Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Проблема гетерогенности бактериальных популяций и электроповерхностные свойства клеток бактерий (обзор литературы)
1.1. Гетерогенность бактериальных популяций 9
1.2. Электроповерхностные свойства клеток бактерий и методы их измерения 17
1.3. Приборы и камеры для микроэлектрофореза клеток бактерий 29
1.4. Заключение 39
Глава II. Разработка методов и прецизионных средств измерения дзета-потенциала клеток бактерий (собственные исследования)
2.1. Разработка методов измерения дзета-потенциала клеток бактерий 42
2.2. Метрологические аспекты средств измерения дзета-потенциала клеток бактерий амшштудно-частотным методом 60
2.3. Конструкторские разработки средств измерения дзета-потенциала клеток бактерий
амплитудно-частотным методом 72
Глава III. Исследование электроповерхностной гетерогенности популяций эшерихий, шигелл и сал-монелл методом измерения дзета-потенциала клеток
3.1. Понятие электроповерхностной гетерогенности популяций 100
3.2. Электроповерхностная гетерогенность 18-часовых культур S-R форм S.minnesota 116
3.3. Электроповерхностная гетерогенность 18-часовых культур S-R форм S.ftexnezi 127
3.4. Эяектроповерхностная гетерогенность 18-часовых культур штаммов шигелл, выделенных от больных дизентерией 136
3.5. Измерение электроповерхностной гетерогенности штаммов S.ftexnezi, Ssonnei , выделенннх от больных в процессе лечения 150
3.6. Электроповерхностная гетерогенность и общепринятые методы выявления S-R форм шигелл 155
Глава ІV. Динамика электроповерхностной гетерогенности на разных стадиях развития периодической культуры
4.1. Разработка культиватора для выращивания бактерий с целью исследования динамики электроповерхностной гетерогенности популяции 162
4.2. Динамика электроповерхностной гетерогенности &coti-Mi7 в периодической культуре 180
Глава V. Обсуждение полученных результатов и заключение 202
Выводы 212
Список основной литературы 214
- Гетерогенность бактериальных популяций
- Разработка методов измерения дзета-потенциала клеток бактерий
- Понятие электроповерхностной гетерогенности популяций
- Разработка культиватора для выращивания бактерий с целью исследования динамики электроповерхностной гетерогенности популяции
- Обсуждение полученных результатов и заключение
Введение к работе
Большое значение микробиологии и ее новейшего бурно развивающегося раздела - биотехнологии как в промышленности, так и в биологии и медицине, послужило основанием для принятия ЦК КПСС и Совета Министров СССР Постановления о дальнейшем развитии физико-химической биологии и биотехнологии, использовании их достижений во всех отраслях народного хозяйства.
Основу микробиологической технологии составляет культивирование бактериальных культур, селекционируемых и эксплуатируемых для различных целей, полезных человеку [ймшенецкий А.А., 1961] .
АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ
Со времен Луи Пастера укрепились представления о культуре бактерий как об однообразном (гомогенном) сообществе сходных по свойствам клеток. Именно на основе представлений гомогенности культуры бактерий были разработаны методы непрерывного культивирования, имеющие ряд преимуществ в лабораторных и промышленных условиях [Иерусалимский Н.Д., 1963,1966, Работнова И.Л., 1972, Ддано-ваЛ.Е., 1974, honodl , 1942, 1949, 1950, Put S.J., I975J. Современное развитие микробиологической технологии немыслимо без создания и использования техники непрерывного культивирования, позволяющей не только промышленное получение продуцентов и биомассы, но и проведение экспериментальных исследований в теоретическом и прикладном аспекте развития общей микробиологии [Работнова ИД., 1977].
Однако, при длительном культивировании часто наблюдаются "явления вырождения "культурных" штаммов, связанные с неизученными популяпионными сдвигами, приводящие к резкому снижению продуктив- ности микробиологических процессов" [їїечуркин Н.С., 1978]. Поэтому закономерно возникновение и развитие популяционной микробиологии [їїечуркин Н.С., 1978] с четким обоснованием понятий и методов количественного анализа развития популяции микробов. Одним из важнейших разделов популяционной микробиологии является учение о гетерогенности по половым, возрастным и пространственным структурам развивающейся популяции бактерий. "Изучение динамики поведения микробных популяций с учетом гетерогенности (на популя-ционном уровне) является одной из наиболее актуальных общебиологических задач" [И.Н.Елохина, Г.А.Угодчиков, 1980].
Однако, развитие этого направления существенно тормозится отсутствием надежных методов оценки гетерогенности популяции по различным параметрам. Из всех предложенных критериев гетерогенности, на наш взгляд, наиболее существенным в плане качественной и количественной информативности является электроповерхностная характеристика бактерий как интегральный показатель особенностей взаимодействия поверхности бактериальных клеток со средой обитания через двойной электрический слой. По изменениям электроповерхностных параметров бактерий (дзета-потенциала, плотности электрического заряда, электрического дипольного момента, изоэлектриче-ских характеристик и т.д.) определяется характер химической реакции или направление изменений поверхностных структур оболочки клеток [Марков К.И., 1965, Толстой Н.А. и др., 1966, іузев B.C., Звягинцев Д.С, 1971, 1973, 1979, Супрун Е.А. и др. 1980, Аболина Т.А. 1980, ГлобаЛ.И., 1981, Rbzamson И. Я. , 1942, flbzamson Н.Я., Моцег L., Согіп М . » 1942] или других микрообъектов [ Shaw IN., 1969].
Кроме того, электроповерхностные свойства бактерий изучаются с феноменологической позиции, как дополнительная информация к биологическим характеристикам популяций микроорганизмов с определением их взаимокорреляционных закономерностей [Петросов Б.Б., 1965, Белозерова А,В., 1971, Голубев О.А., 1972, Зинин-Бермес Н.Н. и др., 1974, Алеутская Л.К,, 1975, Qbzamson Н.Я., 1934, BzintonC.C, Louffez М.Я., 1959, Hazzis 10., 1956, HazzisJ.O., KdneR. П., 1956]. Электроповерхностные свойства бактерий используются в практике концентрирования, фракционирования и типирования клеток при решении различных задач, поставленных в микробиологических исследованиях слабоконцентрированных суспензий микроорганизмов [Евтушенко А.Д., 1972, Мирошников А.И, и др. 1972, Евтушенко А.Д. и др,, 1976, Бойцов А.Г,, 1981]. При этом наблюдавшийся разброс измеряемой величины статистически усредняется и в таком виде используется для анализа полученных экспериментов. Такой подход непременно приводит к интерпретации поведения популяции, имеющей как бы однообразную гомогенную по электроповерхностным свойствам популяцию. А именно, каждая клетка, как особь популяции, имеет одну и ту же величину, равную средней.
Электроповерхностной характеристике бактерии, как особи популяции, присуща информация как индивидуума, так и принадлежности группе, поскольку оболочки клеток популяции состоят в целом из одного материала, но в разных структурных количественных отношениях, отличающихся в ряду клеток дуг от друга. На наш взгляд это единство информационных свойств в измеренной электроповерхностной характеристике клеток бактерий позволяет количественно охарактеризовать внутреннюю гетерогенность популяции по этим параметрам, которая ранее при усреднении не подмечалась экспериментаторами.
Исследование гетерогенности популяции в то же время требует тщательно подготовленной экспериментальной базы с точки зрения метрологии и прецизионности измерений такого наиболее важного параметра электроповерхностной характеристики популяции, как величина дзета-потенциала бактерий.
ЦЕЛЬ РАБОТЫ.
На основе разработки оптимального метода измерений дзета-потенциала клеток бактерий и сконструированного прецизионного прибора изучить возможности исследования динамической структуры электроповерхностной гетерогенности развивающихся популяций бактерий.
На представителях основных родов энтеробактерий - эшерихий, шигелл и салмонелл исследовать электроповерхностную гетерогенность периодических культур, дать оценку динамики гетерогенности, ее значимости в теории и практике микробиологии.
ЗД2ДЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ.
Выбрать и обосновать оптимальный метод измерения дзета-потенциала клеток бактерий.
Разработать конструкцию прибора на основе метрологического анализа погрешностей измерения дзета-потенциала клеток бактерий.
Оценить возможности разработанного прибора в исследовании гетерогенности бактериальных популяций по величине дзета-потенциала клеток.
Исследовать динамику электроповерхностной гетерогенности в периодических культурах эшерихий, шигелл и салмонелл и дать оценку обнаруженным явлениям.
НАУЧНО-ПРАКТЖЕСІШІ ЗНАЧИМОСТЬ.
Разработанный прецизионный прибор для измерения дзета-потенциала клеток амплитудно-частотным методом может быть внедрен в научные микробиологические лаборатории для исследования гетерогенности бактериальных популяций, в том числе при получении продуцентной биомассы современными методами культивирования.
Исследования электроповерхностной гетерогенности бактериальных популяций дизентерийных шигелл и салмонелл могут быть использованы для контроля изменения свойств возбудителя заболеваний и
8 выбора оптимальной стратегии и тактики лечения больных кишечными инфекциями.
ПОЛОЖЕНИЙ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ.
Разработан амплитудно-частотный метод и на его основе сконструирован и изготовлен прецизионный прибор для точного измерения дзета-потенциала клеток бактерий, позволивший обнаружить кластерность электроповерхностной гетерогенности бактериальных популяций. Изобретена и изготовлена микроэлектрофоретичеекая камера улучшенных эксплуатационных качеств, обеспечивающая высокую точность измерения дзета-потенциала клеток (авторское свидетельство & 441502 от 30.08.1974.)
Впервые обнаружена кластерность электроповерхностной гетерогенности бактериальных популяций эшерихий, шигелл и салмонелл, характеризующая структуру популяции как в стационарном состоянии, так и при культивировании на искусственных питательных средах. Установлено, что в лаг-фазе развития популяций происходит адаптационная смена кластеров, проявляющаяся в модуляции коэффициента электроповерхностной гетерогенности, а в экспоненциальной фазе доминирует адаптировавшийся кластер. Исследование клас-терности электроповерхностной гетерогенности может быть использовано для контроля качества микробной биомассы в промышленной микробиологии.
Впервые выявлены изменения электроповерхностной гетерогенности популяции шигелл в зависимости от особенностей клинического течения бактериальной дизентерии, заключающееся в том, что при лечении антибактериальными препаратами и бактериофагом доминирующим в популяции становится низкопотенциальный кластер, соответствующий S - форме шигелл. Обнаруженный феномен следует учитывать при выработке стратегии и тактики лечения больных.
Гетерогенность бактериальных популяций
"Под популяцией понимается совокупность особей определенного вида, в течение достаточно длительного времени (большого числа поколений) населяющих определенное пространство, внутри которого практически осуществляется та или иная степень панмиксии и нет заметных изоляционных барьеров, которая отделена от соседних таких же популяций той или иной степенью давления тех или иных форм изоляции" [Тимофеев-Ресовский Н.В., Яблоков А.В,, Глотов Н.В., 1973] . Вновь появляющаяся особь сразу же попадает в среду, характеризующуюся весьма сложными взаимодействиями многих факторов биологической, физической, физико-химической или иной природы. Разнообразие и сочетание этих факторов создает благоприятные или неблагоприятные условия для развития особи. Интенсивность влияния положительных или отрицательных воздействий в процессе смены поколений будет изменять численность как самой популяции, так и отдельных групп, ее составляющих. Отсюда законы воспроизведения особей, их рождаемость, выживаемость или смертность, характеризуемые понятием приспособляемости - удельной скоростью роста, являются теми определяющими моментами, которые приводят как к перестройке структуры популяции, так и к изменению ее общей численности. Именно поэтому при изучении развития популяции с различными целями главными ведущими количественными характеристиками следует считать численность популяции и ее структуру [Полуактов Р.А, и др., 1974].
Разработка методов измерения дзета-потенциала клеток бактерий
Точный оптический механизм микроскопа используется только в плане обеспечения меры длины (шкала окуляра), а секундомер, обладающий большими погрешностями, неоправданно используется в главной измерительной функции. Измерительная шкала с - потенциала в общепринятом методе нелинейная, обратно пропорциональна измеряемой величине, что не всегда удобно. Общепринятому методу свойственны еще недостатки, затрудняющие его использование на практике. К ним относятся:
1) весьма большая величина общей погрешности + 14$[Марков К.И,, 1965];
2) невозможность многократного повторного измерения дзета-потенциала единичного объекта с целью получения определенной достоверности;
3) наличие субъективных погрешностей, зависимость их от рефлекторных и психологических данных экспериментатора (выбираются самые быстрые) ;
4) значительная поляризация электродов;
5) ограничения в скорости измерений, инерционность.
Нами предлагается амплитудно-частотный (АЧ) метод измерения дзета-потенциала клеток бактерий
Сущность его заключается в том, что микроэлектрофорез производится в электрическом поле заданной низкой частоты, при этом амплитуда колебания микрообъекта, измеряемая по шкале окуляра микроскопа, прягло пропорциональна -потенциалу. Здесь более рационально распределены элементы средств измерения по функциональному соответствию, исходя из их квалиметрической ценности. В качестве первичного измерительно-преобразовательного механизма в АЧ методе используется микроскоп, обладающий повышенной точностью по сравнению с секундомером, выполняющим эту функцию в общепринятом методе. Низкочастотный (НЧ) генератор, который может быть изготовлен по необходимым параметрам (частота, напряжение) очень точным, выполняет функцию меры времени.
Таким образом, общая погрешность измерительного преобразования только за счет перераспределения мест преобразователей в схеме измерения существенно снижается, что делает АЧ метод перспективным для детальной разработки.
На рис. 2.1.а изображена схема измерения дзета-потенциала микрообъектов АЧ методом. Камера подключена к генератору низкой частоты. Микрообъект, рассматриваемый в камере под микроскопом, колеблется в такт смены полярности электрического поля прягло пропорционально амплитуде и частоте генерируемого биполярного напряжения, которое устанавливается на генераторе.
Понятие электроповерхностной гетерогенности популяций
С физической точки зрения любая бактериальная взвесь (в том числе и популяция) может рассматриваться как грубодисперсная равновесная гетерогенная (гетерофазная) система, т.е. неоднородный коллоидный раствор, где следует различать поверхность раздела между твердой фазой клеток и окружающей их жидкостью [ Magshaff К. С, 1980].
С микробиологической точки зрения популяция рассматривается "как самостоятельная биологическая система, обладающая свойствами, непосредственно не вытекающими из свойств отдельных единиц", обо-бей [Печуркин Н.С., 1978]. Н.С.Печуркиным вводится понятие генетически гетерогенной популяции, которой может быть и чистая культура (штамм). Клоновая культура - генетически гомогенная популяция обязательно в результате нескольких поколений подвержена неравновесному распределению генотипа и появлению мутаций, что, в конце концов, составляет эволюционную основу перехода к генетически гетерогенной популяции. Экспериментатор-микробиолог практически всегда тлеет дело с гетерогенными популяциями бактерий. Исследование гетерогенности популяции в первую очередь требует нахождения такого информативного параметра, который бы объединял микробиологические и физические характеристики данного свойства популяции. На наш взгляд, такой физический параметр должен отражать поверхностные свойства твердой фазы клетки популящш, т.е. он должен интегрально характеризовать область контакта оболочки клетки, через которую, как известно, происходят жизненно важные обменные процессы, и жидкости, в которой находится бактериальная клетка популяции. Наиболее полным и эффективным с измерительной точки зрения параметром является электрокинетический потенциал ( с. -потенциал) поверхности клетки. Изменения с. -потенциала зависят от изменения специфических свойств поверхности, являющейся неотъемлемой частью функционирующей оболочки клетки, синтезом материала которой управляет внутриклеточный генный аппарат [Stockez BAD., Makefii P. H., i9?i ] Поскольку генотип в популяции от клетки к клетке подвержен неравновесному ассиметричному распределению, то и матерная поверхности клеток популяции принимает в процессе развития некоторую неравнозначность, неполноценность, которая будет отражена через колебания их электроповерхностной характеристики, интегрально выраженные через величины -потенциала клеток. Измерение с -потенциала репрезентативной группы клеток популяции позволяет отразить электроповерхностную гетерогенность ОПТ) популяции.
Разработка культиватора для выращивания бактерий с целью исследования динамики электроповерхностной гетерогенности популяции
Исследование динамики электроповерхностной гетерогенности популяции непременно связано с культивированием бактерий. Известны периодические, глубинные и непрерывные методы культивирования,, кавдгы из которых обладает определенными характеристиками. На современном этапе развития тех отраслей микробиологии, где ставятся задачи промышленного получения стабильного продукта или препарата бактериального биосинтеза, наиболее прогрессивно использование глубинных и непрерывных методов культивирования. Метод периодического культивирования имеет в научном плане то преимущество, что позволяет за короткий промежуток времени получить достаточную био-.массу для многих экспериментальных исследований при полном цикле развития популяции в замкнутом пространстве от лаг-фазы до насыщения, что является в принципе необходимым и достаточным условием . исследования динамики электроповерхностной.гетерогенности популяции. В качестве элементарных культиваторов, которые широко используются в микробиологии, молено назвать обычные колбы и чашки Петри, размещенные в термостате. Заманчивая простота использования колб в качестве культиватора наталкивается на высокие требования корректности измерения характеристик популяции для целей исследования динамики электроповерхностной гетерогенности, а именно:
1) стабильность термостатирования, решается повышением точности термостатирования;
2) пространственная однородность индивидуумов популяции, решается перемешиванием объема жидкости;
3) стерильность забора проб популяции;
4) удобства и простота при эксплуатации культиватора.
Перечисленные требования к культиватору периодического действия не удовлетворяются при использовании колб в промышленном термостате. Действительно, самые современные промышленные термостаты, используемые в микробиологических лабораториях, имеют абсолютную погрешность + 0,1С. Некорректность поддержания температурных условий выращивания популяции создает столь ощутимые разбросы в выходных характеристиках ее, включая -потенциал, что дальнейшее сопоставление их друг с другом затруднительно. Покажем, как изменяются важнейшие физико-химические характеристики воды, как основного компонента питательной среды, при изменении температуры на 0,1С (табл.4.1). Следует учесть, что нестабильность температурного режима при культивировании значительно влияет на скорости ферментативных реакций. Температурный коэффициент Qw =1-2 [Диксон М.,1982] . Изменение температуры на 0,1С приведет к изменению скоростей реакций метаболизма до I + 2% .
Обсуждение полученных результатов и заключение
"Следует решить, представляет собой разнообразие только "приправу" к жизни или оно необходимо для долгой жизни всей экосистемы"... - ставит вопрос Ю.Одум (1975), известный эколог, автор книги "Основы экологии". В области микробиологии, где размеры индивидуума популяции составляют 0,3 - 1,5 мкм, ответить на этот вопрос очень сложно. Отметить разнообразие признаков и тем более измерить их при столь малых размерах объекта составляет непростую задачу. Однако обзор литературы, относящейся к области популяционной микробиологии, показывает, что внутри бактериальной популяции существуют довольно сложные взаимодействия, но, как в отношениях с другими популяциями, так и с окружающей средой, популяция выступает в виде некоторой целостной структуры [Печуркин Н.С., 1978]. Основной интегральной характеристикой, отражающей конечный результат жизнедеятельности популяции, признана на современном уровне ее численность, а именно плотность индивидуумов (клеток). При этом структура популяции, пошшаемая экспериментатором как движущая причина жизнедеятельности, часто называемая генофондом, остается постоянной, хотя неизвестной как в качественном, таї: и в количественном аспектах. Следует признать, что затруднения и неопределенности при рассмотрении многих микробиологических проблем, заключаются в слабости рассмотрения тех или иных структурных характеристик популяции, которые определяются "как возрастная, половая, пространственная и любая другая гетерогенность, имеющая место в пределах данного вида микроорганизмов" [Елохина И.Н., Угодчиков Г.А.,1980].
Признание рядом авторов важности изучения структуры популяции, постановка этой проблемы как специального, отдельного, ведущего предмета в области популяционной микробиологии является актуальной и прогрессивной задачей. Однако микроскопические размеры и относительное однообразие форм существования прокариотов (палочковидные, шаровидные, извитые и т.д.) сужают область проявления признаков, выдвигая на передний рубеж физико-химические свойства клеток микроорганизмов, в совокупности характеризующих популяцию как единое целое. Разнообразие проявления физико-химических характеристик клеток в общем смысле шире и информативнее отражает процессы жизнедеятельности популяции, так как оно приближается к молекулярному уровню исследования, и здесь имеются более практические возможности установления количественных характеристик. Однако, чтобы не переступить грань популяционного уровня исследования, необходимо ограничить выбор физико-химических параметров и взять на вооружение только те, которые бы интегрально характеризовали особь популяции как целую единицу, чтобы в дальнейшем распределения этого параметра создали ожидаемую количественную меру структуры популяции по этим свойствам, определяемую гетерогенностью по выбранному признаку.
