Формирование коллекции природных микромицетов и выявление штаммов с антибактериальными и москитоцидными свойствами Юскевич Виктория Викторовна

Введение к работе

Актуальность проблемы. Микроскопические грибы привлекают всё более пристальное внимание биотехнологов. Они продуцируют биологически активные вещества (БАВ) различной химической природы и специфики действия (антибиотики, ферменты, липиды, алкалоиды и другие метаболиты), нашедшие применение в сельском хозяйстве (Коломбет, 2007), медицине (Holliday, Cleaver, 2008) и пищевой промышленности (Сас- сон, 1987). Доля метаболитов грибов составляет более 50% от всех открываемых биологически активных природных соединений (Бибикова, Катлинский, 2008). Число известных видов грибов увеличивается с каждым годом (Hibbett, 2011) и, вероятно, достигает 1,5 миллионов видов (Hawksworth, 2001). Однако большинство видов микроскопических грибов остаётся ещё слабо изученным и невостребованным потенциалом.

Коллекции чистых культур являются важнейшими средствами для сохранения микробиологических ресурсов и поиска высокоэффективных штаммов грибов - антагонистов, перспективных для создания новых биопрепаратов. В ГНЦ ПМБ сформирована рабочая коллекция мицелиальных грибов. Коллекция создана на основе изолятов из погибших насекомых и образцов почв, собранных в ходе экспедиций в заповедники разных регионов России и СНГ. Целью этих экспедиций являлось создание коллекции культур энтомопатогенных и почвенных грибов из разных природно-климатических зон для последующего их изучения как возможных продуцентов биологически активных веществ. Значительная часть коллекции грибных культур состоит из представителей родов, использующихся в биотехнологической промышленности (при производстве средств защиты растений, антибактериальных препаратов, ферментов и т. д.). Представители рода Cordyceps являются богатыми источниками биологически активных веществ и издавна применяются в традиционной китайской медицине (Holliday, Cleaver, 2008). Экстракты, выделенные из культуры этого гриба, проявляют антиоксидантные, иммуномодулирующие, гипогликемические, гипотензивные, сосудорасширяющие и противораковые свойства, препятствуют процессам старения (Бабицкая и др., 2009).

При проведении научно-исследовательских работ в ГНЦ ПМБ выявлен ряд грибов, обладающих активностью против патогенных микроорганизмов, таких как Staphylococcus aureus, Serratia marcescens, Pseudomonas fluorescens, Bacillus cereus и Candida albicans, а также особо опасных патогенов Bacillus anthracis и Francisella tularensis. Кроме того, выявлен ряд штаммов и их метаболитов, активных в отношении личинок кровососущих комаров, которые могут быть использованы для производства инсектицидов нового поколения, не содержащих живых культур. В коллекции содержится также большое количество условно - патогенных грибов, которые могут быть использованы в качестве тест-культур для поиска продуцентов новых противогрибных препаратов.

Главной задачей любой микробиологической коллекции является поддержание и сохранение биологического материала в условиях, обеспечивающих неизменность основных свойств штаммов. Штаммы некоторых видов грибов, заложенные на хранение традиционными методами, не удается сохранить даже на протяжении одного-двух лет. Необходима дополнительная работа по оптимизации защитных сред и режимов заклад-

ки на хранение, а также по выбору питательных сред и стадий развития гриба, обеспечивающих наибольшую стабильность в процессе хранения.

Одним из перспективных для длительного хранения мицелиальных культур можно считать метод контактно-сорбционного обезвоживания (КСО). В ГНЦ ПМБ разработан метод КСО с применением ионообменной смолы для бактериальных штаммов (Пат. SU 1831498 А3, 1991). Экспериментально показано, что данный метод применим и для большинства видов мицелиальных грибов. Метод не является энергоемким, не требует сложного технологического и лабораторного оборудования и может быть использован даже в полевых условиях.

Цель исследования - формирование коллекции природных микромицетов, изучение биологических свойств коллекционных культур и отбор штаммов, перспективных для разработки новых бактерицидных, фунгицидных или москитоцидных препаратов.

Задачи исследования:

1. Сформировать коллекцию мицелиальных грибов. Идентифицировать выделенные культуры.

2. Усовершенствовать состав питательной среды для выделения и культивирования мицелиальных грибов.

3. Определить стадии развития грибов, оптимальные для закладки их на длительное хранение.

4. Адаптировать метод контактно-сорбционного обезвоживания для длительного хранения мицелиальных грибов разных таксономических групп.

5. Провести исследование коллекции микромицетов на наличие продуцентов биологически активных веществ, перспективных для разработки новых бактерицидных, фунги- цидных и москитоцидных препаратов.

Научная новизна:

Создана коллекция паспортизованных штаммов мицелиальных грибов, являющаяся основой для разработки новых антибактериальных и москитоцидных препаратов.

Показано, что метод контактно-сорбционного обезвоживания обеспечивает длительное хранение (не менее 5 лет) мицелиальных грибов разных таксономических групп без утраты их свойств.

Впервые установлено, что грибы Calcarisporium arbuscula Preuss, Clonostachys candelabrum (Bonord.) Schroers и их метаболиты обладают москитоцидными свойствами.

Установлено, что 19 штаммов грибов, относящихся к классу Ascomycetes, обладают одновременно москитоцидными, бактерицидными и фунгицидными свойствами.

Практическая значимость:

В государственную коллекцию «ГКПМ - Оболенск» депонированы 38 штаммов мицелиальных грибов с высокой антагонистической или москитоцидной активностью.

Разработаны методические подходы для долгосрочного хранения мицелиальных грибов, включающие состав питательной среды, стадии развития грибной культуры и метод КСО.

148 культур грибов депонированы и включены в каталог центральной коллекции энтомопатогенных грибов Департамента сельского хозяйства США - ARSEF (международный уровень внедрения) .

Положения, выносимые на защиту:

5. 1. Созданная рабочая коллекция микромицетов, насчитывающая 1336 паспортизованных штаммов, является потенциальным источником для отбора штаммов - продуцентов биологически активных веществ.

   2. Метод контактно-сорбционного обезвоживания пригоден для длительного хранения мицелиальных грибов разных таксономических групп.

   3. Усовершенствованная питательная среда обеспечивает рост и спорообразование 320 видов микромицетов.

   4. Микромицеты, обладающие антагонистической активностью: 120 штаммов с фунгицидной активностью в отношении C. albicans, 202 штамма - антагониста S. aureus, S. marcescens или B. cereus; 105 штаммов - антагонистов B. anthracis, 95 штаммов - антагонистов F. tularensis и 182 штамма с москитоцидной активностью.

   Работа выполнена в отделе коллекционных культур ФБУН ГНЦПМБ в рамках отраслевой научно-исследовательской программы «Научные исследования и разработки с целью обеспечения санитарно-эпидемиологического благополучия и снижения инфекционной заболеваемости в Российской Федерации» (на 2011-2015 гг.): НИР 035 «Идентификация и изучение биологических, молекулярно-генетических, биохимических характеристик возбудителя туляремии, в том числе культур с атипичными свойствами», номер гос. регистрации 01201172652; НИР 042 «Совершенствование деятельности коллекции ФБУН ГНЦ ПМБ в соответствии с современными достижениями науки и технологии», номер гос. регистрации 01201172659; НИР 045 «Разработка и исследование новых дезинфектантов, антимикробных и инсектицидных препаратов», номер гос. регистрации 01201172662; в рамках ФЦП «Национальная система химической и биологической безопасности Российской Федерации (2009 - 2014 годы)»: государственный контракт № 39-Д от 30.05.2012 «Разработка средств обеззараживания сибиреязвенных почвенных очагов с использованием новых композиций дезинфектантов и биологических препаратов», номер гос. регистрации 01201267512.

   Личный вклад соискателя. Диссертационная работа выполнена лично автором. Экспериментальные результаты, представленные в отдельных главах, получены совместно с сотрудниками ФБУН ГНЦ ПМБ: к.б.н. Л. И. Володиной, к.б.н. В. Е. Лиховидо- вым, Е. В. Быстровой, к.б.н. А. Н. Наумовым, Е. М. Асланян, Н. А. Коробовой, к.м.н. Л. И. Марининым, к.б.н. Н. А. Шишковой, д.б.н. В. М. Павловым, Г. М. Вахрамеевой, к.б.н. Е. И. Асташкиным, к.б.н. Д. М. Пачкуновым; а также к.б.н. А. В. Александровой (МГУ) и Б. А. Борисовым (ИПЭЭ РАН).

   Апробация работы. Материалы диссертации представлены на семи российских и международных конференциях: VII-й Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ «Чрезвычайные ситуации международного значения в общественном здравоохранении в решениях Санкт-Петербургского саммита государств «группы восьми» и санитарная охрана территорий государств-участников содружества независимых государств» (3-5 октября 2006 г., Оболенск, Московская обл.); Международной конференции «Горные экосистемы и их компоненты» (13-18 сентября 2007 г., Нальчик); Междисциплинарном Микологическом Форуме ( 23 апреля 2009 г., Москва); Международной конференции «Почвы и растительный мир горных территорий» (24-29 августа 2009г., Нальчик); Международной научно - практической конференции «Интегрированная защита растений: стратегия и тактика» (5-8 июля 2011 г., Минск); Международном научном симпозиуме «Защита растений: проблемы и перспективы» (29-31 октября 2012 г., Кишинёв); Третьем съезде микологов (12-15 октября 2012 г., Москва).

   План и аннотация диссертации обсуждены и одобрены на заседании Учёного совета ГНЦ ПМБ от 15 ноября 2007 г. (протокол № 8, приказ № 135 от 30.11.2007 г.) с изменениями, утверждёнными на заседании Учёного совета ГНЦ ПМБ от 19 ноября 2012 г. (протокол № 11). Результаты исследований доложены на заседании межлабораторного семинара ГНЦ ПМБ (протокол № 27 от 19 ноября 2012 г.).

   Публикации. Основное содержание работы отражено в 11 научных публикациях, в том числе в одной статье, опубликованной в рецензируемом журнале, рекомендованном ВАК.

   Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 205 страницах машинописного текста и включает следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты и обсуждения, выводы и список литературы, включающий 101 работу отечественных и 123 работы зарубежных авторов, список сокращений и четыре приложения. Работа иллюстрирована 59 рисунками и 14 таблицами. Приложения состоят из списка видов микромицетов, хранящихся в коллекции (А); 38 справок о депонировании (Б); списка штаммов, депонированных в американскую коллекцию энтомопатогенных грибов - ARSEF (В) и списка публикаций по теме диссертации (Г).

   Похожие диссертации на Формирование коллекции природных микромицетов и выявление штаммов с антибактериальными и москитоцидными свойствами

   

   Экспериментальное изучение антагонистических свойств штамма бактерий Bacillus pumilus "Пашков"Гринько Ольга Михайловна

   

   Биологические свойства штаммов Bacillus anthracis, выделенных в очагах сибирской язвы Ставропольского краяЛысогора Елизавета Вильевна

   

   Оценка адгезивных свойств штамма Yersinia pestis EV НИИЭГ на модели эритроцитовИвонин Алексей Геннадьевич

   

   Молекулярно-генетические свойства штаммов холерного вибриона эльтор с различной эпидемической значимостьюКостромитина Елена Александровна

   

   Изучение свойств штаммов Escherichia coli M-17 и bacillus subtilis 1719 на модели экспериментального дисбиозаГайдеров Андрей Александрович

   

   Особенности некоторых биологических свойств штаммов Escherichia coli, выделенных от онкологических больных с инфекционными осложнениямиБилалов Фаниль Салимович

   

   Биологические свойства штаммов K. pneumoniae и S. aureus, выделенных в виде монокультур и ассоциаций, при дисбактериозах кишечника у детей с бронхолегочной патологией Очилова Рагна Амирьяновна

   

   Биологические свойства штаммов Bacillus subtilis, перспективных для создания новых пробиотиковГатауллин Айрат Гафуанович

   

   Иммунобиологические свойства рифампицинрезистентного штамма В. abortus 82 Уразов Тимур Наилевич

   

   Изучение биологических свойств рекомбинантных штаммов Salmonella Enteritidis, экспрессирующих НВс-антиген вируса В с эукариотического и прокариотического промоторов [Электронный ресурс]Донин Михаил Васильевич