Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Обзор научной литературы 10
«Современные проблемы выявления и идентификации Listeria monocytogenes в неклинических образцах» 10
1.1. Биологическая характеристика бактерий рода Listeria, особенности, определяемого ими патологического процесса 10
1.1.1. Биологическая характеристика бактерий рода Listeria. 10
1.1.2. Распространение листерий в природе, устойчивость к неблагоприятным воздействиям 16
1.1.3. Особенности протекания листериоза у людей, факторы патогенности листерий 20
1.2. Современные методы обнаружения листерий в клинических образцах, объектах внешней среды, в пищевых продуктах 28
1.2.1. Накопительные и диагностические среды для листерий 28
1.2.2. Видовая идентификация в пределах рода листерия 32
1.2.3 Серотипирование листерий 33
1.2.4. Гемолитическая активность листерий как видовой идентификационный признак 35
1.2.5. Ускоренные методы идентификации листерий 38
1.3. Проблемы выявления и идентификации листерий в неклинических образцах 43
1.3.1. Сублетальные повреждения клеток листерий, переживание листерий в отсутствии питательных веществ 45
1.3.2. Смешанный характер популяций листерий в неклинических образцах 49
1.3.3. Гемолитическая активность L. при сапрофитном способе существования 50
1.3.4. Пути решения проблем выявления и идентификации патогенных листерий в неклинических образцах 51
Глава II. Материалы и методы исследования 52
П. 1. Бактериальные штаммы и методы их поддержания 52
П.2. Питательные среды 52
П. 3. Вявление листерий в рыбе, воде, рыбной продукции 54
П.4. Определение подвижности, сбраживания углеводов,
проведение каталазного теста 55
П.5. Серологические методы исследования 56
П.6. Выявление L.monocytogenes методом твердофазной фермент-
зависимой иммунофлюоресценции в анализаторе VIDAS 57
П.7. Статистическая обработка результатов 59
Глава III. Результаты исследований и обсуждение 60
III. 1. Сравнительная оценка эффективности накопления листерий в различных по составу элективных средах 60
III. 1.1. Видовая специфичность элективных питательных сред для обнаружения L.monocytogenes 60
III. 1.2. Эффективность накопления L.monocytogenes на основных элективных питательных средах 63
III. 2. Оценка встречаемости листерий в водоемах, на рыбе и рыбной продукции Северо-западного региона РФ 66
III. 2.1. Частота встречаемости листерий в образцах воды и рыбы из водоемов Ленинградской области 66
.2.2. Частота встречаемости листерий в образцах воды и рыбы из рек, озер Северо-западного региона РФ 70
III. 2.3. Частота встречаемости листерий в рыбной продукции холодного копчения, производимой и реализуемой в Санкт-Петербурге 71
III. 3. Формирование коллекции штаммов L.monocytogenes, выделенных из объектов внешней среды, рыбы и рыбных продуктов 73
Ш.4. Гетерогенность коллекций L monocytogenes по родовым признакам 75
III. 5. Гетерогенность коллекций L monocytogenes по видовым признакам 76
III.6. Сравнение результатов идентификации L.monocytogenes классическим набором признаков и методом твердофазной
иммунофлюоресценции (VIDAS) 81
Заключение 82
Выводы 85
Список литературы
- «Современные проблемы выявления и идентификации Listeria monocytogenes в неклинических образцах»
- Распространение листерий в природе, устойчивость к неблагоприятным воздействиям
- Бактериальные штаммы и методы их поддержания
- Сравнительная оценка эффективности накопления листерий в различных по составу элективных средах
Введение к работе
За последние 20 лет во всем мире резко возрос интерес к бактериям рода Listeria (Bind J.L.,1989; Бакулов И.А. и др., 1992). Это связано с прокатившимися в 80-х годах по странам Европы, Америке и Канаде многичисленными вспышками листериоза людей, причиной которых явились зараженные пищевые продукты (пищевой листериоз). Возбудитель листериоза - Listeria monocytogenes - вызывает у животных и людей заболевание с тяжелыми клиническими проявлениями (Шувалова Е.П., 1990). Летальность при листериозе людей достигает 30% и более процентов (Ortel S., 1989).
Причиной превращения листериоза, традиционно зоонозной инфекции, в заболевание, передаваемое пищевым путем, связано с ухудшением экологической обстановки в густо населенных регионах планеты, широким распространением патогена в окружающей среде.
Патогенные листерии способны вести сапрофитный образ жизни. В настоящий момент их все чаще обнаруживают в озерах, реках, в прибрежной зоне морских заливов (Jones D., Seeliger H.P.R., 1992). Они способны заселять гидробионтов, водные и наземные растения. Листерии выделяют "из грызунов, насекомых и других членистоногих, диких и домашних животных, включая птиц.
Листерии в месте с сырьем попадают на производства пищевых продуктов и заражают выпускаемую продукцию. Наиболее проблемными в отношении патогенных листерии являются мясные, рыбные и молочные продукты. Листерии обладают повышенной резистентностью к ряду неблагоприятных физических и химических факторов, встречающихся на производстве: пониженным и повышенным температурам, высоким концентрациям поваренной соли, фенольным соединениям коптильного дыма.
С середины 80-х годов во всех цивилизованных странах, а в последние годы и в России, пищевые продукты, в первую очередь, готовые к употреблению без дополнительной тепловой обработки, проверяют на содержание патогенных листерий. В связи с низкой инфекционной дозой для L.nonocytogenes - всего 100 клеток, общепризнанно жесткое требование: отсутствие жизнеспособных клеток L.monocytogenes в 25 г пищевого продукта.
Выявление листерий в пищевых продуктах и объектах окружающей среды представляет определенную проблему. Среди 6 видов листерий только один вид - L.monocytogenes - является патогенным для человека, а остальные виды, по современным представлениям не являются опасными для здоровья людей. Содержание листерий в продуктах и объектах окружающей среды очень низкое. Поэтому исключительно важными при выявлении листерий становятся эффективность стадии накопления и четкая система идентификации.
Обнаружение листерий в рыбе и рыбных продуктах наиболее трудная задача. Высокая питательная ценность рыбы в сочетании с высокой ее влажностью приводят к быстрому росту численности
посторонней по отношению к листериям микрофлоры вплоть до 10 КОЕ/г. На таком фоне обнаружить единичные клетки листерий возможно лишь при наличии высокоэффективной среды накопления.
Первый опыт по выявлению листерий в пищевых продуктах
показал, что патогенные листерий могут находиться в состоянии стресса
после воздействия замораживания, высушивания, термической обработки,
воздействия консервантов, коптильного раствора, моющих и
дезинфицирующих средств. Это усложняет выявление листерий в условиях конкурентных взаимоотношений с сопутствующей микрофлорой. Длительное воздействие стрессовых факторов приводит к изменению физиологических и биохимических признаков, ослаблению факторов патогенности, регистрируемых при идентификации листерий. Следствием
8
этого оказывается низкая эффективность обнаружения листерий при
анализе пищевых продуктов, морской и пресной воды, снижение
вероятности правильной идентификации, большое число
ложноотрицательных ответов.
Не все признаки, используемые в видовой идентификации листерий, выделенных из неклинических образцов, уже сейчас кажутся одинаково весомыми. До сих пор при выявлении листерий в пищевых продуктах не сформировалось четкое представление о значимости идентификационных признаков (подвижность при 22 и 37С, скорость сбраживания углеводов, гемолитическая активность, результаты САМР-теста), используемых для разделения видов листерий.
В связи с выше/изложенным, актуально изучение гетерогенности популяций листерий на рыбе и рыбных продуктах, как наиболее проблемных в этой области, по физиолого-биохимическим и серологическим признакам, используемым для идентификации.
Данная работа выполнялась в лаборатории технической микробиологии Института Гипрорыбфлот, где на протяжении нескольких лет по заданию Государственного комитета Росссийской Федерации по рыболовству велась разработка методов выявления, накопления и идентификации патогенных листерий в рыбе и рыбной продукции. В работе были поставлены следующие задачи:
Провести сравнительную оценку эффективности накопления листерий в элективных средах различного состава, разработанных и производимых отечественными и зарубежными фирмами, при анализе рыбной продукции;
Провести оценку содержания листерий в водоемах Северозападного региона России, в том числе Ленинградской области, а также в рыбе и рыбных продуктах, производимых в Санкт-Петербурге;
Сформировать коллекцию штаммов L.monocytogenes из объектов внешней среды, рыбы и рыбных продуктов;
Изучить у коллекционных штаммов L.monocytogenes гетерогенность проявления признаков, существенных для их видовой идентификации;
Оценить целесообразность использования иммуноферментного анализа для окончательной идентификации изолятов листерий со слабым проявлением гемолитической активности.
«Современные проблемы выявления и идентификации Listeria monocytogenes в неклинических образцах»
Род Listeria Pirie 1940, 383 представлен неспорообразующими правильными грамположительными палочковидными бактериями величиной 0,4-0,5 мкм х 0,4-2мкм (Holt et al., 1994). Листерии при температуре 20-25С имеют два-три (иногда пять) перитрихальных жгутика (Welshimer, 1981; Ralovich, 1984). При 37С жгутиков становится меньше. Листерии не образуют капсул. Свежевыделенные штаммы на твёрдой питательной среде после 24-28 часов инкубации образуют характерные каплевидные (росинчатые) колонии 0,5-2 мм в диаметре, прозрачные серо-голубые при нормальном освещении и голубовато-зелёные в косопадающем свете (Seeliger, Jones, 1986; Holt et al., 1994).
Большинство штаммов листерии способно трансформироваться в R-формы (Seeliger, Jones, 1986). Листерии легко переходят в L-формы in vitro при добавлении в среду пенициллина или глицина и при естественном течении листериоза животных и человека (Калишин, 1981; Котлярова, 1989; Черкасский, 1994).
Клеточная стенка листерии типична для фирмикутных бактерий, она состоит на 30-40% из муреина. В состав полипептидных фрагментов петидогликана входит мезо-диаминопимелиновая кислота (Fiedle, 1988; Seeliger, Jones, 1986). Поверхность стенки образована тейхоевыми и липотейхоевыми кислотами, которые у патогенных видов идентифицируют как соматические антигены (Ralovich, 1984; Rocaurt, 1988). У всех штаммов в состав тейхоевых кислот входит рибитол (Jones, 1989; Fiedler, 1988). В клеточной стенке отсутствуют белки, ковалентно связанные с муреином, однако, присутствуют свободные белковые компоненты, главным образом, автолитические ферменты (Fiedler, 1988). В состав липидов мембран входят насыщенные преимущественно, изо- и антеизо-метил-разветвленные жирные кислоты (Seeliger, Jones, 1986; Jones, Seeliger, 1992).
Листерии являются хемоорганотрофными факультативно-анаэробными бактериями. Они утилизируют глюкозу путем гликолиза с образованием L - лактата (Seeliger, Jones, 1986,1992). Все штаммы образуют кислоту из целлобиозы, эскулина, фруктозы, маннозы, глюкозы и салицина, замедленно из мальтозы (до 4-х дней), декстрина (до 8 дней), глицерина (10 дней). Листерии способны в небольших количествах окислять пируват, малат, сукцинат, и L-кетоглуторат (Friedman, Aim, 1962). Листерии не способны утилизировать экзогенный цитрат, гвдролизовать мочевину, казеин, желатин. Они не образуют сероводорода и индола (Seeliger, Jones, 1986).
Листерии каталазоположительны и оксидазоотрицательны. У всех штаммов отмечена слабая дезоксирибонуклеазная и рибонуклеазная активность (Jones, Seeliger, 1992).
В последнем издании Руководства по ситематике бактерий Берги род Listeria вместе с родами Erysipelothrix, Brochothrix, Lactobacillus, Renibacterium и Kurthia на равных основаниях входит в XIV группу: «Правильные неспорообразующие грамположительные палочки» (Seeliger, Jone, 1986) - табл.1. Та же группа родов вместе с p. Listeria в Определителе бактерий Берджи помещена в группу 19 (Хоулт и др., 1997).
На основе анализа генов 16S p-PFHC листерии относят вместе с филогенетически близким p.Brochothrix к «кдостридиащ.ной» подветви грамположительных бактерий, имеющих содержание Г+Ц меньше 50% (Woese, Stackebrandt, 1981), где они формируют своеобразную линию между родами Bacillus и Lactobacillus (Ludwig et al., 1984).
В соответствии с последним, полным изданием Руководства по систематике бактерий Берги (Seeliger, Jones, 1986) и Определителем бактерий Берджи (Хоулт и др., 1994) в род Listeria входит 7 видов листерий. Сапрофитные виды L.murrayi и L.grayi в настоящий момент объединены в один вид L.grayi (Rocourt, 1988, 1989). Вид L.denitrificans переименован в новый род Jonesia. Признаки видов, согласно Определителю бактерий Берджи, представлены в табл. 2.
L. monocytogenes - типовой вид рода Listeria ( Murray et. al., 1926, Pirie 1940,383). Этот вид чаще всего выделяется из патологического материала больных животных и людей (Hot, Heftier, 1988). L. monocytogenes широко распространена в природе. Обнаруживается в почве, силосе, фекалиях здоровых животных, в том числе и людей, в продуктах питания (Seeliger, Jones, 1986). Типовой штамм АТСС 15313 (Seeliger, Jones, 1986).
L.innocua (Seeliger and Schoots, 1979; Seeliger 1983, 439) широко распространена в окружающей среде. Выделяется из почвы, растительных остатков, из кишечника теплокровных животных и 0,5-2,5 % здоровых людей (Ralovich, 1984). Она не является постоянным компонентом миклофлоры кишечника, и, как правило, выталкивается естественной микрофлорой в течение полугода (Ralovich, 1984 , Holt, Hefner, 1988). Непатогенна для мышей при внутрибрюшной инъекции. Единственный штамм - Welshimer S-12 - вызывает энцефалит новорожденных мышей (Seeliger, Jones, 1986). В последние годы зафиксированы единичные случаи менингоэнцефалита овец, вызванного L. innocua (Walker et al ., 1994). Типовой штамм АТСС 33090.
Распространение листерий в природе, устойчивость к неблагоприятным воздействиям
L.monocytogenes, в настоящий момент, распространена повсеместно: она встречается в почве, в пресноводных водоёмах, засоленных эстуариях, на растительных остатках, а также в бытовых сточных водах и стоках перерабатывающих предприятий (Welshimer, 1981;Picard-Bonnaud etal., 1989a,b; Skovgaard, 1989; Jones, Seeliger, 1992).
Распространению патогенных листерий в природе способствует часто встречающееся листерионосительство. Листерий выделяются от 90 видов диких и домашних животных (Тартаковский, 2000). По различным литературным источникам от 5 до 90 % сельскохозяйственных животных (крупный и мелкий рогатый скот, домашняя птица) являются носителями листерий (Бакулов и др., 1991). Постоянным источником листерий являются грызуны.
Листерий способны проникать и длительно персистировать в растениях (Пушкарева и др., 1996; Пушкарева и др., 1997; Тимченко и др., 2000). L.monocytogenes, как и сапрофитные виды, способна поселяться в организме гидробионтов, в частности рыб (Jemni, Keusch, 1994), образовывать ассоциации со свободноживущими простейшими (Пушкарева, 1996). Листерий выделяют из членистоногих: мух, слепней, вшей и клещей, из ракообразных: крабов, креветок (Черкасский, 1994; Degan et al., 1994; Родина и др., 2001).
Листерий высевают из кишечника и слизистой миндалин у 1,0 -11,8% здоровых людей (Казанцев, 1980; Ralovich В., 1984). Около половины этих изолятов принадлежит к патогенным видам (Ralovich, 1984). Высоковирулентные штаммы L. monocytogenes составляют до 50 %
от всех выделенных изолятов листерий в объектах окружающей среды (Дарвиш, 1995).
Присутствие патогенных листерий в окружающей среде связывают с загрязнениями необеззараженными животноводческими и бытовыми сточными водами (Scovgaard, 1989). Как показывают многочисленные данные, L. monocytogenes может длительное время сохраняться и вести сапрофитный образ жизни вне организма хозяина (Welshimer, 1981; Jones, Seeliger, 1992). Возможные пути циркуляции патогенных листерий представлены на рис. 1 (Бакулов, 1994).
Стойкость природных очагов листериоза объясняется устойчивостью листерий к неблагоприятным воздействиям окружающей среды. Оптимальная температура для роста листерий 30-37С, но они способны размножаться и сохранять вирулентные свойства в диапазоне от минус 0,1 до плюс 45С (Seeliger, Jones, 1986), выдерживать замораживание в течении 100 дней (Калишин, 1988). При температуре минус 9-11 до 64 % популяции L.monocytogenes теряет вирулентные свойства, но они восстанавливаются при наличии питательных веществ и оптимальных температурных условий (Flanders, Donelly, 1994). Листерий выдерживают нагревание до 60С в течение 30 минут (Seeliger, Jones, 1986). Некоторые терморезистентные штаммы L.monocytogenes могут выдерживать кипячение в течение 3-5 минут и сохранять при этом вирулентные свойства (Калишин, 1988).
Повсеместное распространение листерий в окружающей среде и широкое листерионосительство среди домашних животных и людей приводят к заражению листериями продуктов питания (Mossel, 1989; Scovgaard, 198$; Schuchat et al, 1991), Так, в США 70 % проб сырой говядины и 48 % проб мяса птицы, взятых из различных районов, содержат листерий (Lee, McLain, 1986). В России около 50 % проб различных видов мяса и 10 % проб сырого молока содержат листерий (Бакулов и др., 1991).
В значительных количествах листерии содержатся в мягких сырах, так как для их изготовления используется молоко, прошедшее мягкий режим пастеризации при температуре 60-67 (Бакулов и др., 1991). Тогда как для инактивации листерии в молоке необходима пастеризация в течение 15 минут при температуре 72С (Skovgaard, 1989; Бакулов и др ., 1991).
Рыба и рыбные продукты стоят на втором месте по частоте встречаемости патогенных листерии (Dillon et al., 1992a,b; Ben Embarek, 1994; Donnely, 1994). Это связано с широким распространением листерии и L.monocytogenes, в частности, в пресноводных водоемах в прибрежных морских районах, особенно вблизи крупных городов (Miles, Motes, 1991; Ben Embarek, 1994). Размножению листерии в контаминированных рыбных продуктах во многом способствует их устойчивость к высоким концентрациям соли (до 20%) и фенольным соединениям коптильного дыма (Sabanadesan et al.,2000).
Содержание патогенных листерии в почве и на поверхности растений приводит к заражению сырых овощей, фруктов и грибов (Allerberger et al., 1989; Ralovich, 1989). Так, в овощехранилищах Москвы овощи длительного хранения заражены листериями на 100 %, свежие овощи - в 3,25 % проб (Ющенко и др., 1990). Кроме того, в связи с вторичной контаминацией листерии обнаруживаются в продуктах, прошедших тепловую обработку: в варёной колбасе, сосисках, мясных, рыбных консервах, в готовых блюдах на предприятиях общественного питания.
Бактериальные штаммы и методы их поддержания
В качестве контрольных штаммов в работе использовали два музейных штамма Listeria monocytogenes: штамм А и штамм 546, полученные из Всероссийского Института стандартизации и контроля ветеринарных препаратов (Москва).
Все штаммы, использованные для определения видовой специфичности сред, Rhodococcus equi и Staphylococcus aureus получены из музея лаборатории технической микробиологии Гипрорыбфлота.
Бактериальные штаммы поддерживали на питательном агаре (Махачкала) с 0,5% глюкозы, пересевали 1 раз в месяц и хранили при температуре бытового холодильника.
В работе использовали следующие накопительные питательные среды фирмы Merck KGaA (Германия) и HiMedia Labs. Ltd. (Индия):
1. Fraser broth -бульон Фразера. Состав (г/л): гидролизат казеина ферментативный - 5,0; мясной пептон - 5,0; дрожжевой экстракт - 5,0; хлорид натрия - 20,0; дигидрофосфат калия 1,35; гидрофосфат натрия -12,0; эскулин - 1,0; хлорид лития 3,0; цитрат аммонийного железа - 0,5; рН 7,2+ 0,2. На 1-ой стадии накопления в на 1 л среды добавляли селективные компоненты: 10 мг налидиксовой кислоты и 12,5 мг акрифлавина; на 2-ой стадии - эти же добавки вносят в 0,5 л среды.
2. L-PALCAM-Listeria Selective Enrichment Broth ace. to van Netten. Состав среды (г/л): пептон - 23,0; крахмал - 1,0; хлорид натрия -5,0; эскулин - 0,8; хлорид лития - 15,0; цитрат аммонийного железа - 0,5; глюкоза - 0,5; маннит - 10,0; феноловый красный - 0,08. рН 7,0+0,2. На 1л среды добавляли 5 мг акрифлавина, 10 мг полимиксина В, 20 мг цефтацидина в 10 мл стерильной дистиллированной воды.
3. ПБЛ - Питательный бульон для выделения и культивирования листерий (НПО «Питательные среды», Оболенск). Состав среды(г/л): гидролизат казеина ферментативный 10,0; пептон ферментативный мясной - 15,0; гидролизат автолизованных дрожжей - 2,0; хлорид натрия - 3,5; хлорид лития - 3,0; рН 7,0+0,2. Перед употреблением кіл основы среды добавляли 4,44 мл раствора антибиотиков: 10 мг налидиксовой кислоты, 5 мг акрифлавина, 5 мг полимиксина В сульфата в 10 мл физиологического раствора.
4. Listeria Enrichment Broth. Состав среды (г/л): ): гидролизат казеина ферментативный - 5,0; мясной пептон - 5,0; дрожжевой экстракт -5,0; хлорид натрия - 20,0; дигидрофосфат калия 1,35; гидрофосфат натрия - 12,0; акрифлавин - 0,015; налидиксовая кислота - 0,04; циклогексимид 0,05; рН 7,0+0,2. В качестве диагностических сред использовали:
1. L-PALCAM-Listeria Selective Agar асе. to van Netten. Состав среды (г/л): пептон - 23,0; крахмал - 1,0; хлорид натрия - 5,0; эскулин -0,8; хлорид лития - 15,0; цитрат аммонийного железа - 0,5; глюкоза - 0,5; маннит - 10,0; феноловый красный - 0,08; агар-агар - 13,0. рН 7,0+0,2. На 1л среды добавляли 5 мг акрифлавина, 10 мг полимиксина В, 20 мг цефтацидина в 10 мл стерильной дистиллированной воды.
2. Oxford agar (Merck, Германия; HiMedia Labs., Индия). Состав среды (г/л): пептон - 23,0; крахмал кукурузный - 1,0 ; хлорид натрия - 5,0; эскулин - 1,0; хлорид лития - 15,0; цитрат аммонийного железа - 0,5; агар X. -. агар - 10,0; рН 7,0+0,2. На 1,0 л среды добавляли: 5 мг акрифлайяна, 20 мг колистина, 400 мг циклогексимида, 10 мг фосфомицина, 2 мг цефотетана в 10 мл стерильной дистиллированной воды.
3. ПАЛ - питательный агар для листерий (НПО «Питательные среды», Оболенск). Состав среды (г/л): гидролизат казеина панкреатический - 10,0; гидролизат автолизованных дрожжей - 2,0; хлорид натрия - 3,5; хлорид лития 15,0; цитрат аммонийного железа - 0,5; эскулин - 0,8; агар-агар - 13,0; рН 7,2+0,2. Селективные агенты: 0,02 г налидиксовой кислоты, 0,01 полимиксина В сульфата и 0,01 г акрифлавина растворяли в 10 мл стерильной дистиллированной воды, вносили віл среды - 4,44 мл.
Сравнительная оценка эффективности накопления листерий в различных по составу элективных средах
Обнаружение листерии в рыбных продуктах является сложной задачей из-за большой численности посторонних бактерий (до 108 - 109 КОЕ/г). Листерии размножаются медленно даже в богатых питательных средах, поэтому для их выявления необходимы строгие элективные условия.
На сегодняшний день разработан ряд накопительных сред с различными композициями селективных факторов для обнаружения листерии в пищевых продуктах, их состав обсуждался в п. 2.2.1, табл. 4. До сих пор не проведена сравнительная оценка видовой специфичности этих сред в отношении разных групп бактерий и эффективность накопления листерии в присутствии микрофлоры рыбы. Мы провели эти исследования с музейными культурами бактерий, встречающихся в составе естественной микрофлоры рыб, и оценили эффективность накопительных сред для листерии при исследовании свежей рыбы, искусственно зараженной листериями.
Оценку видовой специфичности оценивали для двух типовых питательных сред: - LEB/FDA (Hutchins A.D., 1992) - без LiCl, эскулина и маннита, с традиционной композицией антибиотиков: акрифлавином, налидиксовой кислотой и циклогексимидом, введенными в состав готовой питательной среды; - PALCAM - бульона, в составе которого имеются: эскулин с визуальной системой его потребления (почернение среды), маннит и LiCl, а также более жесткая, чем в LEB/FDA, композиция антибиотиков (акрифлавин, полимиксин В, цефтацидим).
Тест-штаммы бактерий в виде суспензионных двухсуточных культур вносили в исследуемые среды до начальной концентрации 104 - 10 КОЕ/мл, инкубировали при 30С в течение 48 час. Результаты представлены в табл. 7.
Можно отметить, что обе среды являются высоко элективными и тормозят рост большинства грам-положительных и грам-отрицательных бактерий. Acinetobacter, Alcaligenes и представители сем. Enterobacteriaceae (представители родов Escherichia, Klebsiella, Enterobacter, Salmonella) не способны расти в этой среде. Тем не менее, в среде LEB/FDA способны размножаться представители p. Pseudomonas (Ps.fluorescens и Ps. aeruginosa).
PALCAM-бульон сдерживает рост всех исследованных грам-отрицательных бактерий. Среди грам-положительных бактерий рост наблюдали лишь у представителей p.Bacillus: B.sutilis 6633 и Bac.cereus ВКМ 687, но при этом отсутствовало характерное для листерии почернение питательной среды в связи с расщеплением эскулина.
Обе питательные среды обеспечивают быстрый рост музейных штаммов L. monocytogenes. При начальной их концентрации 2-4 КОЕ/мл рост визуально может быть зарегистрирован в первые 17-30 часов при 30С.
Полученные данные позволяют сделать вывод о том, что обе среды -LEB/FDA и PALCAM-бульон обладают достаточными элективными свойствами. В этой связи PALCAM- бульон на этапе работы с музейными штаммами листерии кажется более предпочтительным, так как большинство почвенных бацилл не способны к гидролизу эскулина, а их колонии легко узнаваемы по морфологическим признакам.
PALCAM-бульон с добавлением агар-агара рекомендован (van Netten, 1989) в качестве диагностической питательной среды. Колонии L. monocytogenes на 2 сутки роста при 30 - 37С мелкие (диаметр около 2 мм), слизистые, выпуклые, полупрозрачные, серо-зеленые с черным ореолом, указывающим на потребление бактериями эскулина. Пожелтение (потребление маннита и/или крахмала) наблюдалось только у колоний сапрофитных листерий L.grayi.
По мере старения колоний листерий на PALCAM-arape, к 5-7 суткам, появлялось специфическое почернение центральной части колоний и постепенное «вдавливание» центра. Этот признак также может быть использован, как отличительный, на начальных этапах выявления колоний листерий.
Эффективность накопительных сред для L.monocytogenes оценивали на рыбе, искусственно зараженной листериями. В таких условиях предстояло оценить способность листерий конкурировать за питательный субстрат со значительной по величине сопутствующей микрофлорой.
Известное количество клеток L. monocytogenes шт. А (единичные клетки и более) вносили на стадии гомогенизациии образца: 25 г охлажденной рыбы (рипус) в 225 мл накопительной среды. Общее микробное число рыбы- 105-108КОЕ/25 г.
Для оценки урожая листерий проводили высев накопительной культуры на PALCAM-arap. Подсчитывали количество колоний листерий и рассчитывали урожай в изучаемой среде накопления.
