Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1 CLASS Введени CLASS е 3
ГЛАВА 2 Обзор литературы 6
2.1 Особенности биологии и экологии листерий и их значение в распространении пищевого листериоза 6
2.1.1 Общая характеристика и таксономия листерий 6
2.1.2 Биология возбудителя 8
2.1.3 Факторы патогенности листерий и их роль при взаимодействии с макроорганизмом 10
2.1.4 Регуляция экспрессии факторов патогенности 14
2.1.5 Резистентность к температуре и другим факторам внешней среды 17
2.1.6 Листериоз как пищевая инфекция 19
2.1.7 Листерий в продуктах питания 22
2.2 Методы лабораторной диагностики и идентификации листерий 26
2.2.1 Серологическая диагностика 26
2.2.2 Бактериологическая диагностика 30
2.2.3 Идентификация культур 36
ГЛАВА 3 Материалы и методы 41
3.1 Использованные штаммы 41
3.2 Микробиологические методы 42
3.2.1 Условия культивирования 42
3.2.2 Выделение листерий из продуктов питания 43
3.2.3 Идентификация клонов, выделенных из продуктов питания бактериологическими методами 44
3.2.4 Приготовление сред и определение лецитиназной активности 44
3.3 Молекулярно-генетические методы 45
3.3.1 Приготовление лизатов клеток листерий для проведения ПЦР 45
3.3.2 Полимеразная цепная реакция 45
3.3.3 Осаждение продукта ПЦР для последующего анализа 46
3.3.4 Рестрикционный анализ (ПЦР-РА) 47
3.3.5 Приготовление образцов для секвенирования 47
ГЛАВА 4 Результаты 48
4.1 Размножение листерий в молочных продуктах 48
4.2 Отработка методики выделения листерий из продуктов питания 49
4.2.1 Проверка различных селективных питательных сред 49
4.2.2 Выделение листерий из продуктов питания и дальнейшая идентификация общепринятыми микробиологическими методами 52
4.2.3 Идентификация листерий методом ПЦР 56
4.3 Разработка метода лецитиназной активности 59
4.4 Типирование Listeria monocytogenes на основе полиморфизма генов факторов патогенности 70
4.4.1 Анализ штаммов L. monocytogenes в ПЦР 70
4.4.2 Рестрикционный анализ фрагмента, полученного в ПЦР 71
4.4.3 Определение сайтов изменчивости у полученных групп 73
ГЛАВА 5 CLASS Обсуждени CLASS е 78
Глава 6 выводы 85
Список литературы 86
- Особенности биологии и экологии листерий и их значение в распространении пищевого листериоза
- Серологическая диагностика
- Приготовление лизатов клеток листерий для проведения ПЦР
- Выделение листерий из продуктов питания и дальнейшая идентификация общепринятыми микробиологическими методами
Введение к работе
Актуальность работы:
Возбудитель листериоза Listeria monocytogenes был открыт в 20-х годах прошлого
века во время вспышки заболевания у лабораторных животных ( Seeliger H.P.R., 1988 ). Однако интерес к листериям значительно вырос в 80-ые годы, когда были зарегистрированы эпидемические вспышки и многочисленные спорадические случаи заболевания, связанные с употреблением в пищу контаминированных продуктов. Возбудитель листериоза выделяется из целого ряда продуктов (сыры, различные мясные, куриные и рыбные полуфабрикаты для еды «быстрого приготовления», салаты и т.д.) ( Farber J.M., Peterkin P.I., 1991 ). Хотя по числу выявляемых случаев листериоз уступает другим пищевым инфекциям, таким, например, как сальмонеллез и дизентерия, он существенно превосходит их по тяжести клинического течения и проценту летальных исходов. Листериоз может проявляться в таких тяжелых клинических формах как менингиты, менингоэнцефалиты, сепсис, аборты и мертворождения, при этом 90% больных нуждаются в госпитализации. Летальность при листериозе достигает 20-30%. Все это делает листериоз одной из важнейших пищевых инфекций 21 века.
В настоящее время можно выделить две основные тенденции, определяющие прогресс в изучении роли листерий в инфекционной патологии человека и совершенствовании профилактики листериоза за последние годы. Одна тенденция связана с возрастающим значением продуктов питания в возникновении случаев эпидемического и спорадического листериоза и, соответственно, с необходимостью разработки методов эффективного мониторинга за листериями в продуктах питания на этапах изготовления и хранения. Вторая тенденция связана с существенным прогрессом в изучении роли молекулярно-генетических детерминант патогенности листерий во взаимодействии с эукариотической клеткой и изучением системы генетической регуляции экспрессии факторов патогенности возбудителя.
Исследования, проведенные в данной работе, выпол left&G: 1*йИсИ01((**Ь№*8фций
БИБЛИОТЕКА
1 СПетербурги/Y
ОЭ JO0?
и направлены на создание современной схемы идентификации и типирования листерий, выделяемых из продуктов питания, на основе изучения особенностей экспрессии и полиморфизма генов факторов патогенности и включения их в систему оценки микробиологической безопасности продуктов питания.
Цель работы: на основе изучения особенностей полиморфизма и экспрессии
генов факторов патогенности разработать методы быстрой идентификации и типирования
листерий и включить их в схему оценки микробиологической безопасности продуктов і
питания.
Задачи исследования:
-
Отработать оптимальную методику выделения и получить коллекцию штаммов листерий из продуктов питания.
-
Разработать эффективные методы видовой идентификации листерий, используя особенности экспрессии генов факторов патогенности.
-
Оценить возможность включения разработанных методов в современную схему мониторинга микробиологической безопасности продуктов питания.
-
Разработать метод типирования листерий на основе изучения особенностей геномного полиморфизма.
Научная новизна работы:
разработан принципиально новый метод идентификации L monocytogenes, основанный на выявлении индукции лецитиназной активности в присутствии активированного угля;
с помощью разработанного метода продемонстрирована возможность быстрой и достоверной дифференциации L monocytogenes от непатогенных листерий на примере коллекции штаммов листерий, выделенных из продуктов питания;
показано, что сочетание лецитиназного теста и полимеразной цепной реакции с видоспецифическими праймерами plcl, plc2 в настоящее время является наиболее эффективным и надежным способом дифференциации L. monocytogenes от непатогенных листерий;
методом полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ) выявлено существование двух филогенетических линий у вида L. monocytogenes, к первой из которых (тип А) относятся штаммы серогрупп 1/2а, 1/2с, За, а ко второй (типы В и В1) - штаммы серогрупп l/2b, 4b, 4d;
впервые продемонстрировано, что последовательность гена prfA, кодирующего основной регулятор генов патогенности, содержит нуклеотидные .замены, консервативные для каждой из филогенетических линий;
впервые проведена оценка частоты встречаемости представителей разных филогенетических линий листерий в зависимости от источника выделения, показавшая преобладание штаммов, относящихся к первой линии, среди пищевых изолятов (72%), в то время как среди клинических изолятов преобладали штаммы, относящиеся ко второй линии (67%);
Практическая значимость:
разработанный метод идентификации L. monocytogenes на основании индукции лецитиназной активности в присутствии активированного угля (патент №2196827 от 20.01.2003г) включен в Государственный стандарт и Методические указания МЗРФ;
разработана система рестрикционного анализа, позволяющая определить принадлежность выделенного штамма листерий к определенной филогенетической линии и оценить его возможную эпидемиологическую значимость.
Апробация диссертационной работы состоялась на научной конференции отдела медицинской микробиологии ГУ НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи РАМН (28 июня 2003 г.). Материалы диссертации доложены на Всероссийской конференции с международным участием «Пробиотики и пробиотические продукты в профилактике и лечении наиболее распространенных заболеваний человека» (Москва, 21-23 апреля
1999); IV международной конференции МАКМАХ «Антимикробная терапия» (Москва, 18-21 июня 2001); VIII съезде Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 26-26 марта 2002).
Объем и структура диссертации. Работа выполнена на 98 страницах машинописного текста и иллюстрирована 10 рисунками и 12 таблицами. Состоит из введения, обзора литературы, результатов собственных исследований и их обсуждения, выводов и списка литературы, включающего 129 источников.
Особенности биологии и экологии листерий и их значение в распространении пищевого листериоза
Микроорганизмы рода Listeria представляют собой грамположительные короткие палочки с закругленными концами, иногда почти кокки, одиночные или в коротких цепочках (0,4-0,5 х 0,5-2 мкм), реже образуют длинные нити. Листерий ферментируют глюкозу, каталазоположительны, оксидазоотрицательны, образуют цитохромы. Оптимальная температура роста 30-37С, хотя листерия как психрофильный микроорганизм может расти при 20-25С и при +4С.При 20-25С листерий подвижны засчет образования немногочисленных перитрихиальных жгутиков, при 37С жгутики, как правило, не образуются и листерий неподвижны. Листерий не кислотоустойчивы, не образуют споры и капсулы, факультативные анаэробы, хемоорганотрофы (1,111).
Согласно определителю Берджи (по 7-е издание включительно) род Listeria был помещен в семейство коринебактерий вместе с лактобациллами, родами Brochothrix и Erysipelothrix. Бактерии последнего вида вызывают рожу свиней и, по мнению ряда исследователей, очень близки к листериям. В дальнейшем эти оба рода были вынесены из семейства коринебактерий и помещены как роды с неясным систематическим положением семейства Lactobacillaceae (раздел неспорообразующие, грамположительные палочки). Девятое издание определителя Берджи относит род Listeria к 19-й группе микроорганизмов - грамположительные неспорообразующие палочки правильной формы (109).
Анализ гомологии нуклеотидных последовательностей ДНК листерий и близких к ним микроорганизмов, исследования 16S г РНК показали, что листерий филогенетически наиболее близки к роду Brochotrix, и вместе с этим родом занимают промежуточное положение между бациллами и лактобациллами, несколько более удалены от стрептококков, а также Kurthica, Gemella и Erysipelothrix (32).
Из шести известных в настоящее время видов листерии (L.monocytogenes, L.seeligeri, L.welshimeri, L.innocua, L.ivanovii, L.gray), только L.monocytogenes патогенна для человека и животных, a L.ivanovii -для животных.
Биохимические и микроскопические исследования подтверждают наличие у листерии оболочки, типичной для грамположительных бактерий. Сухой вес клеточной стенки на 35% представлен перекрестно связанной мезодиаминопимелиновой кислотой. Остальная часть углеводов представлена тейхоевыми кислотами - полимерами, ковалентно связанными с пептидогликаном. Они обычно состоят из глицерола или рибитола, нейтральных Сахаров, N-ацетиламиносахаров и фосфатов.
Серологическая структура листерии изучена и систематизирована Патерсон и в дальнейшем модифицирована Зеелигер, Данпер-Воом и Гарсия (90,37,111). С.Патерсон разделил листерии на 4 основных серотипа на основании содержания и распределения 6 соматических О-антигенов (I -VI) и 4 жгутиковых Н-антигенов (А, В, С, Д). Зеелигер на основе анализа О-антигенов разделил тип 4 на типы 4а и 4в, а Данкер -Воом выделила серовары 4с, 4d, 4е, 1а и За. В 60-е годы И.И.Иванов выделил от больных овец культуру листерии серовара 5, а Данкер -Воом сероваров 6 и 7. Зеелигер, изучая ряд листериозных штаммов, выделил их в род L.gray, отличающийся по Н-антигену (антиген Е).
Современная антигенная схема рода Listeria состоит из 16 серологических вариантов, включающих 15 соматических и 5 флагеллярных антигенов: 1/2а, 1/2в, 1/2с, За, Зв, Зс, 4а, 4ав, 4в, 4с, 4d, 4Е, 7, 5, 6а, 6в.(50,108). В отечественной серологии серовары 1/2а - Зс объединены в серогруппу I, а остальные серовары в серогруппу II (1,14).
Листерии различных сероваров не имеют культуральных, биохимических отличий и не связаны с биологическим типом хозяина. Серовары листерий не являются видоспецифическими, они могут быть общими для двух и более видов, за исключением серовара 5, характерного только для L.ivanovi. Минорные антигены листерий, помимо внутривидовых перекрестных реакций, дают перекрестные реакции с другими грамположительными бактериями, прежде всего со стафилококками, энтеробактериями и коринебактериями (2,19).
Хотя известно 16 сероваров L.monocytogenes, большая часть случаев заболеваний связаны с сероварами 4b, 1/2а, 1/2Ь ,хотя штаммы других сероваров, например ,1\2с часто выделяют из контаминированных продуктов. Штаммы серовара 4Ь вызывают около 50% случаев листериоза в мире, тогда как антигенная группа 1\2 (а,Ь,с) доминирует среди пищевых изолятов. По мнению ряда исследователей штаммы серовара 4Ь более адаптированы к размножению в клетках млекопитающих, чем штаммы серовара 1\2. Фаготипирование позволяет типировать 60-80% выделенных клинических штаммов ( 14,41 ).
Серологическая диагностика
Анализ антигенной структуры листерии показал, что она крайне неудобна для диагностики. Серовары листерии не являются видоспецифическими. Они могут быть общими для разных видов листерии независимо от их патогенности для человека. В сочетании с традиционной для серологических методов исследования относительно низкой чувствительностью и специфичностью, ретроспективным характером диагностики и широким распространением бактерионосительства при листериозе этот недостаток значительно снижает область применения серологических методов (19).
L. monocytogenes имеет одну или несколько общих антигенных детерминант с другими видами листерии, кроме L.welshimeri. Поэтому само по себе установление серовара без применения иных методов не позволяет установить диагноз инфекции, вызванный L.monocytogenes. Специфика антигенной структуры листерий повлияла и на разработку экспресс-методов диагностики листериоза и выявления возбудителя в продуктах питания. Молекулярные методы экспресс-диагностики разрабатываются с большей интенсивностью, чем иммунологические. Тем не менее в практике отечественных бактериологов серологические методы лабораторной диагностики листериоза остаются основными.
В качестве особенности отечественной серологической диагностики следует отметить, что серовары с 1/2а по ЗС, используемые в международной классификации, объединены в первую серогруппу, а остальные серовары - во вторую (1). Данная группа методов сохраняет практическое значение лишь при проведении сероэпидемиологических обследований и санитарно-гигиенических мероприятий на животноводческих объектах для профилактики листериоза у животных и обслуживающего персонала.
На практике в лабораторной диагностике листериоза используются 2 серологических метода: реакция связывания комплемента с инактивированным цитоплазменным антигеном, разработанными выпускаемым ВНИИВВиМ (г.Покров, Владимирской обл.) и реакция непрямой агглютинации эритроцитарным антигенным диагностикумом, разработанным Омским НИИ природно-очаговых болезней. Методы подробно описаны в выше указанных инструктивных материалах и на них ссылаются практически во всех отечественных изданиях и руководствах, посвященных лабораторной диагностике инфекционных заболеваний у людей в качестве основных методов диагностики листериоза (14,15,16).
Вместе с тем, еще в 1967 г. один из основоположников отечественной школы исследователей листериоза академик ВАСХНИЛ И.А.Бакулов обращал внимание на недостаточную специфичность серологических реакций для диагностики листериоза. По его мнению «серологические исследования должны проводиться с целью выявления скрытых больных и листерионосителей в неблагополучных по листериозу хозяйствах, где наличие заболевания установлено с помощью клинико-эпизоотологических и бактериологических исследований. Первичный диагноз с помощью одних только серологических реакций ненадежен» (2). Аналогичных взглядов придерживался крупнейший авторитет по проблеме листериоза Зеелигер (Германия), писавший, что «Оценка серологических данных должна проводиться с большой осторожностью, и при этом наряду с эпидемиологическими особенностями должна учитываться и клиническая картина» ( 112).
К сожалению, как справедливо отмечают работники санитарно-эпидемиологической службы Москвы и России, методы лабораторной диагностики листериоза в нашей стране за более чем 30 летний период практически не изменились, тогда как эпидемиологическая значимость инфекции продолжает возрастать (17,18). Так, по данным Московского центра санитарно-эпидемиологического надзора в 1994-98 гг. было проведено 1361 серологическое исследование на листериоз, в т.ч. 1135 в РПГА и 236 в РСК. Серопозитивные сыворотки были выявлены в 6,0% случаев. Однако, выявленные титры были, как правило, низкие, что затрудняло установление диагноза листериоза как у больных, так и, главным образом, беременных. Выделить же возбудитель листериоза на имеющихся в распоряжении сотрудников центра питательных средах от женщин, родивших больных и мертворожденных детей, а также беременных, имевших серопозитивные реакции с листериозными диагностикумами, не удавалось.
В настоящее время, серологические методы могут использоваться только как вспомогательные. Окончательная постановка диагноза листериоза у людей возможна только после выделения культуры возбудителя из клинического материала.
При этом серологические методы полностью сохраняют свое значение для выяснения эпизоотической и эпидемической ситуации. Так, при сортировке поголовья животных в неблагополучных по листериозу хозяйствах, изоляция и лечение животных, дававших положительную реакцию в РСК, позволяла предотвратить дальнейшее распространение листериоза. Положительный опыт применения РСК позволяет объявить хозяйство благополучным по листериозу через 2 месяца после последнего случая выделения клинически больных животных и получения отрицательных результатов по РСК при двукратном исследовании сывороток крови с интервалом 14-20 дней (13).
Т.В.Честнова с помощью РИГА определяла уровень антител к L. monocytogenes у различных групп населения Тульской области (20). Наивысший процент серопозитивных сывороток (титр 1:200 и выше) выявлен у онкологических больных (10,9%), детей (7,9%), больных с различной инфекционной патологией (2,2%), сельских жителей (0,1%), животноводов (1,2%). Таким образом, результаты серологических обследований несут определенную информацию о контакте различных групп населения или групп риска с возбудителем, но не позволяют с высокой степенью диагностировать листериоз даже при применении нескольких серологических методов. Наиболее перспективным для специфичной диагностики листериоза представляется определение антител к секретируемому фактору патогенности листерий - листериолизину О . Концевой полипептидный фрагмент рекомбинантной молекулы листериолизина О был наиболее специфичен при скрининге сывороток больных листериозом людей по сравнению с другими белковыми антигенами (53,59,75). Гуморальный ответ на другие белковые антигены листерий, связанные с патогенностью: JnlA, InlB и ActA был гетерогенен и не отличался специфичностью при анализе сывороток доноров и больных листериозом . Но даже эту более специфичную методику рекомендуют использовать для выявления неинвазивных бессимптомных форм болезни при эпидемических вспышках листериоза.
Приготовление лизатов клеток листерий для проведения ПЦР
В работе использовались олигонуклеотидные праймеры, перечисленные в таблице 2. Реакционная смесь имела следующий состав: 750mM Tris-HCl рН 8.8, 200тМ (NH4)2S04, 0.1% Tween 20, 1.5 тМ MgCl для пары Р1с-1, Р1с-2, по 1тМ дезоксинуклеотидофосфатов(ёАТР, dCTP, dGTP,dTTP), по 15 пмоль для пары Р1с-1, Р1с-2, клеточные лизаты. Общий объем реакционной смеси составлял 25 мкл. На смесь наслаивали минеральное масло в объеме 15 мкл. Использовалась Taq-полимераза фирмы «Бионем». Амплификация проводилась в термоциклере Терцик (ДНК-технология) по программе быстрого регулирования:
для пары Plcl, Р1с2 - прогревание - 94С- 2 мин., затем 5 циклов: 94С-5", 55 С - 5", 72С - 5", затем 25 циклов - 94С- 1", 55 С - 1", 72С -1".
Для пары Prsl, Prs2 -прогревание - 94С- 2 мин., 5 циклов: 94С- 5", 42 С-5",72С - 5", затем 25 циклов-94С-Г , 42С-1", 72С -1". Для пары Lmp3, Lmp4 -: 94С - 2 мин, затем пять циклов: 94С - 20 с, 60С - 20 с, 72С - 20 с, и еще 30 циклов: 94С - 5 с, 60С - 5 с, 72С - 5 с. Амплифицированную ДНК анализировали гель-электрофорезом в 1% агарозном геле в трис-ацетатном буфере в присутствии 0,5 мкг/мл бромистого этидия.
Таблица Наименование Нуклеотидный состав праймера Характеристика мишени
PLC1 AGGGGGCCATTTTGTATAAG Направляют амплификацию участка, размером 474 н.п., гена фосфатидилинозитол-специфичной фосфолипазы С plcA
PLC2 A ICGTTGCTGTTiTGCTCGT PRS1 GCATTGCG1 GAAGC l GGCGCAAC Фрагмент размером 211 н.п. гена prs, кодирующего белок фосфорибозилпирофосфатсинтазу, не связанного с вирулентностью, консервативного для всех видов листерий
PRS2 CAGAAGCATTTTCATGAAC LMP3 CATGTTGTTCGCACCCAGTTC Фрагмент хромосомы L. monocytogenes, размером 2862 н.п., содержащий гены prfA и ріс А, кодирующие регуляторный белок PrfA и фосфолипазу PI-PLC; и фрагмент гена My, кодирующий листериолизин О
К 50 мкл ПЦР-продукта добавляли 50 мкл воды и 90 мкл теплого раствора 20% ПЭГ6000-2.5 М NaCl. Смешивали на Vortexe. Инкубировали 10 мин при 37С. Осаждали на микроцентрифуге 5 мин при максимальных оборотах. Добавляли 200мкл 75% этанола, не взбалтывая осадок. Центрифугировали 1 мин, удаляли этанол. Сушили на столе 5-10 мин. Суспендировали осадок в 10-40 мкл деионизованной воды в зависимости от концентрации ампликона. 3.3.4 ПЦР-рестрикционный анализ.
Рестрикцию ДНК осуществляли эндонуклеазами Hind III, Cla I, BamH I, EcoR I производства Fermentas (Литва) в соответствующих буферах в объеме 20 мкл в течение двух часов при 37С: 10 мкл ПЦР-продукта, 2 мкл буфера, 1мкл рестриктазы и 7 мкл деионизованной воды. Рестрицированную ДНК анализировали гель-электрофорезом в 0,8% агарозном геле в трис-ацетатном буфере в присутствии 0,5 мкг/мл бромистого этидия.
Для секвенирования были использованы праймеры. Секвенирование проводилось в Центре Совместного Пользования «Геном». Сравнение последовательностей и анализ присутствия сайтов рестрикции осуществлялось с помощью программ PCGene и Clone. Исходная последовательность использованного района листериозной хромосомы была получена из базы данных генома штамма EGD, находящейся в институте Пастера.
Выделение листерий из продуктов питания и дальнейшая идентификация общепринятыми микробиологическими методами
Следующим этапом стала отработка схемы выделения листерий из продуктов питания. Для этого в подготовленные флаконы со 125 мл бульона для выделения листерий (Listeria Selective Broth) после стерилизации вносили селективные добавки непосредственно перед внесением образца. Измельченный в асептических условиях продукт добавляли к подготовленному бульону и интенсивно перемешивали. Инкубировали в течение суток при 30С. Из каждого флакона петлей переносили на Oxford агар или PALCAM. Инкубировали 48 ч и выявляли колонии с потемнением среды вокруг.
После инкубирования (см.«Материалы и методы») производили отбор подозрительных характерных колоний (с потемнением). Не менее 5 колоний из каждого образца пересевали на триптико-соевый агар с дрожжевым экстрактом до отдельных колоний, так как на селективных средах с антибиотиками сопутствующие микроорганизмы могут проявлять слабый рост, но присутствовать вместе с листериями. Однако, после пересева на питательный агар для получения чистой культуры и последующей микроскопии не все микроорганизмы оказывались грамположительной палочкой. Потемнение вызывали и грамположительные кокки (по литературным данным энтерококки). Однако потемнение среды, вызываемое энтерококками, имело зеленоватый оттенок в отличие от буро-коричневого, вызываемого листериями.
Родовая и видовая принадлежность выделенных культур подтверждалась бактериологическими методами (таблица 5), а так же с применением API Listeria тестов (BioMerieux, Франция). Все штаммы были каталазоположительными, что отличает листерий от представителей родов Lactobacillus и Erysipelothrix . 54 Для определения подвижности культур, непосредственно перед уколом в полужидкий агар пробирки со средой прогревали в термостате до 37С (те, которые будут инкубированы при 37С). В противном случае результаты после инкубирования нельзя было учесть: рост культур был расплывчат, смазан, и подвижность наблюдалась как при 20С, так и при 37С. После того, как этот момент был учтен, и среда стала подвергаться предварительному прогреванию до температуры инкубации, подвижность типовых штаммов L. monocytogenes стала четко различаться при разных температурах: все штаммы L. monocytogenes были подвижны при температуре 20С и однозначно неподвижны при 37С. Все выделенные штаммы, охарактеризованные совокупностью методов как L. monocytogenes, демонстрировали подвижность, аналогичную типовым, т.е. были подвижны при 20С и неподвижны при 37С.
Е я Гемолиз наблюдался на чашках с кровью у всех штаммов L.monocytogenes, кроме одного (GIM 16).
В таблице 5 приведены данные о ферментации трех Сахаров, входящих в цветной ряд API Listeria и рекомендованных для внутривидовой дифференциации. Все проверенные нами штаммы L.monocytogenes ферментировали рамнозу и практически все (93%) L.innocua также ферментировали данный сахар. Проверенные же нами штаммы и L.monocytogenes, и L.innocua не ферментировали маннит и ксилозу. Согласно полученным результатам, по гидролитической активности в отношении лишь трех Сахаров, L.monocytogenes невозможно дифференцировать от непатогенного вида L. innocua.
Таким образом, в работе было проверено 172 образца продуктов питания. Из них: мяса и фарша - 48; колбасных изделий, сосисок, ветчины - 44; молочных продуктов, сыра и творога - 39; кур, куриной кулинарии (фарш, котлеты, шницель) - 21; овощных салатов - 10; рыбы - 10. В результате было выделено 49 культур листерий. Из них: Listeria monocytogenes - 14 штаммов (8%), Listeria innocua - 32 штамма (18,5%), Listeria welshimeri - 3 штамма (менее 2%).
