Содержание к диссертации
ВВЕДЕНИЕ 5
Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 10
1.1 Биология морского ежа Strongylocentrotus intermedins 10
1.2. Особенности питания морского ежа& intermedins 12
1.2.1. Вещества бурых водорослей, усваиваемые морскими ежами 16
1.3. Биология бурой водоросли Laminariajaponica 18
1.3.1. Состав веществ бурых водорослей 20
1.4. Биотические взаимоотношения морских ежей и
бурых водорослей 27
1.5. Биохимические взаимоотношения макрофитов и морских
травоядных животных 32
1.5.1. Химическая защита водорослей от морских растительноядных
животных 33
Природные ингибиторы а-амилаз. Специфичность и биологическое действие 37
Влияние веществ синтезируемых водорослями на
пищеварительные и репродуктивные функции морских организмов 39
Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 42
Объекты исследований 42
Реагенты и субстраты 43
Основные аналитические методы 43
Получение экстрактов из L. japonica растворителями 45
Получение полисахаридов из L.japonica 45
Ферменты 46
Определение активности ферментов 46
Действие веществ L.japonica на 1,3-р-Б-глюканазу
морского ежа ....46
2.9. Изучение биохимических особенностей питания морского
ежа& intermedins ламинарией 47
2.10. Изучение пищевой привлекательности L. japonica
по отношению к морскому ежу 47
Методика инкубации эмбрионов морского ежа 48
Действие экстрактивных веществ из L. japonica
на жизнеспособнотсь эмбрионов S. intermedins 49
2.13. Оплодотворяющая способность спермы и оплодотворяемость
яйцеклеток морского ежа 59
2.14. Статистическая обработка результатов 50
Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 51
Действие веществ, выделенных из L. japonica, на 1,3-рМЭ-глюканазу-пищеварительный ферменте, intermedins 51
Влияние веществ из L. japonica на сперматозоиды, яйцеклетки
и эмбрионы морского ежа S. intermedins 63
Изменение состава экстрактивных веществ L. japonica в зависимости от стадии развития и времени хранения водоросли 70
Биохимические особенности питания морского ежа ламинарией. Вещества, усваиваемые S. intermedins из пластин
L. japonica 76
3.5. Выделение из слоевищ L. japonica ингибитора 1,3-0-0-
глюканазы морского ежа S. intermedins 83
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 89
ВЫВОДЫ 94
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 96
4 Благодарности.
Автор выражает глубокую признательность своим научным руководителям д.х.н. Т.Н. Звягинцевой и к.б.н., Т.Н Крупновой за бесценный опыт, переданный мне в процессе научных исследований, и чуткое наставничество.
Особую благодарность автор выражает всем сотрудникам лаборатории химии ферментов ТИБОХ ДВО РАН и лаборатории технического обеспечения заводских методов разведения гидробионтов ФГУП ТИНРО-центра поддержку, помощь в работе над диссертацией.
Введение к работе
Актуальность темы. В настоящее время многие страны, такие как Япония, Канада, Норвегия, США, активизировали исследования возможностей сохранения запасов морских ежей при постоянной их добыче. Интерес к морским ежам, и в частности к Strongylocentrotus intermedins вызван, прежде всего, уникальными свойствами их икры: сорбирующими, радиопротекторными, иммуностимулирующими.
Морской еж S. intermedins является основным консументом ламинариевых водорослей, в районах произрастания которых и отмечены его массовые поселения. В водах, где прессинг естественных хищников невелик, основным фактором, регулирующим развитие популяции ежа, являются пищевые ресурсы (т.е. запасы ламинариевых водорослей). Как известно, в морских экосистемах площади твердых субстратов ограничены, что часто является лимитирующим фактором для расселения гидробионтов с подвижной личиночной стадией или водорослей, размножающихся с помощью подвижных зооспор. В связи с этим представляет несомненный интерес изучение биотических взаимоотношений серого морского ежа и ламинарии японской для выяснения закономерностей их обитания на одних и тех же площадях.
Исследования трофических и репродуктивных взаимоотношений L. japonica и S. intermedins имеют как фундаментальный, так и прикладной интерес и необходимы для понимания поведения морского ежа в природе при питании на ламинариевых полях, а также, используя полученные новые знания, можно разработать методы подкормки ежа ламинарией. С другой стороны, интерес к этим исследованиям связан с поиском способов защиты марикультуры L. japonica от поедания ее ежом.
В водных биоценозах большую роль во взаимодействиях популяций играют биохимические влияния, реализующиеся через выделение в воду различных метаболитов. Несмотря на относительно большое количество литературных данных о химической защите
макрофитов от морских растительноядных животных, имеется мало сведений о механизме действия отдельно выделенных метаболитов, о том, на какие жизненно важные процессы они влияют (Еляков, Стоник, 1986; Усов, Чижов, 1988; Steinberg, Vanaltena, 1992).
Известно, что одним из основных механизмов действия токсичных веществ является ингибирование ферментативных процессов. Поэтому привлечение морских животных, поедающих водоросли, или защита от них может быть связана с индукцией синтеза веществ, подавляющих или активирующих ферменты пищеварительного тракта животных.
Сообщения о подобном способе защиты для морских животных отсутствуют, однако известно, что наземные растения защищаются от насекомых и травоядных животных, синтезируя ингибиторы амилаз или протеиназ (Whitaker, 1988; Suzuki et ai., 1993; Broadway, 1996; Yamagata et al., 1998; Girl, Kachole, 1998; Ono et al., 2001). Согласно литературным данным, основными пищеварительными ферментами у морских беспозвоночных, прежде всего, являются ламинариназы (l,3-(3-D-глюканазы) (Елякова, 1978; Сундукова, Елякова, 1989; Звягинцева, Сова и др., 1998).
Для изучения взаимодействия морского ежа S. intermedins и водоросли L. japonica мы использовали подход, известный для наземных организмов (Ishimoto, Kutimura, 1993; Wiegand et al., 1995; Vallee, 1996; Berre-Anton et al., 1997) и заключающийся в поиске среди веществ L. japonica эффекторов (активаторов или ингибиторов) 1,3-)3-В-глюканазы -пищеварительного фермента S. intermedins.
Несмотря на активный промысел S. intermedins и его спрос на внешнем рынке многие аспекты биологии морского ежа недостаточно изучены. Наши исследования закономерностей существования и межвидовых отношений морского ежа и ламинарии японской расширят представления о структуре и функционировании этого сообщества.
Цель исследования. Цель работы изучить биохимические основы биотических взаимоотношений серого морского ежа S. intermedins и бурой водоросли L. japonica.
Задачи исследования. Для достижения цели предстояло решить следующие задачи:
1. Исследовать действие экстрактивных веществ свежесобранной L.
japonica на различных стадиях развития (от проростков до разрушающегося
слоевища в конце ее жизненного цикла) и L. japonica, хранившейся на
берегу, на 1,3-Р-Б-глюканазу - основной пищеварительный фермент
морского ежа.
2. Изучить действие экстрактивных веществ L. japonica на
оплодотворяющую способность спермы, оплодотворяемость яйцеклеток и
продолжительность жизни развивающихся эмбрионов морского ежа S.
intermedins.
3. Изучить биохимические особенности питания морского ежа S.
intermedins ламинарией японской. Для этого провести сравнительный
химический анализ L. japonica до поедания ее ежом и экскрементов,
выделенных ежом после потребления ламинарии.
4. Изучить пищевую привлекательность L. japonica (свежесобранной и
разрушенной при хранении на берегу) для морского ежа, исследовав
изменения в составе веществ ламинарии в зависимости от возраста и в
процессе частичного разрушения талломов.
Защищаемые положения:
В процессе существования морской еж S. intermedins и бурая водоросль L. japonica выработали ряд приспособительных реакций на трофическом и репродуктивном уровнях, позволяющих выжить обоим видам.
Свежесобранная ламинария первого года жизни содержит вещества, ингибирующие основной фермент пищеварительного тракта морского ежа. В процессе разрушения слоевищ водоросли, при ее хранении на берегу, в них накапливаются вещества, активирующие как пищеварительный процесс, так и процесс оплодотворения морского ежа.
Научная новизна. Впервые показано, что совместное существование ламинарии японской и морского ежа S. intermedius в одном биоценозе обеспечивается различными реакциями организмов, происходящими на трофическом и репродуктивном уровнях. Впервые в L. japonica первого года жизни обнаружены вещества, ингибирующие фермент пищеварительного тракта морского ежа. Очевидно, поэтому молодая ламинария не поедается ежом. Вещества водно-этанольных экстрактов L. japonica второго года жизни и разрушенной при хранении на берегу водоросли, активируют пищеварительный фермент морского ежа. Действие этих же веществ на репродукцию S. intermedius аналогично. Вещества из водоросли первого года жизни являются наиболее токсичными по отношению к половым продуктам морского ежа, в процессе старения и разрушения L. japonica вещества, ингибирующие оплодотворение, исчезают. Установлено, что выделенный из L. japonica ингибитор пищеварительного фермента морского ежа является l,3;l,6-[3-D-глюкоолигосахаридом, связанным с полифенольной составляющей.
Практическая значимость работы. Результаты исследований совместного существования S. intermedius и L. japonica являются основой для разработки биотехнологии повышения товарных качеств морского ежа. Продукт, полученный после хранения L. japonica на берегу, является привлекательным пищевым источником для морского ежа, что подтверждается как натурными наблюдениями, так и биохимическими исследованиями, показавшими присутствие среди веществ разрушающейся L. japonica активатора пищеварительного фермента морского ежа.
Апробация работы. Основные положения диссертации представлены на XVIII Международном симпозиуме по морским водорослям, Норвегия, 2004; Международном симпозиуме PICES, Владивосток, 2005; Международном симпозиуме по морским водорослям стран Азиатско-Тихоокеанского региона, Бангкок, Таиланд, 2005; II Международной конференции "Морские прибрежные экосистемы: водоросли, беспозвоночные и продукты их переработки", Архангельск, 2005.
9
Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 работ.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения,
4 трех глав, заключения, выводов и списка литературы, содержащего 198
источников отечественных и иностранных авторов. Работа изложена на 116 страницах, содержит 12 таблиц, иллюстрирована 25 рисунками.
