Введение к работе
Актуальность проблемы
Последние 20 лет характеризуются существенным увеличением интереса ученых и клиницистов к листериозной инфекции. Он обусловлен многочисленными эпидемическими вспышками листериоза в развитых странах (Франция, США, Германия, Испания и т.д.), связанными с употреблением в пищу продуктов, контаминированных листериями. В то время как до 1980-х годов листериоз был относительно редкой инфекцией, регистрируемой преимущественно среди людей, связанных с животноводством, в настоящее время он является одной из ведущих пищевых инфекций в Европе и Америке с летальностью до 20-40% (ВОЗ, 1988, Farber J.M., Peterkin P.I., 1991). Причины подобного изменения эпидемической ситуации до сих пор остаются до конца невыясненными. Отчасти, увеличение заболеваемости листериозом связано с длительным хранением пищевых продуктов при низкой температуре, что способствует размножению в них листерий при первично слабой контаминации ими. С другой стороны, нельзя исключать возможности изменения свойств штаммов листерий, циркулирующих в окружающей среде и представляющих опасность для человека.
В Российской Федерации заболеваемость листериозом у людей регистрируется с 1991 г. (Опочинский Э.Ф., 2001, Тартаковский И.С. и др., 2002). Однако официальная статистика (40-100 случаев в год) не отражает реального состояния заболеваемости листериозом, что обусловлено не только разнообразием клинических форм болезни, но также недостаточной осведомленностью врачей об особенностях проявления этой инфекции и нехваткой недорогих отечественных селективно-дифференцирующих сред и тест-систем для ее лабораторной диагностики.
Наряду с этим проблема листериоза становится все более актуальной в связи с увеличением случаев заражения его возбудителем людей со сниженным Т-клеточным звеном иммунитета. Одним из важных остается вопрос о распространении листериозной инфекции у беременных женщин, в связи с возможностью внутриутробного инфицирования плода, часто сопровождающегося абортами, мертворождениями и высокой летальностью среди новорожденных.
Основная масса эпидемических вспышек пищевого листериоза, зарегистрированных начиная с 1982 г., связана с этиологическим значением относительно узкой филогенетической группы внутри вида Listeria monocytogenes, характеризующейся принадлежностью к серогруппам 4b (около 90% эпидемических случаев), 1/2a и 1/2b. Однако до сих пор неизвестно, какие именно свойства эпидемических штаммов L.monocytogenes обусловливают их высокую опасность. Остаются невыясненными биологические особенности L.monocytogenes, обитающих в разных экологических условиях. Особый интерес представляет вопрос о патогенных свойствах листерий, выделяемых из продуктов питания и объектов окружающей среды.
Практически отсутствуют работы, в которых была бы отражена характеристика листерий, обитающих в природе, а также дано сравнение их с эпидемически значимыми штаммами, что в настоящее время представляется важным ввиду возможности заноса высоковирулентных штаммов L.monocytogenes в окружение человека из природных очагов.
Решение перечисленных вопросов, связанных с биологией и вирулентностью возбудителя листериоза, а также с закономерностями эпидемического процесса этой инфекции, может быть осуществлено на основе микробиологического и молекулярно-генетического мониторинга за возбудителем с применением эффективных методов диагностики и созданием современных систем для типирования штаммов листерий. Все вышесказанное определило направление исследований, предпринятых в данной работе.
Цель работы: разработать систему микробиологических и молекулярно-генетических маркеров, позволяющую выявлять высоковирулентные штаммы L. monocytogenes, необходимую для контроля распространения листериозной инфекции.
Задачи исследования:
-
Разработать комплекс методов и средств для выделения и идентификации бактерий рода Listeria из различных источников окружающей среды, получить коллекцию дальневосточных штаммов листерий.
-
Дать характеристику микробиологических свойств и патогенного потенциала штаммов L.monocytogenes, изолированных из различных источников в Дальневосточном регионе России, и провести их сравнительный анализ со штаммами L.monocytogenes, выделенными в Европейской части России. В экспериментальных условиях установить влияние абиотических факторов на вирулентность штаммов L.monocytogenes.
-
Изучить молекулярно-генетические особенности штаммов L.monocytogenes, выделенных из различных объектов на Дальнем Востоке и в Европейской части России, и дать оценку их эпидемологической значимости.
-
Выявить генетические маркеры, характерные для эпидемически значимых штаммов L.monocytogenes.
-
На основе особенностей генетического полиморфизма штаммов разработать систему типирования L. monocytogenes и дать филогенетическую характеристику бактерий вида L.monocytogenes, распространенных на Дальнем Востоке Российской Федерации.
Научная новизна и теоретическая значимость работы
Выявлено генетическое разнообразие бактерий рода Listeria, распространенных на Дальнем Востоке Российской Федерации, в том числе патогенного вида L.monocytogenes. Показано преобладание в данном регионе сероварианта 4b, опасного в эпидемическом плане для людей. Создана коллекция дальневосточных штаммов бактерий рода Listeria.
Впервые доказано, что, несмотря на сходство морфологических, культуральных и биохимических свойств, штаммы L.monocytogenes из дальневосточной и европейской частей РФ могут быть дифференцированы с помощью методов молекулярно-генетического типирования. Установлены существование регион-специфического распределения штаммов L.monocytogenes на территории РФ, а также поликлональность распределения штаммов этого вида внутри регионов (Европейская часть РФ, Дальний Восток).
Впервые в сравнительном аспекте изучены гены, кодирующие факторы адгезии и инвазии - белки семейства интерналинов (inlA, inlB, inlC, inlE, inlG, inlH, inlF), белки ActA, Auto у штаммов L. monocytogenes, выделенных на Дальнем Востоке и в Европейской части России из различных источников. Определены последовательности генов inlA, inlB, inlC, inlE, prs у штаммов L.monocytogenes, часть из которых (345 фрагментов) депонированы в базу данных международного GenBank.
Установлено, что штаммы L.monocytogenes, выделенные из эукариотических организмов, включая человека, имеют гены inlA, inlB, inlC, inlE, независимо от региона выделения; гены inlF, inlG, inlH являются штаммоспецифическими.
Впервые установлена корреляция между развитием внутриутробной инфекции и аллелем фрагмента генов inlA и inlC, кодирующего функционально-значимый домен (LRR-домен) факторов инвазии InlA и InlC, у штаммов L.monocytogenes. Высказано предположение о том, что развитие внутриутробной листериозной инфекции плода у беременных женщин может быть связано с определенными вариантами белков InlA и InlC возбудителя. Получены свидетельства значимости генов inlA и inlC как маркеров штаммов L.monocytogenes, представляющих повышенную опасность для развития листериоза у плода.
Впервые показано, что выявленные среди диких грызунов и морских гидробионтов штаммы L.monocytogenes могут обусловливать внутриутробную инфекцию у человека, что предполагает возможность заноса вирулентных штаммов L.monocytogenes из окружающей среды в антропогенные системы.
Выявлено изменение адгезивных свойств бактерий рода Listeria, включая вид L. monocytogenes различных серовариантов, под влиянием температуры, кислотности среды (рН) и экзогенной дезоксирибонуклеиновой кислоты. Установлено, что при температуре 4-80С, рН = 6,0 и 8,0 повышаются, а при температуре 370С и рН = 9,0 снижаются адгезивные свойства L. monocytogenes.
Теоретическая значимость работы определяется тем, что впервые в сравнительном аспекте представлена комплексная характеристика микробиологических и молекулярно-генетических особенностей бактерий вида L.monocytogenes, выделенных из различных объектов на территории Дальнего Востока и Европейской части России. Установлены молекулярно-генетические маркеры, характеризующие высоковирулентные штаммы L.monocytogenes. Полученные результаты имеют фундаментальное значение для микробиологии и эпидемиологии, поскольку расширяют представление о патогенных бактериях рода Listeria, распространенных на территории Российской Федерации, а также дополняют и уточняют знания о развитии инфекционного процесса при листериозной инфекции.
Практическая значимость работы
Предложена модифицированная схема выделения и идентификации листерий с использованием сконструированных для этих целей запатентованных дифференциально-диагностической среды для листерий, комплексной индикаторной среды для дифференциации бактерий рода Listeria, питательной среды на основе молок лососевых рыб (жидкой, сухой и плотной) для культивирования бактерий. Создана коллекция дальневосточных штаммов бактерий рода Listeria. Разработанные среды и диагностические методы рекомендованы для проведения мониторинга за возбудителем листериоза в бактериологических лабораториях санитарно-эпидемиологического и ветеринарного надзора, а также в лечебно-профилактических, научно-исследовательских и учебных учреждениях как для целей диагностики инфекционных заболеваний человека и животных, так и для целей сертификации продуктов питания.
Предложен оригинальный метод генетического типирования изолятов L.monocytogenes на основании последовательностей фрагментов генов inlA, inlB, inlC, inlE и prs, позволяющий дифференцировать эпидемически несвязанные изоляты листерий с индексом дискриминации 0,982.
На основе полимеразной цепной реакции разработан способ детекции специфических для L.monocytogenes генов, кодирующих белки-интерналины (inlA, inlB, inlC, inlE). Результаты комплексного изучения генов, кодирующих белки-интерналины, могут служить базой для анализа принадлежности штаммов листерий к определенной филогенетической линии и для оценки их эпидемиологической значимости.
Установлен спектр антимикробных препаратов, к которым резистентны штаммы L.monocytogenes, выделенные на Дальнем Востоке, что позволяет совершенствовать рациональную схему этиотропной терапии листериоза у больных.
Полученные результаты микробиологических и молекулярно-генетических исследований могут быть использованы в исследованиях при изучении факторов патогенности L.monocytogenes, а также при создании новых диагностических и терапевтических препаратов.
Депонированные в GenBank нуклеотидные последовательности штаммов L.monocytogenes имеют значение при проведении научных исследований, поскольку они могут быть использованы при типировании вновь выделенных штаммов L.monocytogenes, а также для уточнения данных об их происхождении и для установления связи различных генетических вариантов с течением и проявлениями листериозной инфекции.
Основные положения, выносимые на защиту:
-
Существует полиморфизм факторов инвазии - семейства белков-интерналинов - у L.monocytogenes, основного возбудителя листериоза. Все культуры L.monocytogenes, выделенные из эукариотических организмов, независимо от региона изоляции, обладают генами inlA, inlB, inlE, inlC.
-
Молекулярно-генетическое типирование L. monocytogenes на основании полиморфизма генов inlA, inlB, inlE, inlC и prs позволяет дифференцировать филогенетически удаленные штаммы, штаммы, циркулирующие в географически удаленных областях, а также эпидемически несвязанные между собой изоляты листерий.
-
Для L. monocytogenes, выделенных на территории РФ, характерны регион-специфическое распределение штаммов и поликлональность распределения штаммов внутри регионов (Европейская часть РФ, Дальний Восток).
-
Имеется связь между филогенетическим положением штамма L.monocytogenes и его эпидемиологическим потенциалом. Среди L. monocytogenes из клинического материала, от грызунов и морских гидробионтов преобладают штаммы листерий, относящиеся к первой филогенетической линии; среди L. monocytogenes из продуктов питания доминируют штаммы, относящиеся ко второй филогенетической линии.
-
Эпидемически значимые штаммы L.monocytogenes, вызывающие внутриутробную листериозную инфекцию плода у человека, распространены в объектах окружающей среды в Дальневосточном регионе, в том числе среди диких грызунов, морских гидробионтов и в пищевых продуктах, реализуемых в торговой сети.
-
Выявлена корреляция между нуклеотидной последовательностью аллелей генов, кодирующих определенные факторы инвазии, и частотой выделения несущих эти последовательности штаммов L.monocytogenes от разных хозяев.
Материалы диссертации были использованы при подготовке:
-
Информационно-методического письма «По правилам взятия, доставки, методам лабораторных исследований материала от больного с подозрением на ООИ, сроки выдачи результатов» авторов Кизиловой М.Д., Коленченко Г.Н., Просянниковой М.Н., Зайцевой Е.А. Разработано и одобрено Лабораторным советом ФГУ ЦГСЭН в Приморском крае (Решение № 1 от 25.04.02.). Владивосток. – 2002.
-
Методических рекомендаций «Лабораторная диагностика листериоза» авторов Е.А.Зайцевой, Г.П. Сомова, Л.С. Бузолевой, Т.А. Глазыриной. Утверждено руководителем ТУ Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека по Приморскому краю. Владивосток. – 2006.
-
Информационного письма «Listeria monocytogenes – новый микробиологический показатель опасности пищевых продуктов» авторов Л.Н.Федяниной, Е.А.Зайцевой, Т.Н. Каленик, В.Б.Светлова. Утверждено руководителем ТУ Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека по Приморскому краю. Владивосток. – 2006.
-
Методического пособия для бактериологов «Питательные среды для изоляции, типирования и идентификации бактерий рода Listeria» авторов Е.А. Зайцевой, Г.П.Сомова, Л.Н.Фатеевой, Г.Г. Компанец, Н.Г. Плеховой. Утверждено руководителем Управления Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека по Приморскому краю. Владивосток. – 2008.
-
Патента № 2184782 Российской Федерации. Дифференциально-диагностическая среда для выделения листерий / Глазырина Т.А., Бузолева Л.С., Зайцева Е.А., Сомов Г.П./ Заявитель и патентообладатель: НИИ эпидемиологии и микробиологии СО РАМН. Заявл. 2.11.1999. Опубл. 10.07.2002.
-
Патента № 2303060 Российской Федерации. Комплексная индикаторная среда для дифференциации бактерий рода Listeria /Зайцева Е.А., Глазырина Т.А., Сомов Г.П./ Заявитель и патентообладатель: ГУ НИИ эпидемиологии и микробиологии СО РАМН. Заявл. 28.12.2005. Опубл. 20.07.2007.
-
Заявки на изобретение № 2008111691/13 (012634) МПК7 C 12 N 1/20, C 12 Q 1/04. «Питательная среда для культивирования бактерий» /Зайцева Е.А., Фатеева Л.Н., Кривошеева А.М., Сомов Г.П. /Заявитель и патентообладатель: НИИ эпидемиологии и микробиологии СО РАМН. Заявл. 26.03.2008.
-
Заявки на изобретение № 2008132232 МПК7 C 12 N 1/20, C 12 Q 1/04 «Питательная среда для культивирования бактерий (ее варианты)» /Зайцева Е.А., Фатеева Л.Н., Сомов Г.П. /Заявитель и патентообладатель: НИИ эпидемиологии и микробиологии СО РАМН. Заявл. 4.08.2008.
Апробация материалов диссертационной работы:
Основные положения диссертации были представлены на конгрессах и конференциях международного, российского и регионального уровня: II Дальневосточном конгрессе «Человек и лекарство» с международным участием (Владивосток, 2005); Всероссийском конгрессе «Оптимальное питание – здоровье нации»: к 75-летию Государственного учреждения Научно-исследовательского института питания РАМН (Москва, 2005); Российской научно-практической конференции «Генодиагностика инфекционных болезней» («Сосновка», Новосиб. обл., 2005); III Российской научно-практической конференции с международным участием «Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера» (Новосибирск, 2006); 13 международном конгрессе по приполярной медицине (Новосибирск, 2006); 11th International Symposium on Microbial Ecology (Вена, Австрия, 2006); 2nd FEMS Congress of European Microbiologists (Madrid, Spain, 2006); 16th International Symposium on Problems of Listeriosis. ISOPOL XVI (Savannah, Georgia, США, 2007); 9th Symposium on Bacterial Genetics and Ecology (Wernigerode, Германия, 2007); 5th World Congress of the World Society for Pediatric Infectious Diseases (Bangkok, Thailand, 2007); 6-ой Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молекулярная диагностика – 2007»; Всероссийской научной конференции «Теоретические основы эпидемиологии. Современные эпидемиологические и профилактические аспекты инфекционных и массовых неинфекционных заболеваний» (Санкт-Петербург, 2008); 4 международной конференции «Идеи Пастера в борьбе с инфекциями», посвященной 85-летию Санкт-Петербургского НИИЭМ им. Пастера и 120-летию Парижского института Пастера (Санкт-Петербург, 2008); научно-практической конференции с международным участием «Роль вирусных и бактериальных инфекций в формировании перинатальной и соматической патологии у детей» (Хабаровск, 2008).
Публикации. Основные положения диссертации отражены в 62 научных публикациях, в том числе: 6 – в международной печати, 18 - в журналах, рекомендованных ВАК для публикации материалов докторских диссертаций, а также в 3 информационных письмах, 2 патентах на изобретение, 2 заявках на изобретение, 1 пособии для бактериологов, 1 методических рекомендациях.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, главы обзора литературы, 5 глав собственных исследований, заключения, выводов, рекомендаций для внедрения результатов исследования в медицинскую науку и практическое здравоохранение, списка использованной литературы. Работа изложена на 312 страницах машинописного текста, содержит 41 таблицу, 36 рисунков. Список цитированной литературы включает 459 источников, из которых – 121 отечественных и 338 - иностранных авторов.
