Содержание к диссертации
Введение
I. Обзор литературы 10
1.1. Краткая характеристика гистонов 10
1.1.1. Принципы выделения гистонов 10
1.1.2. Выделение отдельных фракций гистонов 11
1.2. Первичная структура гистонов , 12
1.2.1. Гистон HI 12
1.2.2. Гистоны нуклеосомного кора 14
1.2.2.1. Гистон Н2В 14
1.2.2.2. Гистон Н2А 15
1.2.2.3. Гистон Н4 16
1.2.2.4. Гистон НЗ 17
1.3. Гистон-гистоновые и ДЩС-гистоновые взаимодействия 17
1.4. Варианты гистонов 20
1.4.1. Вариабельность гистона HI 20
1.4.2. Варианты гистонов нуклеосомного кора 21
1.5. Модификации гистонов 24
1.5.1. Постсинтетическое ацетилирование гистонов . 27
1.5.2. Ферменты ацетилирования 28
1.5.3. Влияние бутирата натрия на функционирование клеточного ядра 29
1.5.4. Обмен ацетильных групп в гистонах 30
1.5.5. Ацетилирование гистонов во время клеточного цикла 32
1.5.6. Ацетилирование гистонов во время транскрипции 35
1.6. Раннее эмбриональное развитие как модель исследования структурно-функциональных особенностей хроматина 37
1.6.1. Стадии развития 37
1.6.2. Клеточный цикл в развитии 38
1.6.3. Транскрипционная активность хроматина . 41
2. Материалы и методы 45
2.1. Выращивание зародышей , 45
2.2. Инкубация зародышей с радиоактивными предшественниками 46
2.3. Выделение ядер и хроматина 47
2.3.1. Зародыши морского ежа 47
2.3.2. Спермин 48
2.3.3. Целомоциты 48
2.4. Выделение кислоторастворимых белков хроматина . 49
2.5. Выделение фракций гистонов 49
2.6. Фракционирование гистонов морского ежа методом гелъфильтрации 50
2.7. Фракционирование гистонов морского ежа методом электрофореза в полиакриламидном геле 51
2.7.1. Катионная система электрофореза, содержащая мочевину 51
2.7.2. Катионная система электрофореза, содержащая мочевину и тритон Х-100 52
2.7.3. Анионная система электрофореза, содержащая ДЦС натрия 53
2.8. Фракционирование гистонов при помощи двухмерных систем электрофореза 54
2.9. Определение радиоактивности белков 56
2.9.1. Высушивание полиакриламидных гелей . 56
2.9.2. Определение радиоактивности белков методом флуорографии и авторадиографии 56
3. Результаты и их обсуждение 58
3.1. Подбор оптимальных условий для фракционирования гистонов морского ежа Strongylocentrotus droeba-chiensis методом электрофореза 58
3.2. Гетерогенность гистонов в раннем развитии морского ежа Strongylocentrotus droebachiensis 66
3.2.1. Гистон HI 67
3.2.2. Гистоны нуклеосомного кора 75
3.2.2.1. Биосинтез гистона Н2В в раннем развитии морского ежа Strongylocentrotus droebachiensis 75
3.2.2.2. Биосинтез гистона Н2А в раннем развитии морского ежа Strongylocentrotus droeba chiensis 81
3.2.3. Сравнение гистонов клеток зародышей и дифференцированных клеток морского ежа Strongylo centrotus droebachiensis 91
3.3. Ацетилирование гистонов в раннем развитии морскогоежа Strongylocentrotus droebachiensis 95
3.3.1. Ацетилирование гистонов в раннем развитии во время первичной дифференцировки клеток 96
3.3.2. Ацетилирование новосинтезируемых гистонов 102
3.3.3. Динамика ацетилирования новосинтезированных молекул гистонов в хроматине 109
Заключение 124
Вывода 127
Литература 129
- Гистон-гистоновые и ДЩС-гистоновые взаимодействия
- Транскрипционная активность хроматина
- Фракционирование гистонов при помощи двухмерных систем электрофореза
- Биосинтез гистона Н2В в раннем развитии морского ежа Strongylocentrotus droebachiensis
Введение к работе
Одной из наиболее важных, но до сих пор не решенных биологических проблем является взаимосвязь между структурной организацией ДНК в хроматине и ее генетической экспрессией. Хроматин в клетках разных организмов, несмотря на его структурную сложность и функциональную вариабельность, имеет всегда одинаковую субъединичную структуру. Элементарная хроматиновая нить представлена линейно-упорядоченным набором субъединиц - нуклеосом, соединенных линкерной ДНК. Каждая нуклеосома состоит из окта-мерного комплекса основных белков - гистонов (Н2А, Н2В, НЗ и Н4)х2, вокруг которого навивается отрезок ДНК постоянной длины (146 пар оснований). Линкерная ДНК связана с гистоном НЕ. Нук-леосомная структура нуклеопротеидной нити не препятствует процессам репликации и транскрипции, происходящим во время пролиферации и дифференциации клеток. Продвижение ДНК- и РНК-поли-мераз через нуклеосомы, по-видимому, связано с изменениями структуры последних. В свою очередь, специфические структурные превращения нуклеосом могут зависеть от особенностей образующих нуклеосомы гистонов и от их модификаций, например, ацети-лирования е-ш2 групп лизиновых остатков.
В последние годы показано, что в состав хроматина как эмбриональных, так и соматических клеток входят полипептидные варианты гистонов HI, Н2А и Н2В и, кроме того, все гистоны, за исключением гистона HI, подвергаются разной степени ацетилиро-вания. Эта гетерогенная популяция гистоновых молекул способна создать множество нуклеосом, различающихся по белковому составу и, возможно, структурному состоянию, от которого зависят функциональные особенности ДНК. Однако до сих пор остается не выясненным, существует ли корреляция между структурно-функциональным состоянием хроматина при переходе его в активное состояние при репликации и транскрипции и изменениями фракционного состава гетерогенного набора гистоновых молекул.
Для решения задачи, связанной с установлением такой корреляции, удобной биологической моделью является раннее эмбриональное развитие морского ежа, во время которого происходят изменения в структуре и генетической активности хроматина.
В настоящей работе были исследованы гетерогенность гистонов, их биосинтез и ацетилирование в раннем развитии зародышей морского ежа strongylocentrotus droebachiensis , а также сравнен состав гистонов эмбриональных, дифференцированных клеток и спермиев морского ежа с целью выявления возможной корреляции между составом и модификациями популяций гистоновых молекул и структурными и функциональными свойствами хроматина. Для этого необходимо было решить следующие задачи: I) выяснить оптимальные условия электрофореза для разделения полипептидных вариантов и апетилированных форм гистонов; 2) исследовать биосинтез и состав гистонов в период первичной дифференцировки клеток на стадиях бластулы (ранней, средней и мезенхимной), гаструлы и плутеуса; 3) сравнить состав гистонов эмбриональных клеток на стадии плутеуса, дифференцированных клеток целомической жидкости - целомитов и спермиев; 4) изучить особенности ацетилирова-ния гистонов во время дробления, когда при активном делении клеток почти полностью отсутствует транскрипция уникальных генов, и на стадиях бластулы-гаструлы, когда резко меняется транскрипционная активность хроматина; 5) исследовать обмен ацетильных групп в гистонах в раннем развитии морского ежа.
Диссертационная работа является заданием Всесоюзной науч- _ 8 - но-технической программы 0.74.05 (ее подэтапа 10.НЗ - "Изучить структурную организацию хромосом и хроматина") по теме "Изучение роли белков хроматина в процессах репродукции и дифферен-цировки клеток", N Гос. регистрации - 79022997.
Разработаны модификации методов электрофореза для разделения полипептидных вариантов гистонов морского ежа. Основа модификации состоит в изменении концентрации мочевины в зависимости от природы фракционируемых гистонов.
При детальном изучении состава и биосинтеза вариантов гистонов HI, Н2А, Н2В в раннем эмбриональном развитии морского ежа Strongylocentrotus droebachiensis установлено, что на каждой стадии развития синтезируется специфический набор вариантов этих гистонов, причем от стадии морулы до стадии гастру-лы имеет место постепенное переключение синтеза ранних вариантов гистонов HI, Н2А и Н2В на поздние варианты.
Впервые показано, что в хроматине целомитов морского ежа основную долю гистона HI составляет один из поздних вариантов этого белка и, наряду с ним, присутствует подобный гистону HI белок, сходный с НІ0. В клетках зародышей на всех исследованных стадиях развития (от морулы до плутеуса) и в дифференцированных клетках (целомиты и спермин) в хроматине морского ежа найден белок Z., по электрофоретическим параметрам имеющий черты сходства с гистоном Н2А.
Впервые выявлено, что процессы ацетилирования гистонов во время гаструляции происходят наиболее интенсивно. Однако качественный набор ацетилированных форм гистонов при гаструляции не изменяется. Установлено, что во время репликации новосинтезиро-ванный гистон Н4 присоединяется к ДНК в диацетильной форме, а другие гистоны - в немодифицированном виде. При дальнейшем аце-тилировании в хроматине гистон НЗ ацетилируется в 2-3 раза быс- трее гистона Н4. Ацетилирование гистона Н2В происходит медленнее, чем гистона Н4.
Разработанные модификации методов электрофореза для разделения полипептидных вариантов гистонов внедрены в Институте биохимии АН ЛитССР и Институте цитологии АН СССР.
Результаты работы используются при чтении лекций молекулярной генетики в разделе "Действие генома в развитии эукарио-тов" для студентов У курса Химического факультета Вильнюсского госуниверситета по специальности "биоорганическая химия".
На защиту выносятся следующие основные положения: в раннем развитии морского ежа Strongyiocentrotus droe-bachiensis существуют два периода переключения биосинтеза вариантов гистонов. Вследствие отсутствия их обмена после гаст-руляции гистоны HI, Н2А и Н2В представлены в хроматине в виде гетерогенных семейств полипептидов; в хроматине дифференцированных клеток целомической жидкости присутствует подобный гистону HI белок - HI0; в хроматине эмбриональных и дифференцированных клеток присутствует подобный гистону Н2А белок Z; гистоны Н2А, Н2В и НЗ присоединяются к ДНК в неацетили-рованном виде, а гистон Н4 - в диацетильной форме. Количество ацетильных групп, присоединяемых к гистонам в хроматине, в раннем развитии морского ежа не меняется; гистоны наиболее сильно ацетилируются в период дифференциации клеток, а оборот ацетильных групп в отдельных гистонах происходит с разной скоростью.
Гистон-гистоновые и ДЩС-гистоновые взаимодействия
Имеющаяся информация о первичной структуре гистонов, полученных из тканей разных видов, свидетельствует о меньшем эволюционном консерватизме аминокислотных последовательностей богатых лизином гистонов (HI, Н2В и Н2А), по сравнению с гистонами, обогащенными аргинином (Н4 и НЗ). При сравнительном исследовании гистонов из многочисленных позвоночных было показано, что подвижность гистонов Н2В и Н2А в катионной системе электрофореза варьирует в отличие от постоянных подвижностей гистонов НЗ и Н4 /205/.
Данные о полных или частичных аминокислотных последовательностях гистонов Н2В и Н2А подтверждают, что в процессе эволюции в этих гистонах некоторые аминокислоты замещаются (замены могут быть консервативного типа или не консервативного) или попросту утрачиваются /144,278/. 2/3 молекулы (центральная и С-концевая части) всех коровых гистонов Н2В, Н2А, НЗ и Н4 имеют аминокислотный состав, свойственный глобулярным белкам, а N-концевая часть заряжена положительно из-за присутствия аргинина и лизина.
Известно, что в образовании гистоновых комплексов (коровой частицы нуклеосомы) участвуют дентралыгае-глобулярные и С-концевые участки молекулы гистонов /80/. При образовании комплекса между гистонами НЗ и Н4 контактируют участки от 42 до 120 аминокислотного остатка гистона НЗ и от 32 до 102 - гистона Н4. При образовании комплекса между Н2А и Н2В взаимодействуют участки от 31 до 96 аминокислотного остатка гистона Н2А и от 35 до 114 аминокислотного остатка гистона Н2В /37,190/. Таким образом, N-концевые районы всех коровых гистонов и С-концевые районы гистонов Н2А и Н2В не нужны для формирования комплексов между гистонами.
Силы взаимосвязывания в комплексах между гистонами очень специфичны /110,173,260/ и определяются консервативностью глобулярных частей всех гистонов. Позиции, в которых обнаружены замены в глобулярной части гистонов, по-видимому, находятся на поверхности октамера и не участвуют в образовании комплексов между гистонами Д82/. В настоящее время остается непонятным в чем смысл высокой консервативности N-концевых участков гистонов НЗ и Н4 /261/.
Остатки лизина и аргинина, находящиеся на поверхности глобулярной части белкового комплекса ( 2/НЗ, Н4, Н2В, Н2А/) связываются с 1,75 витка суперскрученной ДИК (146 пар оснований), образуя нуклеосому Д59/. С- и N-ХВОСТЫ в образовании структуры этого комплекса играют, видимо, незначительную роль, оставаясь на поверхности в частично свободном состоянии /80/. По некоторым данным /183/ предполагается, что N-концевые части гистонов могут участвовать в связях между соединенными коровы-ми частицами, стабилизируя следующий уровень скручивания ДНК в хроматине.
Гистон HI, по-видимому, участвует при упаковке коровых частиц в более сложную структуру хроматина. Мирзабеков и др. /33/ предполагают, что глобулярная часть молекулы Щ, имеющая консервативный характер, взаимодействует с обоими концами нук-леосомной ДНК. Ряд авторов, используя сшивание белков бифункциональными реагентами, показали, что глобулярная часть гистона HI тесно контактирует с гистонами НЗ, Н2А и убиквитинированным Н2А /5,41,42,44,128,225/. Бесструктурные N- и С-концы молекулы HI связываются с участками нуклеосомной ДНК, свободными от контактов с коровыми гистонами /33/.
При помощи различных методов фракционирования гистонов было показано, что существует пять основных фракций этих белков. Данные, полученные при тщательном электрофоретическом исследовании, а также при изучении первичной структуры, показали, что в пределах одной фракции гистонов в клетках одного организма могут встречаться семейства молекул, аминокислотные последовательности которых отличаются в некоторых участках. Такие молекулы были названы вариантами /278/. Как было отмечено выше, первичная структура гистонов НЗ и Н4 в эволюции изменяется незначительно (в основном обнаружены точечные мутации или делеции консервативного типа), а С- и N-концевые части молекул гистонов HI, Н2В и Н2А подверглись значительному изменению в эволюции.
Богатый лизином гистон HI отличается большой вариабельностью как в филогенезе /6,7,205,259/, так и в онтогенезе /28, 79,93,94,107,132,226,228,229,245/. На N- и С-концах молекулы HI образовались повторы некоторых аминокислот /49,278/. В ряде случаев показано, что изменение компактности хроматина сопровождается изменением субфракционного состава гистона ЕЕ. В процессе оплодотворения яйцеклеток морского ежа гистон HI спермиев меняется на эмбриональный вариант, характерный для стадий деления дробления -cs-, что сопровождается уменьшением компактности хроматина в мужском пронуклеусе после репликации ДНК Д31,215,239/.
Транскрипционная активность хроматина
В ходе оогенеза синтез всех РНК скоординирован так, чтобы белок-синтезирущий аппарат обеспечивал синтез белков не только в оопите, но и в значительный период эмбрионального развития, материнские мРНК у морских ежей синтезируются в конце оогенеза, активируются в процессе оплодотворения и используются для синтеза белков, начиная с первых делений дробления. Следовательно, материнские матрицы используются для синтеза белков, необходимых для раннего развития Д36/.
Развитие эмбрионов морского ежа представляет собой уникальную систему для изучения синтеза ДЩ-подобной РНК (дРНК), так как этого рода РНК составляет предоминирующий класс ШК, синтезируемый во время ранних стадий развития.
Во время ранних стадий деления дробления морского ежа уровень синтеза РНК в ядре незначителен /118,224,289/, однако увеличивается после третьего деления дробления /179,290/, достигает максимума на стадии 64-128 бластомеров и впоследствии постепенно уменьшается Д79/. Более 90 % вновь синтезированных РНК на стадиях деления дробления тождественны РНК яйцеклетки, локализированы в ядрах и скоро разрушаются /29,30,154/. Однако некоторые вновь синтезированные РНК переносятся в цитоплазму и комплексируются с белками, образуя информосомы /142, 262/ и полисомы /153,224/. Хотя во время первых делений дробления происходит преимущественная транскрипция повторяющихся гистоновых генов, ее абсолютное значение невелико, и синтез гистонов в раннем развитии в основном (85 %) происходит на матрицах, запасенных в оогенезе /119,152,153/. Синтез рибосомалъных РНК во время ранних стаций дробления незначителен /97/.
Общая скорость синтеза дРНК у эмбрионов увеличивается в два раза между 64-128 бластомеров и плутеусом, однако из-за быстрой пролиферации клеток в эмбрионе скорость синтеза в расчете на ядро уменьшается в несколько раз /154/. Поэтому накопление дРНК в ядрах уменьшается примерно в 30 раз во время того же периода и тем самым означает определенное снижение синтеза дРНК во время эмбрионального развития /97/.
Из работ по гибридизации РНК с ДНК, в которых преимущественно учитывались повторяющиеся последовательности /109,286/, следует, что, начиная с оогенеза и кончая стадией бластулы, активно считываготся одни и те же последовательности, и лишь на более поздних стадиях развития включается транскрипция нового класса мРНК. Однако региональные отличия в составе мРНК обнаружены уже на стадии 16 бластомеров. До этой стадии виды мРНК, сравниваемые методом конкурентной гибридизации, одинаковы во всех бластомерах, а, начиная с 16 клеточной стадии, РНК, транскрибируемая в микромерах, начинает отличаться от FHK макро- и мезомеров Д88/. По данным Гросса Д4І/ на стадии мо-рулы значительная часть синтезирующейся РНК (70 %) отличается от ГНК, запасенных в оогенезе.
С помощью молекулярной гибридизации РНК с ДНК было показано /279/, что со стадии бластулы, и в особенности в период гаструляции, качественно изменяется состав популяции РНК, синтезирующихся на повторяющихся участках.ДНК. Обнаружено, что от стадии ранней бластулы морского ежа до позднего органогенеза уменьшается относительное содержание РНК, синтезированной на повторяющихся последовательностях ДНК /279/. Около половины всей FHK в клетках зародышей морского ежа на стадии бластулы синтезируется на повторах, а на стадии гаструлы доля таких молекул в популяции РНК уменьшается и составляет 30 % /280/. Следовательно, между бластулой и гаструлой происходит переключение транскрипции на качественно другие, уникальные гены. Молекулы мРНК, синтезированные на повторяющихся участках ДНК, преимущественно переносятся в цитоплазму на полирибосомы во время стадии бластулы и значительную часть этих мРНК (60 %) Д94/ составляют мРНК гистонов. Имея в виду, что повторяющихся последовательностей у морского ежа мало, т.е. 20 % от всей ДНК /112,180/, интересны те опыты, которые проведены по изучению транскрипции с уникальных участков ШК. Опыты по гибридизации РНК с уникальной ДНК показали, что доля РНК-копий уникальных нуклеотидных последовательностей ДНК увеличивается от 44 % на стадии бластулы до 64 % на стадии гаструлы Д2/.
В опытах Вольфсона и Воробьева /280/ был исследован выход РНК из ядра в цитоплазму. Установлено, что на стадии бластулы при переносе РНК от места транскрипции к месту трансляции происходят значительные изменения, заключающиеся в увеличении доли повторяющихся последовательностей в составе популяции транспортируемых в цитоплазму РНК. Также было показано, что в клетках зародышей синтезируются две фракции РНК - одна, остающаяся в ядре и мало меняющаяся в ходе развития (Н-РНК - гетерогенная ядерная РНК), и вторая (собственно мРНК), выходящая в цитоплазму, состав которой значительно изменяется от стадии к стадии. Объем информации структурных генов, заключенный в РНК оо-цита, достаточен для обеспечения развития от оогенеза до актив 7 но питающейся личинки и она составляет 37x10 нуклеотидов или 20-30 тысяч генов. Из этих генов часть служит для обеспечения собственных потребностей клеток Д8Г/.
Фракционирование гистонов при помощи двухмерных систем электрофореза
В катионной системе электрофореза в присутствии мочевины общий гистон разделяется на 5 основных фракций /206/. В этой системе электрофореза подвижность гистонов зависит от их заряда. Шло показано /205,206/, что подвижность гистонов Н4 и НЗ, выделенных из клеток животных и растений, в катионной системе электрофореза постоянна, однако подвижность отдельных фракций других гистонов, выделенных из зобной железы теленка, зависит от концентрации мочевины в геле. Особенно чувствительны к изменениям концентрации мочевины в геле богатые лизином гистоны Н2А и Н2В. При одинаковой концентрации мочевины в геле (2,5 М и 6,25 М) подвижность гистонов Н2А и Н2В, выделенных из клеток зобной железы теленка, проростков гороха, эритроцитов птиц, лягушки, рыб, различается /207/.
Целью нашей работы на первом этапе исследований было изучение микрогетерогенности гистонов (варианты гистонов и их апетилирование) в раннем эмбриогенезе морского ежа strongyio-centrotus droebachiensis . Поэтому в первую очередь мы поставили перед собой задачу определить оптимальные условия электрофореза для анализа фракционного состава гистонов морского ежа.
На рис. I представлена картина двухмерного электрофореза гистонов морского ежа, разделенных в катионной системе электрофореза, рН 2,9, в отсутствие мочевины и при конпентрапии мочевины 8MB первом направлении и в присутствии додецилсульфа-та натрия (ДЦС-іга), рН 8,89 во втором направлении, где гистоны распределяются по молекулярной массе. Видно, что подвижность гистонов НЗ и Н4 в отсутствие мочевины в геле первого направления (рис. ІА) и в присутствии 8 М мочевины (рис. ІБ) постоянна, в то время как подвижность гистона Н2А в присутствии 8 М мочевины в геле первого направления заметно уменьшается, а подвижность гистонов Н2В и НІ - увеличивается. Электрофоретичес-кая подвижность гистона Н2А в отсутствие мочевины в геле первого направления (рис. ІА) выше, а в присутствии 8 М мочевины (рис. ІБ) - ниже, чем гистона Н2В.
Подвижность субфракций гистона НІ при увеличении концентрации мочевины увеличивается не одинаково (на рис. ІБ показано стрелками). Более детально зависимость подвижности субфракций гистона НІ от присутствия мочевины показана на рис 2. Подвижность субфракций гистона НІ с более высокой молекулярной массой (субфракции 5-я и 6-я на рис. 2) больше зависит от концентрации мочевины, чем субфракций с несколько меньшей молекулярной массой (в состав которых, как видно из рис. 2, входят субфракции 1-я, 2-я, 3-я и 4-я). В присутствии 8 М мочевины в геле первого направления электрофоретическая подвижность 6-ой субфракции увеличивается и становится больше 5-ой субфракции. Как видно из рис. ІБ, электрофоретическая подвижность гистона Н2А в присутствии 8 М мочевины в геле первого направления уменьшается быстрее, чем увеличивается электрофоретическая подвижность гистона Н2В, что изображено стрелками. В обоих случаях в отсутствие мочевины и при 8 М мочевины в геле первого направления (рис. ІА и ІБ) субфракции Н2А и Н2В перекрываются и разделить их, применяя двухмерный электрофорез в присутствии ДЦС-ка во втором направлении, не удается, так как молекулярная масса обоих гистонов очень близка и приблизительно равна 14000 дальтон.
Для изучения субфракционного состава этих двух гистонов мы применяли двухмерный электрофорез в катионной системе электрофореза: 0,9 М уксусная кислота в отсутствие мочевины (У) или в присутствии 8 М мочевины (УМ) в геле первого направления и 0,9 М уксусная кислота, 8 М мочевина , 6 мМ тритон Х-100 (УМТ) в геле второго направления. В присутствии неионного детергента тритона Х-100 (изооктил$еноксиполиэтоксиэтанола) в геле катионной системы электрофореза образуются незаряженные мицеллы, которые имеют неодинаковое сродство к каждому гистоно-вому варианту. В работе Звейдлера показано, что сродство тритона Х-100 к каждому гистоновому варианту зависит от соотношения тритона Х-100 и мочевины в геле катионной системы электрофореза /307/.
В применяемой нами системе электрофореза второго направления (УМТ) в основном только гистон Н2А связывается с тритоном Х-100 и, двигаясь медленнее остальных /124,308/, не перекрывается с гистоном Н2В. Так как гистоны HI, НЗ, Н2В и Н4 в этих условиях электрофореза не связываются с тритоном Х-100, они имеют такую же подвижность, как и в системе (УМ) и расположены на диагонале. Из электрофореграмм, представленных на рис. 3, следует, что гистон Н2А на стадии бластулы состоит из нескольких вариантов, различающихся не только по заряду, но и по сродству к тритону Х-100. Прямоугольниками показана площадь, которую занимают варианты гистона Н2А среди других гистонов: рис. ЗА - в отсутствие мочевины в геле первого направления, рис. ЗБ - в присутствии 8 М мочевины.
Биосинтез гистона Н2В в раннем развитии морского ежа Strongylocentrotus droebachiensis
Из этих результатов можно предположить, что в клетках це-ломической жидкости - целомоцитах гистон НІ в основном представлен субфракпиями 5-ой и 6-ой, причем количество 5-ой субфракции доминирует и, как видно из рис. 6в, молекулярная масса 5-ой субфракпии больше чем 6-ой. Кроме того, как видно из рис. 6А,Б, в дифференциованных целомоцитах появляется гистон HI0, подобный белку семейства HI и свойственный клеткам, не проходящим репликации /68/. В других опытах было показано, что синтез этой субфракции начинается уже на стадии плутеуса (рис.ІОв).
При изучении гетерогенности и биосинтеза гистона НІ в электрофоретической системе (УМ) в присутствии 2,5 М мочевины было показано, что у разных видов морских ежей подвижность субфракций гистона НІ на определенных стадиях развития не одинакова и, по-видимому, зависит от вида морских ежей. Например, гистон НІ морского ежа Arbacia punctulata на стадии 256 блас-томеров представлен одной субфракцией /228/, на стадии бластулы (вылупление) - двумя полосами /93,228/. Меченый предшественник включается в обе субфракции, однако на стадии бластулы появляющаяся субфракция отличается меньшей электрофоретической подвижностью. Руиз-Каррилло и др. установили, что на стадии бластулы (морской еж Arbacia lixula ) субфракция гистона HI с меньшей электрофоретической подвижностью является фосфорилиро-ванной /229/.
Другие авторы, изучая биосинтез гистона HI морских ежей Strongylocentrotus purpuratus Д32/ и Lytechinus pictus /228/ нашли, что появляющаяся на стадии гаструлы вторая субфракция отличается большей электрофоретической подвижностью.
Гистон HI морского ежа Strongylocentrotus droebachiensis в электрофоретической системе (УМ) в присутствии 1,5 М мочеви -та ны на стадии бластулы и мезенхимной бластулы представлен двумя субфракциями, а на стадии гаструлы - тремя /107/, причем третья субфракция гистона HI обладает меньшей электрофоретической подвижностью по сравнению с первыми двумя на стадии бластулы и мезенхимной бластулы.
Применяя электрофорез в присутствии ДЦС-натрия ряду авторов /26,28,228/ удалось показать, что появляющиеся на более поздних стадиях развития оубфракции гистона HI отличаются более высокой молекулярной массой, чем на ранних стадиях. Изменение субфракций гистона НІ по молекулярной массе происходит уже на стадии 16 бластомеров /245/. Субфракция с более высокой молекулярной массой на стадии 16 бластомеров синтезируется в микромерах уже не с материнских, а с собственных гистоновых мРНК зародыша.
В подобранных нами условиях катионной системы электрофореза в отсутствие мочевины гистон HI морского ежа strongylocenrotus droebachiensis на стадии средней бластулы впервые удалось разделить на четыре субфракции. Две из них - 1-ая и 2-ая являются основными, а 3-я и 4-ая - минорными субфракциями. На стадии плутеуса гистон HI состоит из шести субфракций, однако синтез гистона НІ на стадии плутеуса происходит только за счет субфракций 5-ой и 6-ой. Из полученных нами результатов следует, что субфракции 5-ая и 6-ая отличаются от ранних четырех субфракций более высокой молекулярной массой, что соответствует данным других авторов /26,28,228/.
При повышении концентрации мочевины электрофоретическая подвижность BGex субфракций, хотя и в разной степени, увеличивается. Субфракции 3-я, 4-ая, 5-ая, 6-ая в геле с 8 М мочеви - 74 ной достигают электрофоретической подвижности субфракций 1-ой, 2-ой и перекрываются с ними. При этом 5-ая и 6-ая субфракции меняются местами, в то время как расположение 1-ой и 2-ой суб-фракпий остается тем же самым. Зависящая от концентрации мочевины инверсия электрофоретических субфракций 5-ой и 6-ой указывает на то, что субфракция 6-ая не является фосфоршшрован-ной формой субфракции 5-ой. Кроме того, из данных второго направления видно, что 5-ая и 6-ая субфракции, как и 3-я с 4-ой отличаются между собой молекулярной массой (рис. 2).
Таким образом, 5-ая и 6-ая субфракции гистона HI, появляющиеся на более поздних стадиях развития морского ежа y-locentrotus droebachiensis и отличающиеся от ранних субфракций более высокой молекулярной массой, представляют собой полипептидные варианты гистона HI, а 5-ая субфракция не является фосфорилированной формой субфракции 6-ой. Это предположение совпадает с результатами Кедес и др., в работе которых показано, что со стадии мезенхимной бластулы в геноме морского ежаylocentrotus purpuratus начинают работать два новых класса мРНК, ответственных за синтез /2» и $ вариантов HI /66/.
В дифференцированных клетках - целомоцитах гистон НІ в основном состоит из 5-ой и 6-ой субфракций. При этом количество 5-ой субфракции, отличающейся более высокой молекулярной массой, чем субфракция 6-ая, доминирует. В составе хроматина целомоцитов обнаружен другой богатый лизином гистон (HI0), который по количеству достигает уровня других гистонов. Накопление гистона HI0 свойственно клеткам, не проходящим репликации и находящимся в Q фазе клеточного цикла /68/.
По-видимому, в развитии морского ежа strongylocentrotus droebachiensis в хроматин включаются новые полипептидные ва - 75 рианты гистона HI, отличающиеся повышенной молекулярной массой. Биосинтез новых вариантов гистона HI с более высокой молекулярной массой происходит на том этапе развития, когда начинает действовать собственный геном эмбриона, когда структура хроматина становится более конденсированной, общий уровень репликации ДНК на эмбрион уменьшается /2/ и происходит переключение транскрипции РНК от повторяющихся последовательностей на уникальные гены /279/. Появляющиеся полипептидные варианты гистона HI, отличающиеся повышенной молекулярной массой, а также HI0, свойственный не проходящим репликации клеткам, по-видимому способствуют компактизаиии структуры хроматина.
