы, в том числе и ферменты, необходимые для полной деградации нуклеиновых кислот, позволила предположить, что эти ДНКазы в первую очередь участвуют в процессах деградации ДНК. В то же время существуют предположения об участии кислых ДНКаз в таких процессах, как рекомбинация, репарация и репликация (Cordonier, Bemardi, 1968; Mishra, 2002).
В отличие от кислых ДНКаз, щелочные металлозависимые ферменты локализованы преимущественно в ядрах, хотя так же обнаруживаются в митохондриальной и лизосомальной фракциях. Предполагается, что щелочная Мп2+-зависимая ДНКаза хроматина печени крыс входит в состав репликативного комплекса и, соответственно, влияет на репликативный синтез ДНК (Винтер и др., 1990).
За последние несколько лет появились убедительные доказательства участия ДНКаз в апоптозе, что, учитывая актуальность и значимость исследования его механизмов, обусловило повышенный интерес к изучению эндонуклеаз. Было показано, что в ходе реализации апоптотического процесса ДНКазы осуществляют фрагментацию хромосомной ДНК по межнуклеосомным участкам с образованием дискретных фрагментов кратных -200 п.н. При этом ДНКазы существуют в клетке либо в виде неактивного предшественника, либо в комплексе с ингибитором, и их активация происходит под действием апоптотических стимулов. Подтверждено, что ДНКазами, принимающими участие в апоптотическом процессе в разных клетках являются Са2+, Мд +-зависимые ДНКазы, эндонуклеазы типа ДНКазы I и кислые металлонезависимые ДНКазы. До настоящего момента основная роль кислых ДНКаз связывалась с процессами деградации и утилизации хромосомной ДНК (Dulaney, Touster, 1972). Эти утверждения связаны с тем, что кислые ДНКазы обнаруживают среди лизосомальных ферментов, функция которых, в первую очередь, связана с процессами распада генетического аппарата в эукариотических клетках (Дин, 1981). Однако некоторыми авторами было показано, что кислые ДНКазы также могут присутствовать в ядрах клеток (Slor, 1973; Barry, Eastman, 1993; Anzai et al., 1995). Другие авторы обнаружили, что кислые металлонезависимые эндонуклеазы под действием апоптотических импульсов транслоцируются из цитолитических компартментов в ядро клетки. При этом образование активной формы ДНКаз может происходить либо в результате посттрансляционной модификации, вызванной закислением внутриклеточной среды, либо протеолитического гидролиза ферментов сериновыми протеазами (Torriglia et al., 1995).
Предполагается еще одна важная функция кислых ДНКаз II в защите от чужеродного генетического материала и в утилизации ДНК для собственных нужд клетки (Mishra, 2002). Так, еще в 1971 году было показано, что способность ДНКазы II гидролизовать чужеродную ДНК по одноударному механизму приводит к резкому снижению инфекционности (Bernardi, 1971). Танума и Шиокава полагают, что основной функцией DLAD - кислой ДНКазы II печени крыс, является защита генетического материала клетки от интеркаляции чужеродной ДНК, путем ее элиминации (Tanuma, Shiokawa, 1999; Shiokawa, Tanuma, 1999). Другими авторами было показано, что в клетках нематоды Caenorhabditis elegans кислая ДНКаза NUC-1 расщепляет ДНК бактерий, поступающих с пищей (Wu et а!., 2000).
Молекулярная масса и субъединичность. Молекулярная масса большинства металлозависимых ДНКаз, выделенных из различных источников, как правило, находится в пределах 25-57 кДа. Так, например, Са, Мп- зависимая нуклеаза, выделенная из тимуса человека, имеет молекулярную массу равную 29 кДа (Никонова и др., 1998), Са, Mg-зависимая ДНКаза гепатопакреаса краба - 45 кДа (Мензорова и др., 1993), ДНКаза лимфоцитов селезенки - 57 кДа (Соколова и др., 1988). В то же время ДНКаза из апоптотических тамоцитов крысы NUC18 имеет меньшую молекулярную массу равную 18 кДа (Montague et al., 1994). ДНКаза клеток гепатомы (карциномы печени) крыс и ДНКаза NUC70 гематопоэтических клеток человека имеют молекулярную массу, превышающую указанный предел, и составляет 97 и 70 кДа соответственно (Pandey et al., 1997; Urbano et al., 1998). В грубых экстрактах тамоцитов крысы были обнаружены две ДНКазы с массами 25 и 260 кДа (Hughes et ai., 1998). Все известные в настоящее время щелочные ДНКазы являются мономерными белками.
Изоэлектричекие точки и изоформы. Изоэлектрическая точка фермента является объективным показателем общего заряда белковой молекулы. Большинство исследованных металлозависимых ДНКаз являются кислыми белками с изоэлектрической точкой (pi) в области рН 4,0-5,5 (Anai et al., 1981; Nagae et al., 1982; Соколова и др., 1988; Chou, Liao, 1990; Мензорова и др., 1993; Yasuda et al., 1993; Takeshita et al., 1994; Pandey et al., 1997). ДНКаз с изоэлектрической точкой в щелочном интервале рН 8,5-9,5 известно гораздо меньше (Gaido, Cidlowski, 1991; Ribeiro, Carson, 1993; Enari et al., 1998).
Следует отметить закономерность в распределении молекулярных масс ферментов и величин их pi. Так, ферменты с молекулярной массой менее 30 кДа являются основными белками, в то время как кислые белки обладают молекулярной массой более указанной величины.
Одной из характерных особенностей щелочных ДНКаз типа панкреатической ДНКазы I, является существование в нескольких изоформах в интервале pi 3,5-4,5. Так, ДНКаза I из поджелудочной железы быка имеет 6 изоферментов. Формы А, В и С присутствуют в соотношении 4:1:1; формы D, Е и F являются минорными компонентами. Установлено, что они имеют pi равными соответственно 5,22; 4,96; 5,06; 4,78; 5,12 и 5,48 (Kim, Liao, 1982). Обнаружены 2 главных и 2 минорных компонента в препарате ДНКазы I из поджелудочной железы овцы и не менее трех компонентов в препарате ДНКазы I из проросшего ячменя; все изоформы имеют изоэлектрические точки в кислой области и являются гликопротеинами (Kim, Liao, 1982).
Первичная структураи активные центры кислых ДНКаз
В последние годы разными авторами были определены нуклеотидные последовательности кДНК ДНКазы П из печени и культуры клеток человека (Takeshita et al., 1998; Yasuda et al., 1998; Baker et al., 1998; Krieser, Eastman, 1998), селезенки свиньи (Wang et al., 1998) и печени крысы/мыши (Tanuma, Shiokawa, 1999; Shiokawa, Tanuma, 2001).
Для всех исследованных лизосомальных кислых ДНКаз характерно образование зрелой активной формы фермента в результате посттрансляционного протеолитического процессинга, в ходе которого происходит удаление сигнального N-концевого трансмембранного пептида (длиной 16-20 а.о.) от неактивного предшественника фермента (профермента). Кислая ДНКаза II селезенки свиньи, которая является а, 3 — гетеродимером, состоящим из двух а- и одной р- цепи, претерпевает более сложный процессинг, включающий, помимо удаления сигнального участка, гидролиз определенных сайтов на границах между полипептидными а— и р цепями предшественника белка (Wang et al., 1998). Таким образом, все три цепи ДНКазы II селезенки свиньи кодируются одним геном в последовательности al, р и а2.
Для кислых ДНКаз также характерно наличие в первичной структуре ферментов сайтов присоединения углеводных цепей. Так, в структуре аминокислотной последовательности ДНКазы II селезенки свиньи были обнаружены шесть участков присоединения углеводных частей: два в Р- цепи и четыре в а2- цепи (Wang et al., 1998). В структуре ДНКазы II клеток печени человека авторами также были определены четыре сайта N- гликозилирования в позициях 86,212, 266,290 (Yasuda et al., 1998). Показано, что удаление аминокислот в позициях 86 и 266 приводит к существенному снижению активности фермента. По мнению авторов, возможно, что присоединение углеводных цепей к этим двум участкам необходимо для активности фермента и его транспорта в лизосомы, таким образом, остатки маннозы-6-фосфат, входящие в состав углеводной цепи, могут являтся сигнальным элементом для транспортировки растворимых белков, каковым является ДНКаза II печени человека, в лизосомы (Yasuda et al., 1999). Другая группа авторов подтвердила наличие элементов, необходимых для формирования активного фермента, таких как сигнальный полипептид и сайты N-гликозилирования, у кислой ДНКазы II альфа культуры клеток человека (MacLea et al., 2002; MacLea et al., 2003). У кислой ДНКазы II DLAD, выделенной из печени крыс, было выявлено 8 потенциальных сайтов N-гликозилирования (Tanuma, Shiokawa, 1999; Shiokawa, Tanuma, 1999; Shiokawa, Tanuma, 2001).
Для образования активной формы кислых ДНКаз также необходимо присутствие остатков цистеина (Cys), образующих дисульфидные мостики, способствующие формированию активной конформации фермента. Так было показано, что ДНКаза II, выделенная из селезенки свиньи, содержит 8 цистеиновых остатков, образующих четыре дисульфидные связи: три в а2- цепи (Cys-124 - Cys-192, Cys-160 - Cys-240, Cys-201 - Cys-220) и один дисульфидный мостик, соединяющий между собой а- цепи (al, Cys-3 - а2, Cys-52) (Wang et al., 1998). У кислой ДНКазы II альфа культуры клеток человека были обнаружены 6 консервативных остатков цистеина, причем мутации хотя бы в одном из них приводят к полной потере ферментативной активности, что свидетельствует о необходимости дисульфидных мостиков для образования активного центра фермента (MacLea et al., 2002; MacLea et al., 2003).
Активный центр кислой ДНКазы селезенки свиньи образуют остатки Ala-184 - Тгр -Gly - Asp - His - Ser - Lys - Thr-191, расположенные в a2- цепи (Wang et al., 1998). Активный центр ДНКазы II человека образован аминокислотами Ser-291 — Тгр - Gly — Asp — His - Ser — Lys — Thr-298, что соответствует аминокислотным остаткам в активном центре ДНКазы свиньи. Активный центр кислой ДНКазы печени крысы - DLAD также расположен вокруг His, но смещен на 2 аминокислотных остатка (Shiokawa, Tanuma, 2001). Это указывает на высокую консервативность аминокислотных остатков в активных центрах исследованных ферментов (Wang et al., 1998; Baker et al., 1998; Yasuda et al., 1998; Krieser, Eastman, 1998; Shiokawa, Tanuma, 2001).
На основании первичной структуры фермента DLAD, т.е. наличия гидрофобного N-концевого сигнального пептида и 8 потенциальных сайтов N-гликозилирования, авторы предложили модель биосинтеза данного фермента (Shiokawa, Tanuma, 1999). Согласно этой модели, синтезированная de novo полнпептидная цепь белка транслоцируется в эндоплазматический ретикулум. После удаления сигнального пептида, зрелая DLAD гликозилируется и затем либо секретируется, либо транспортируется через аппарат Гольджи в соответствующий клеточный компартмент, а именно в лизосомы или пероксисомы.
Было показано, что ген ДНКазы II человека, исследуемой разными авторами, расположен в хромосоме 19р13.2 (Baker et al., 1998; Yasuda et al., 1998; Krieser, Eastman, 1998). Ген ДНКазы II бетта человека располагается в другой хромосоме 1р22.3 (Krieser et al., 2001). Ген ДНКазы II человека состоит из 6 экзонов, разделенных 5 нитронами. Сравнительный анализ аминокислотной последовательности выявил 73,4% гомологии с кислой ДНКазой селезенки свиньи (Shiokawa, Tanuma, 1998).
Особое положение среди кислых ДНКаз II занимает L-ДНКаза II, выделенная из селезенки свиньи группой Торриглиа (Torriglia et al., 1998). Авторами было показано, что данный фермент принадлежит к семейству серпинов или сериновых протеазных ингибиторов и образуется под действием апоптотических стимулов из лейкоцит эластазного ингибитора (LEI) в ходе посттрансляционной модификации. LEI в нативной форме обладает анти-протеазной активностью и ингибирует эластазу - сериновую протеазу, и катепсин G. В результате посттрансляционного процессинга белок утрачивает анти-лротеазную активность и приобретает свойства кислой ДНКазы II (Torriglia et al., 1998).
В клетках нематоды Caenorhabditis elegans была обнаружена кислая ДНКаза II, получившая название - NUC-1 (Wu et al., 2000). Авторы показали, что данная апоптотическая нуклеаза кодируется геном С07В5.5. Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей показал, что NUC-1 гомологична ДНКазе II человека (30%) и ДНКазе печени крысы - DLAD (16%). Некоторые участки первичной структуры белка консервативны и аналогичны таковым кислых ДНКаз млекопитающих: все белки имеют сигнальную последовательность на N-концевом участке и консервативный остаток His в активном центре (Wu et al., 2000).
Апоптоз представляет собой генетически запрограммированную форму гибели клеток (ПГК), посредством которой в организме выявляются и удаляются лишние или дефектные клетки как на уровне их пролиферации, дифференцировки, так и на уровне зрелых клеток в течение всей жизни организма (Kerr et al., 1972). Равновесие между пролиферацией и ПГК является определягощим фактором нормального развития организма. Нарушение контроля клеточной гибели в процессе роста и развития тканей и органов может привести к возникновению различных патологических состояний, таких как злокачественные новообразования, нарушения иммунного ответа, аномалии развития (Thompson, 1995; Nicholson, 1996).
Другой, патологической формой клеточной смерти, является некроз. Некроз характеризуется разрывом цитоплазматической и внутриклеточных мембран, что приводит к разрушению органелл, высвобождению лизосомальных ферментов и выходу содержимого цитоплазмы в межклеточное пространство и, как следствие, к развитию воспалительного процесса окружающих тканей (Jacobson et al., 1997).
Очистка ДНКаз из спермиев морского ежа
Определение молекулярной массы. Молекулярная масса Са, Mg-ДНКазы, С а, Мп-ДНКазы и К-ДНКазы, определенная методом гель-фильтрации на Superdex 75 HR, равна 63, 25 и 37 кДа соответственно (графические данные определения молекулярной массы не приведены).
Показано, что Са, Mg-ДНКаза спермиев морского ежа обладает достаточно большой молекулярной массой, превышающей таковую большинства известных щелочных ДНКаз, масса которых, как упоминалось в «Обзоре литературы», находится в пределах 25-57 кДа. Существуют только два металлозависимых фермента близких по молекулярной массе Са, Mg-ДНКазе, обнаруженной нами в спермиях морского ежа: Са, Mg- зависимая эндонуклеаза из лимфоцитов селезенки человека (57 кДа) (Соколова и др., 1988) и ДНКаза NUC70 гематопоэтических клеток человека (70 кДа) (Urbano et al., 1998), Основываясь на результатах электрофореза в ДДС-Ыа-ПААГ-ДНК, можно утверждать, что белковая молекула Са, Mg-ДНКазы спермиев представлена одной субъединицей, что подтверждает литературные данные о мономерном строении щелочных ДНКаз.
Са, Мп-ДНКаза сперматозоидов морского ежа обладает наименьшей молекулярной массой среди выделенных ферментов спермиев и ее можно сравнить с Са, Мп-зависимыми ДНКазами из тимусов крысы, теленка и человека - 22, 28 и 29 кДа соответственно (Никонова и др„ 1998).
Молекулярная масса, определенная для кислой ДНКазы спермиев морского ежа, совпадает с молекулярной массой ферментов, выделенных из яйцеклеток лосося Oncorhynchus tshawytscha (Yamamoto, 1971), слизистых оболочек желудка и шейки матки человека (Yamanaka et al., 1974), Эти ферменты состоят из двух субъединиц, а их молекулярная масса, определенная методом гель-фильтрации, находится в пределах 36-38 кДа (Yamanaka et al., 1974). Можно предположить, что К-ДНКаза спермиев также имеет субъединичную структуру по аналогии с вышеперечисленными ферментами. Кроме указанных кислых ДНКаз, также достаточно близкую молекулярную массу имеют кислая ДНКаза зрелых яйцеклеток морского ежа Strongylocentrotus intermedius 29 кДа (Сибирцев и др., 1985) и ДНКаза II нейтрофилов человека - 35 кДа (Gottlieb et al., 1995). рН-оптиіиум активности ферментов. Известно, что активность щелочных металлозависимых ДНКаз в значительной степени зависит как от природы ионов двухвалентных ионов, присутствующих в реакционной среде, так и от соотношения концентраций этих ионов. Поэтому определение рН-оптимума Са, Mg-ДНКазы спермиев проводили при оптимальном соотношении концентрации ионов Са2+ + Mgz+, так и в присутствии каждого иона по отдельности. Результаты, представленные на рис. 5, показывают, что Са, Mg-ДНКаза спермиев в оптимальных условиях (в присутствии 1 мМ СаОг и 5 мМ MgCh) проявляет максимальную активность с четко выраженным оптимумом при рН 7,5. При этом хорошо прослеживается зависимость рН-оптимума Са, Mg-ДНКазы спермиев от синергетического эффекта при одновременном присутствии двух ионов металлов Са2+ и Mg2+, т.к. только при выполнении данного условия активность фермента проявляется в четко выраженной области рН. В присутствии только ионов Са или Mg + фермент проявляет незначительную активность (менее 15%) в широкой области рН от 6,0 до 8,0 без выраженного максимума. Следует отметить, что в присутствии ионов Mn + фермент проявляет немного большую активность (30%), причем, рН-оптимум, как и при добавлении ионов Со2+ (20% активности), смещается в кислую область на одну единицу рН по сравнению с оптимальными условиями и становится менее выраженным. Таким образом, рН-оптимум Са, Mg-ДНКазы в значительной степени зависит от природы активирующих этот фермент двухвалентных катионов металлов (рис. 5).
Таким образом, Са, Mg-ДНКазу спермиев можно отнести к числу металлозависимых ДНКаз, рН-оптимум действия которых может изменяться в зависимости от природы двухвалентного металла, активирующего ферментативный катализ (Anai et al., 1981; Nagae et al., 1982; Krouder et al., 1982; Chou, Liao, 1990; Мензорова и др., 1993). Так, например, ферментативная активность Са, Mg-зависимой ДНКазы гепатопанкреаса креветки Solenocera melantho максимальна при совместном присутствии ионов Са2+ и Mg + в области рН 7,5. В присутствии ионов Mn + и Mg + рН-оптимум активности фермента смещается в область рН 7,0 и 6,5 соответственно. При этом активность ДНКазы заметно снижается относительно максимума при Са2+ + Mg2+ и становится равной 75 и 40% соответственно (Chou, Liao, 1990). Максимальная активность ферментов типа ДНКазы I из различных источников в присутствии ионов Со , Cd , Ni и Zn проявляется в области рН 6,0-7,5. Ионы Ва2+, Sr2+, Мп2+, Са24" и Са2+ + Mg2 вызывают максимальную скорость гидролиза ДНК ферментом в более щелочной области рН 7,5-9,0 (Junowicz, Spenser, 1973; Anai et al., 1981; Nagae et al., 1982). Активность Са, Mn-ДНКазы проявляется в широкой области рН от 6,5 до 9,5 с максимумом при рН 8,5 (рис. б). Аналогичную зависимость активности от рН проявляют Са, Mn-завнсимые ДНКазы из ядер клеток тимуса человека и крысы, активность которых отмечается в широком диапазоне рН от 6,0 до 8,5, но со слабо выраженным оптимумом при рН 8,0-8,5 (Никонова и др., 1998). В то время как Са, Mn-зависимая ДНКаза тимуса теленка имеет четко выраженный рН-оптимум при 8,0 (Никонова и др., 1998).
рН-оптимум К-ДНКазы спермиев, в отличие от металлозависимых ферментов спермиев, находится в достаточно узкой области рН от 4,7 до 6,0 с выраженным максимумом при 5,5 (рис. б). Такое значение рН-оптимума является типичным для кислых ДНКаз И, выделенных из разных источников, большинство из которых проявляют максимальную активность в кислой области при рН 5,0-5,5 (Liao et al., 1989; Yasuda et al., 1992; Torriglia et al., 1995; Нечаевский, Иванов, 1999; Сибирцев, Рассказов, 2000).
Специфичность К-ДНКазы из спермиев морского ежа
Таким образом, представленные результаты показывают, что из спермиев морского ежа нам удалось выделить три ДНКазы, отличающиеся по ферментативным и физико-химическим свойствам. Проведенный анализ физико-химических и ферментативных свойств Са, Mg-ДНКазы спермиев морского ежа, показал, что данный фермент обладает свойствами, отличающими его как от группы панкреатической ДНКазы I, так и группы классических ядерных Са , Mg -зависимых ДНКаз. В отличие от Са, Mg-ДНКазы из спермиев, ферменты, принадлежащие к группе панкреатической ДНКазы I локализованы в эндоплазматическом ретикулуме клеток секреторных органов, являются гликопротеинами с молекулярной массой 30-35 кДа, присутствуют в нескольких изоформах в интервале pi 3,5-4,5, и их активность ингибируется G-актином (Lacks, 1981; Krouder et аЦ 1982; Yasuda et al., 1993; Peitsch et al., 1993; Takeshita et al., 1994). В то же время Са, Mg-ДНКаза из спермиев нельзя отнести и к классической группе так называемых «Са2+, Mg2 -зависимых ДНКаз», обнаруженных в ядрах клеток различных тканей. ДНКазы этой группы ингибируются SH-реагентами, полиаминами (спермин и спермидин), но не ингибируются G-актином и являются основными белками с молекулярной массой 25—45 кДа (Hashida et al., 1982; Ribeiro, Carson, 1993; Никонова и др., 1998). Совокупность свойств Са, Mg-ДНКазы спермиев, таких как, локализация в ядре, резистентность к G-актину, ингибирование спермидином, но в то же время большая молекулярная масса, резистентность к N-этилмалеимиду и кислая область pi белка (по поведению на ДЭАЭ-целлюлозе), дает основание отнести этот фермент к пока немногочисленной подгруппе ядерных Са +, Mg;+-зависимых ДНКаз, выделенных из эмбрионов морского ежа S. intermedins (Мензорова, Рассказов, 1980), лимфоцитов селезенки человека (Соколова и др., 1988), гепатопанкреаса креветки и краба (Chou, Liao, 1990; Мензорова и др., 1993). Отличительными признаками ферментов этой подгруппы являются молекулярная масса в пределах 45-57 кДа, отсутствие ингибирования SH-реагентами и pi белка в кислой области рН. Так же следует отметить, что выделенная из спермиев морского ежа Са, Mg-ДНКаза по совокупности рассмотренных физико-химических и ферментативных свойств похожа на металлозависимые ДНКазы, принимающие участие в апоптотическом процессе в разных клетках. Полученные нами данные по ингибированию активности Са, Mg-ДНКазы низкими концентрациями ионов цинка, являются косвенным биохимическим признаком, который позволяет с большей уверенностью предполагать участие этого фермента в апоптотическом процессе (Ribeiro, Carson, 1993; Shiokawaet al., 19976; Yakovlev et al., 1999). Другим металлозависимым ферментом, выделенным из спермиев морского ежа 5. intermedius, является Са, Mn-ДНКаза, которая в значительной мере отличается от Са, Mg-ДНКазы спермиев по целому ряду свойств таких как: степень активации ионами Mg2+ или Мп+ в присутствии ионов Са+, степень ингибирования ионами Zn+, механизм расщепления двухцепочечной ДНК. Кроме этого, в отличие от Са, Mg-ДНКазы, Са, Мп-ДНКаза имеет значительно меньшую молекулярную массу и неактивна в природной морской воде.
Присутствие нескольких ДНКаз в клетке является распространенным явлением. Так, Никонова и др. (Никонова и др., 1998) обнаружили в клеточных ядрах тимоцитов крыс четыре эндонуклеазы, отличающихся по специфичности действия на нативную и денатурированную ДНК и на линкерные области нуклеосом хроматина. Баснакьян и др. (Баснакьян и др., 1989) выделили из клеточных ядер печени крыс четыре ДНКазы: две Са2+, М +-зависимые, Мп2+-зависимую и кислую ДНКазы. Авторы показали, что Са2+, Mg24"-зависимые ДНКазы отличаются по молекулярной массе и обладают разной степенью синергизма в присутствии ионов Са2+ и Mg2.
Несмотря на объективные трудности по выделению Са, Mn-ДНКазы в достаточном количестве, не позволившие определить влияние ингибиторов, все же полученные результаты позволяют предположить, что по ферментативным свойствам и молекулярной массе Са, Mn-ДНКаза спермиев наиболее близка к эндонуклеазам, выделенным из ядер клеток тимуса человека, теленка и крысы (Никонова и др., 1998). Эти ДНКазы, подобно ферменту из спермиев, проявляют максимальную активность в среде, в которой одновременно присутствуют ионы Са2+ и Мп2. Однако несмотря на то, что ионы Са2+ и Mg2+ активируют нуклеазы в гораздо меньшей степени (активность нуклеазы из тимуса теленка в этом случае снижается почти в 3 раза, а нуклеазы из тимуса крысы - в 2 раза), авторы, по традиции, отнесли эти ферменты к Са+, Mg+- зависимым ДНКазам. Исключение составляет лишь ДНКаза из клеток тимуса человека: для нее различия нуклеазной активности в среде, содержащей одновременно ионы Са2+ и Mg2+ либо Са2+ и Мп2+, оказались минимальными. В среде, где присутствуют ионы Са2+ или Mg + по отдельности, данные ферменты практически неактивны. Подобно Са, Мп-ДНКазе спермиев ДНКазы тимуса человека, теленка и крысы активны в широком диапазоне рН от 6,0 до 8,5, со слабо выраженным оптимумом при рН 8,0-8,5; добавление 100 мМ NaCl снижает активность этих эндонуклеаз на 70-80%. Значения молекулярных масс находятся в интервале 20-30 кДа (Никонова и др., 1998). Однако ДНКазы из хроматина клеток тимуса человека, теленка и крысы являются основными белками, в то время как Са, Мп 78
ДНКаза спермиев морского ежа является кислым белком. К сожалению, в большинстве работ, в которых исследовались Мп2+-зависимые ДНКазы (Бубнов и др., 1986; Low et al., 1987), нет данных по совместному влиянию ионов Са и Mn , несмотря на то, что Са играет существенную роль в важнейших регуляторных процессах клеточного метаболизма.
Единственная кислая ДНКаза, выделенная из спермиев, по большинству изученных свойств относится к широко распространенному типу кислых ДНКаз II. Основные отличия, которые отмечаются для данного типа ферментов, выделенных из различных источников, касаются молекулярной массы, субъединичности молекулы фермента, способа расщепления двухцепочечной ДНК и локализации фермента в клетке. Наиболее целесообразным представляется провести сравнительный анализ К-ДНКазы спермиев морского ежа с кислой ДНКазой, выделенной из сперматозоидов вьюна Misgurnus fossilis L. (Нечаевский, Иванов, 1999), т.к. это единственный представитель кислых ДНКаз, обнаруженный в половых клетках самцов как морских беспозвоночных, так и млекопитающих. Так, К-ДНКаза спермиев морского ежа обладает большей молекулярной массой, по сравнению с ДНКазой II сперматозоидов вьюна, масса которой составляет 30 кДа (Нечаевский, Иванов, 1999). В то же время оба фермента проявляют активность более 60% в узком диапазоне рН {от 5 до 5,7) и имеют резко выраженный рН-оптимум при 5,5. Ионы двухвалентных металлов оказывают ингибирующее влияние на сравниваемые ферменты, но в большей мере этот эффект проявляется при воздействии на кислую ДНКазу вьюна, активность которой в присутствии 5 мМ ионов Mg + снижается в 4 раза, тогда как активность К-ДНКазы спермиев только в 1,5 раза. Добавление хелатирующего агента ЭДТА, образующего комплексы с ионами металлов, активирует активность кислых ДНКаз спермиев вьюна и морского ежа. Значительное отличие обнаружено в воздействии ионной силы на активность ферментов. Так, К-ДНКаза морского ежа более чувствительна к присутствию NaCI и при концентрации 80 мМ, являющейся оптимальной для активности кислой ДНКазы вьюна, активность К-ДНКазы морского ежа снижается до 75%. В то же время одно ударный механизм действия характерен для кислых ДНКаз морского ежа и вьюна.
