Введение к работе
Актуальность проблемы. Burkkolderia mallei и Burkholderia pseu-domallei вызывают заболевания сап и мелиоидоз, признаваемые как самостоятельные нозологические единицы. Эти возбудители относятся ко II группе патогенности и, по мнению отечественных и зарубежных специалистов, являются потенциальными агентами биотерроризма (Wheelis М, 1998; Leha-vi О., et al., 2002; Алексеев В.В. с соавт., 2003; Bossi P. et al., 2004; Ruppitsch W. et al., 2007). Исследовательские работы с использованием патогенных биологических агентов создают реальную опасность внутрилабораторных заражений персонала, а также угрозу аварий на объектах, где проводятся работы с патогенными микроорганизмами (Srinivasan A. et al., 2001; Currie В. J. et al., 2003).
Сегодня в мире проблема сапа не стоит так остро, как ранее, что связано с уменьшением численности лошадей, являющихся основным резервуаром этой инфекции, однако сап по-прежнему наносит значительный экономический урон в крупных животноводческих хозяйствах Турции, Ирана, Объединенных Арабских Эмиратов, Афганистана, Индии, Китая, Монголии, а также стран Африки и Латинской Америки (Arun S. et al., 1999; Anuntagool N. et al. 2002; Nierman W.C. et al. 2004; Harvey S.P. 2005; Scholz H.C. et al., 2006). Заболеваемость сапом среди людей носит, в основном, спорадический характер. В то же время, возбудитель сапа крайне опасен в лабораторных условиях. Это подтверждает трагический опыт большого количества исследователей сапа (Вышелесский С.Н., 1909; Srinivasan A. et al., 2001).
Ранее считалось, что мелиоидоз единственное заболевание, вызываемое буркхольдериями, распространение которого в природе имеет определенные географические границы: оно эндемично лишь для Австралии и стран Юго-Восточной Азии (Cravitz L. 1950; Rogul М. et al., 1970; Ширяева Д.Т. 1976). На сегодняшний день эта точка зрения изменилась. В настоящее время мелиоидоз обнаружен далеко за пределами эндемичных территорий Азии и Австралии (Cheng А. С, 2005), спорадические случаи и очаги мелиоидоза выявлены в странах Центральной и Южной Америки, Западной Африки и даже в Европе (Dance D.A., 2000; Carlson P., 2001; Heyse A.M. et al., 2003; Dance D.A. et al., 2004; Issack M.I. et al., 2005; Rolim D.B., 2005). Причем, в Сальвадоре и Чили возбудитель мелиоидоза признан как этиологический агент нозокомиальных и оппортунистических инфекций с неблагоприятным прогнозом (Cheng А. С, 2005). Большинство случаев, зарегистрированных за пределами эндемичных территорий, связано с пребыванием в Юго-Восточной Азии и Австралии туристов, имевшими прямой контакт с конта-минированной B.pseudomallei пылью или водой (Currie В. J., 2003; Dance D.A. et al., 2004; Maccanti О. et al„ 2004; Kateruttanakul P. et al., 20)5; Mandjee A., 2005; Shrestha N., 2005). Риск заражения мелиоидозом увеличивается в период природных катастроф (Allworth A.M., 2005; Chierakul W. et al., 2005).
Актуальность создания эффективных средств диагностики сапа и мелиоидоза определяется реальной угрозой возникновения в любом регионе
мира неблагоприятной эпидемической ситуации по этим инфекциям в связи со значительным ростом грузо- и пассажиропотоков, появления возбудителей за счёт завоза больных животных, а также пищевых продуктов, контамини-рованных патогенными буркхольдериями. Способность к длительной бессимптомной персистенции возбудителя мелиоидоза в организме являются дополнительными причинами расширения ареала инфекции в результате миграции людей и животных с латентной формой заболевания (Koponen М.А., 1991; Riecke К. et al., 1997; Ngauy V. et al., 2005; Frangoulidis D. et al., 2007).
На сегодняшний день можно констатировать, что существующие методы обнаружения патогенных буркхольдерий оказываются недостаточно эффективными для экспресс-диагностики, а идентификация возбудителей сапа и мелиоидоза по-прежнему является трудоемкой задачей. Традиционная лабораторная диагностика, направленная на выделение чистой культуры возбудителей с последующей ее идентификацией, позволяет дать положительный ответ лишь через 36-48 ч. Серологические методики дают более быстрые результаты, но обладают относительно низкой чувствительностью и недостаточной специфичностью из-за возможных перекрёстных реакций с гетероло-гичными видами микроорганизмов и антигенной вариабельности штаммов. Кроме того, диагностическая ценность иммунологических методов ограничена при выявлении патогенных буркхольдерий на ранних стадиях инфекционного процесса.
Бурное развитие молекулярно-генетических технологий и достижения современной фундаментальной науки внесли значительный вклад в совершенствование средств диагностики, профилактики и лечения инфекционных болезней. Изучение геномов возбудителей особо опасных инфекций, включая В. mallei и В. pseudomallei привело к созданию и широкому внедрению новых методических подходов, направленных на идентификацию и типиро-вание патогенов. Однако отсутствие общепринятых коммерческих тест-систем, предназначенных для выявления видоспецифических последовательностей ДНК и антигенов этих микроорганизмов, приводит к тому, что в рутинной практике до сих пор используют лишь микроскопию и биохимические системы идентификации подобные API 20NE (Zysk G., 2000; Cheng A. С, 2005). Молекулярно-биологические методы обнаружения патогенных буркхольдерий включают в схему лабораторной диагностики в качестве подтверждающих тестов, как правило, при положительных находках в полуавтоматических системах идентификации (Srinivasan А., 2001; Inglis T.J.J, et al., 2005).
Традиционные методы типирования штаммов возбудителей сапа и мелиоидоза, основанные на культивировании микроорганизмов, изучении особенностей их метаболизма и антигенного строения, различной чувствительности к бактериофагам и антибиотикам (Манзенюк О.Ю. с соавт., 1994; Илюхин В.И. с соавт., 1995; Гришкина Т.А., 1996; Пивень Н.Н., 1997; Илюхин В.И. с соавт., 1998), отличаются ресурсоемкостью и в большинстве случаев не позволяют выявить отличия между штаммами патогенных буркхольдерий. Данные методы, основанные на изучении фенотипических свойств,
имеют существенные недостатки, связанные с относительной однородностью фенотипических свойств штаммов этих видов микроорганизмов, что определяет трудности в их инфравидовой дифференциации. В связи с этим, на сегодняшний день ни один из фенотипических маркеров не обеспечивает необходимую эффективность при расшифровке вспышек сапа и мелиоидоза.
В последние годы среди используемых методов типирования главенствующее место стали занимать молекулярно-биологические подходы. Результаты генотипирования характеризуются большей достоверностью по сравнению с морфологическими, биохимическими или иммунологическими методами дифференциации микроорганизмов (Блохина И.Н. с соавт., 1992; Tenover F.C.,1997; Шагинян И.А., 2000). Методы генетического типирования - полиморфизм длин рестрикционных фрагментов, гель-электрофорез в пульсирующем электрическом поле, различные варианты полимеразной цепной реакции и мультилокусного сиквенс-типирования были адаптированы для дифференциации штаммов В. pseudomallei, выделенных из внешней среды, от животных и человека (Trakulsomboon S. et al., 1994; Haase A. et al., 1995; Trakulsomboon S. et al., 1997; Currie B.J. et al., 2000; Pitt T.L. et al., 2000), расшифровки вспышек мелиоидоза (Currie B.J. et al., 2001; Ulett G.C. et al., 2001) и оценки эффективности проводимой антибиотикотерапии (Vadivelu J. et al., 1997; Koonpaew S. et al., 2000). Следует отметить, что количество публикаций, в которых описаны методы типирования возбудителя сапа существенно меньше, чем его ближайшего «родственника» - возбудителя мелиоидоза (Harvey S.P., 2005; Chantratita N. et al., 2006;, U'Ren J.M. et al., 2007).
Применение автоматических секвенаторов и методологии биочипов позволило вплотную подойти к экспрессному секвенированию полного генома микроорганизмов. Информация, полученная при секвенировании геномов патогенных буркхольдсрий, может быть использована для разработки быстрых и точных методов диагностики и дифференциации возбудителей сапа и мелиоидоза от близкородственных микроорганизмов, а также для внутривидового типирования этих патогенов.
До проведения полного секвенса геномов B.pseudomallei и -В.mallei лишь небольшая часть генов была клонирована и изучена их структурно-функциональная организация. Проведенные исследования геномной организации возбудителей сапа и мелиоидоза на основе секвенирования полных геномов показали наличие у них двух хромосом с функциональным разделением генов между ними (Holden М.Т. et al., 2004; Nierman W.C. et al., 2004). Большие хромосомы кодируют функции, ответственные за основные стороны жизнеобеспечения и роста клеток, в то время как меньшие - несут вспомогательную нагрузку, заключающуюся в обеспечении адаптационных свойств микроорганизмов в части выживаемости в различных условиях окружающей среды. Первые аннотированные сиквенсы геномов В. mallei АТСС 23344 и В. pseudomallei К96243 представлены на веб-серверах () и (). На сегодняшний день эти базы данных содержат информацию об аннотированных геномов уже 4 штаммов В. mallei и 4 штаммов В. pseudomallei.
Анализ геномных последовательностей буркхольдерий выявил множество гомологичных участков у B.pseudomallei и B.mallei, отсутствующих у близкородственного вида B.thailandensis (Holden М.Т. et al., 2004; Nierman W.C. et al., 2004). С помощью методологии секвенирования и технологии ДНК-биочипов идентифицировано большое количество открытых рамок считывания (ORF), которые делегированы (дефектны) у B.mallei и B.thailandensis в сравнении с B.pseudomallei. Как для В. mallei, так и для B.thailandensis выявлена преимущественная локализация таких генов на малой хромосоме. Как правило, они связаны с различными метаболическими и клеточными функциями, определяющими межвидовые различия (Ong С. et al., 2004; Kim H.S. et al., 2005). Причем, у возбудителя сапа отмечена высокая тенденция к потере более протяженных фрагментов хромосом. Делении затрагивают некоторые гены III типа секреции, сериновой металлопротеазы, кластеров, детерминирующих гликопротеиновую капсулу, а также продукцию и секрецию токсинов.
Расшифровка и сопоставление полногеномных последовательностей различных штаммов В. pseudomallei и В. mallei позволяет определять ДНК-маркеры (ДНК-стандарты) с которыми можно проводить сравнение остальных штаммов и изолятов с тем, чтобы делать выводы о присутствующих или отсутствующих в них последовательностях, по сравнению со стандартами.
Однако на сегодняшний день такая информация имеется лишь для нескольких штаммов из большого разнообразия диких штаммов и поиск вариабельных ДНК-маркеров для внутривидовой дифференциации патогенных буркхольдерий проводится эмпирически.
Существующая вероятность завоза инфекций на территорию нашей страны диктует необходимость технологических разработок, удовлетворяющих задачам не только высокоэффективной идентификации, но и дифференциации штаммов B.mallei и B.pseudomallei. В настоящее время основополагающий подход к детекции и анализу возбудителей инфекций состоит в последовательном применении методов и средств диагностики, в комплексе представляющих собой единую систему, включающую специфическую индикацию, идентификацию патогена и типирование выявленного микроорганизма. Для многих видов микроорганизмов, в том числе возбудителей особо опасных инфекций, разработаны необходимые алгоритмы идентификации и дифференциации штаммов, основанные на фенотипических и генотипиче-ских признаках. Многообразие клинических форм и отсутствие патогномо-ничных симптомов сапа и мелиоидоза практически исключают возможность постановки диагноза только на основании клинической картины, в связи с этим возрастает роль лабораторных методов в верификации диагноза. Возникающие проблемы их диагностики как в эндемичных, так и неэндемичных регионах определяют необходимость совершенствования лабораторного анализа и создания единой многоуровневой системы генодиагностики и внутривидовой дифференциации возбудителей.
Рассматривая современные методы идентификации и генотипирования штаммов патогенных буркхольдерий следует отметить, что на сегодняшний
день отсутствует оптимальная схема ускоренного выявления внутривидовых различий В. pseudomallei и В. mallei, а поиск генетических маркеров для быстрого генотипирования штаммов патогенных буркхольдерий продолжается вплоть до настоящего времени.
На основании вышеизложенного, очевидна актуальность научных исследований, направленных на более детальное изучение возбудителей сапа и мелиоидоза, их консервативных и вариабельных последовательностей с целью создания высокоэффективных генетических систем идентификации, отвечающих современным требованиям к чувствительности и специфичности диагностических тест-систем, а также разработки генотипических методов внутривидовой дифференциации штаммов B.mallei и В.pseudomallei.
Цель работы заключалась в разработке способов генной диагностики, конструировании амплификационных тест-систем для идентификации патогенных буркхольдерий и совершенствовании схем внутривидового типиро-вания штаммов возбудителей сапа и мелиоидоза с применением методов молекулярной биологии.
Задачи исследования:
Провести анализ нуклеотидных последовательностей, представленных в различных генетических базах данных, с целью подбора перспективных ДНК-мишеней для генной диагностики и генетической дифференциации штаммов возбудителей сапа и мелиоидоза в различных вариантах ПЦР-анализа, моно- и мультилокусного сиквенс-типирования.
Сконструировать амплификационные тест-системы для выявления возбудителей сапа и мелиоидоза методом ПЦР, подобрать условия проведения реакции, оценить чувствительность и специфичность генодиагностических систем на широком наборе гомологичных и гетерологич-ных штаммов микроорганизмов.
Оптимизировать условия подготовки проб для исследования экспериментального биологического материала при различных клинических формах сапа и мелиоидоза и проб из объектов внешней среды, контами-нированных В. mallei и В. pseudomallei.
Оценить эффективность ДНК-зондов на основе хромосомной ДНК патогенных буркхольдерий и криптических плазмид возбудителя мелиоидоза для идентификации В. mallei и В. pseudomallei и исследования атипичных штаммов патогенных буркхольдерий методом ДНК-ДНК гибридизации.
С помощью молекулярно-генетических методов изучить вариабельность геномов типичных и атипичных штаммов В. mallei и В. pseudomallei при различных условиях культивирования in vitro и экспериментальной инфекции и выбрать наиболее эффективные методы генетического типирования штаммов патогенных буркхольдерий.
6. Провести сравнительный анализ эффективности фенотипических и молекулярно-биологических методов идентификации и внутривидовой дифференциации штаммов В. mallei и В. pseudomallei и определить оптимальный алгоритм генодиагностики и генотипирования патогенных бурк-хольдерий.
Научная новизна:
В представленной работе впервые проведено комплексное исследование вариабельных фенотипических признаков и генотипических свойств возбудителей сапа и мелиоидоза с применением широкого спектра методов структурной геномики, позволившее решить ряд прикладных задач, направленных на совершенствование схем идентификации и генетического типиро-вания патогенных буркхольдерий.
Получены приоритетные данные об использовании нуклеотидных последовательностей генов, детерминирующих 23S рРНК, флагеллярного гена и or/гена III типа секреции для идентификации возбудителей сапа и мелиоидоза и на основе этих генов впервые сконструированы отечественные высокочувствительные и специфичные амплификационные тест-системы для генодиагностики В.pseudomallei и В.mallei.
Впервые показана возможность использования ПЦР в качестве дополнительного метода идентификации при различных формах сапа и мелиоидоза, вызванных типичными и атипичными штаммами В. pseudomallei и В. mallei.
Впервые предложены группоспецифические олигонуклеотидные затравки burtsl/burta2 для выявления триады буркхольдерий - В.pseudomallei, В.mallei и B.thailandensis, используемые в сочетании с методом ДНК-ДНК гибридизации и амплификации с произвольными праймерами для оценки генетического полиморфизма штаммов B.thailandensis, в том числе штамма B.thailandensis КМ-161, рекомендованного в качестве имитатора возбудителя мелиоидоза при проведении учебных занятий по идентификации ООИ методом ПЦР (патент на изобретение Российского агентства по патентам и товарным знакам «Штамм бактерий Burkholderia thailandensis KM 161 - авиру-лентный имитатор возбудителя мелиоидоза» Российского агентства по патентам и товарным знакам N 2257413.от 27.07.2005 г.).
Представлены доказательства того, что алгоритмом ускоренной идентификации В. mallei и В. pseudomallei является сочетание реакции амплификации и последующего секвенирования фрагментов генов 16S рРНК, 23S рРНК, orfI3 н/liC. Для доказательства достоверности ПЦР-диагностики сапа и мелиоидоза предложено секвенирование двух локусов геномной ДНК -фрагмента гена ІбБрРНКм участков генов 23SpPHK, orfl3 wmjliC.
Показано, что разработанный метод выделения ДНК из объектов окружающей среды (почва, вода), искусственно контаминированных микромице-тами (патент на изобретение Российского агентства по патентам и товарным
знакам №2295569 от 12. 07. 2005 г.), эффективен для экстракции и очистки ДНК патогенных буркхольдерий.
Впервые предложен способ проведения плазмидного анализа для внутривидового типирования штаммов возбудителя мелиоидоза. Приоритетность исследований подтверждена патентом на изобретение «Способ выделения плазмид Burkholderia pseudomallei» Российского агентства по патентам и товарным знакам № 2218401 от 10.12.2003 г.
Оптимизированы условия проведения рестрикционного анализа ДНК возбудителя сапа и впервые оценена генетическая гетерогенность коллекционных штаммов В. mallei методом пульс-электрофореза.
Впервые проведен анализ изолятов возбудителя сапа на основе реакции амплификации с произвольными праймерами и показана высокая эффективность ПЦР-типирования штаммов B.mallei. Для дифференциации штаммов патогенных буркхольдерий с использованием полимеразной цепной реакции предложен оригинальный набор олигонуклеотидных затравок.
Научная новизна исследования связана с определением вариабельных нуклеотидных последовательностей и тандемных повторов коллекционных штаммов возбудителей сапа и мелиоидоза, на основе которых возможно проведение ускоренного генетического типирования штаммов В.pseudomallei и B.mallei.
С помощью мультилокусного сиквенс-типирования и сравнительного анализа секвенированных последовательностей вариабельных участков генов «домашнего хозяйства» впервые установлено, что штаммы коллекционного центра живых культур Волгоградского научно-исследовательского противочумного института В.pseudomallei 100, С-141, а также В.pseudomallei 107 с неизвестным источником выделения, относятся к Юго-Восточной группе.
Проведенные исследования впервые позволили сформировать единую систему генодиагностики и генотипирования штаммов возбудителей сапа и мелиоидоза. Схема лабораторной диагностики и идентификации патогенных буркхольдерий дополнена методом ПЦР с разработанными амплификацион-ными тест-системами и впервые предложена схема быстрого внутривидового генетического типирования штаммов B.mallei и В.pseudomallei.
Разработанные методические подходы легли в основу исследований, поддержанных грантами РФФИ 04-04-96503,07-04-01568 и 07-04-08665.
Практическая ценность:
Разработанные амплификационные тест-системы в настоящее время используются в лабораториях Волгоградского НИПЧИ и могут быть рекомендованы для специализированных лабораторий для идентификации патогенных буркхольдерий и экспресс-диагностики сапа и мелиоидоза.' С этой целью оформлены методические рекомендации «Идентификация возбудителей сапа и мелиоидоза методом полимеразной цепной реакции», утвержденные директором института Н.Г. Тихоновым 29 мая 2002 г. и методические рекомендации «Использование двух пар праймеров для идентификации воз-
будителей сапа и мелиоидоза методом ПЦР» (утверждены директором Волгоградского НИПЧИ В.В. Алексеевым 10 февраля 2005 г.).
Материалы диссертационной работы использованы при оформлении пакета первичной документации: «Инструкция по изготовлению и контролю амплификационной тест-системы для выявления Burkholderia pseudomallei и Burkholderia mallei» и «Инструкция по применению амплификационной тест-системы для выявления Burkholderia pseudomallei и Burkholderia mallei», утверждённой директором Волгоградского НИПЧИ В.В. Алексеевым 10 февраля 2005 г.
Методики плазмидного анализа, выделения и мобилизации внехромо-сомных репликонов В.pseudomallei, включенные в методические рекомендации «Применение мобилизации для передачи критических плазмид B.pseudomallei в гетерологичные виды», утвержденные директором Волгоградского НИПЧИ Н.Г.Тихоновым 20 апреля 1998 г. и методические рекомендации «Способ получения штамма кишечной палочки, продуцирующего белок 30 kDa, опосредованный мелиоидозной плазмидой рСМ2» (утверждены директором Волгоградского НИПЧИ Н.Г.Тихоновым. 2 марта 2000 г.) используются в лабораториях Волгоградского НИПЧИ в различных разделах работ при изучении патогенных буркхольдерий.
Используемый метод ДНК-гибридизации включен в схему идентификации патогенных буркхольдерий, представленную в практическом руководстве «Мелиоидоз. Лабораторная диагностика возбудителей особо опасных инфекционных болезней» (Саратов, 1998). В государственной коллекции патогенных бактерий Всесоюзного НИПЧИ «Микроб» депонированы штаммы E.coli КМ 163, 164, 165, 166, несущие в составе своего генома, фрагменты плазмиды рСМ2 возбудителя мелиоидоза, которые рекомендованы в качестве группоспецифических ДНК - зондов для идентификации патогенных буркхольдерий.
Результаты сравнительного анализа фенотипических и генотипических методов дифференциации типичных и атипичных штаммов патогенных буркхольдерий легли в основу методических рекомендаций «Постановка диагностических тестов для внутривидовой дифференциации штаммов возбудителей сапа и мелиоидоза (индивидуальная карта штамма)», утвежденных директором Волгоградского НИПЧИ В.В.Алексеевым 25 июня 2003 г.
По материалам диссертационной работы составлены методические рекомендации: «Молекулярно-биологические подходы к идентификации и внутривидовому типированию возбудителей сапа и мелиоидоза», утвержденные директором Волгоградского НИПЧИ В.В. Алексеевым 06 марта 2006 г.
Предлагаемые схемы ПЦР-типирования с набором произвольных праймеров и олигонуклеотидных затравок для детекции вариабельных ам-пликонов, а также методы мультилокусного сиквенс-типирования и пульс-электрофореза используются в лабораториях Волгоградского НИПЧИ для сравнительного анализа музейных штаммов возбудителей сапа и мелиоидоза и их изогенных мутантов с измененной вирулентностью и чувствительностью к антибиотикам.
Материалы диссертационной работы используются сотрудниками института в рамках учебных программ по первичной специализации и перепо-готовке специалистов - Программы курсов повышения квалификации бактериологов и эпидемиологов по противодействию биотерроризму, утвержденной Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г.Онищенко 01.02.2001 г., Программы курсов повышения квалификации врачей - бактериологов общей медицинской сети, центров Госсанэпиднадзора и противочумных учреждений по специфической индикации и лабораторной диагностике особо опасных инфекций, санитарной охране территории и противоэпидемической защите населения, утвержденной Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г.Онищенко 28.09.1999 г., а также Программы курсов повышения квалификации медицинских работников (с высшим и средним специальным образованием) сани-тарно-карантинных пунктов и отделов (СКП и СКО), утвержденной Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г.Онищенко. Кроме того, материалы настоящей работы используются при чтении лекций и проведении практических занятий для студентов I1I-VI курсов медико-биологического факультета Волгоградского государственного медицинского университета.
Положения, выносимые на защиту
Амплификационные тест-системы, сконструированные для выявления возбудителей сапа и мелиоидоза, обеспечивают специфическую детекцию фрагментов генов 23SpPHK, флагеллярного гена (fliC) и or/гена. III типа секреции патогенных буркхольдерий при исследовании методом ПЦР чистых культур и проб из объектов внешней среды, контаминиро-ванных В. mallei и B.pseudomallei, а также при генодиагностике различных форм экспериментального сапа и мелиоидоза, вызванных типичными и атипичными штаммами возбудителей.
Группоспецифические олигонуклеотидные затравки burtsl/burta2, обеспечивают амплификацию специфических фрагментов флагеллярного гена fliC триады буркхольдерий - B.pseudomallei, B.mallei и B.thailandensis с чувствительностью 1x10 -1х103 м.к./мл при анализе чистых культур и биологического материала от экспериментально заражённых животных.
Использование двух ДНК мишеней - участков 16S рРНК и 23S рРНК, orfl3 или fliC, при сочетании ПЦР и секвенирования является способом доказательства достоверности ПЦР-диагностики, быстрой идентификации B.mallei u B.pseudomallei и их дифференциации от близкородственных видов микроорганизмов.
Методы пульс-электрофореза и мультилокусного сиквенс-типирования эффективны для дифференциации штаммов возбудителя мелиоидоза, в отличие от штаммов В. mallei, для которых применим рестрикционный анализ ДНК в формате пульс-электрофореза. При мультилокусном сик-венс-типировании штаммы возбудителя сапа объединяются в единый си-
квенс-тип, входящий в клональный комплекс штаммов В. pseudomallei и их дифференциация невозможна. 5. Быстрое генетическое типирование штаммов возбудителя мелиоидоза обеспечивают методы амплификации полиморфной ДНК с произвольными праймерами, VNTR-анализ, Rep-ПЦР и схема типирования на основе вариабельных ампликонов, а ускоренная оценка генетической гетерогенности штаммов возбудителя сапа возможна лишь с помощью VNTR-анализа и амплификации с произвольными праймерами.
Апробация работы
Основные материалы диссертации были представлены на международной конференции «Геномика, протеомика и биоинформатика для медицины» (Москва, 2002), IV Всероссийской научно-практической конференции «Генодиагностика инфекционных заболеваний» (Москва, 2002), IV межгосударственной научно - практической конференции Государств стран СНГ «Современные технологии в диагностике особо опасных инфекционных болезней» (Саратов, 2003), XI Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2004), V Всероссийской научно-практической конференции «Генодиагностика инфекционных болезней» (Москва, 2004), VI Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ «Санитарная охрана территорий государств участников Содружества Независимых Государств: проблемы биологической безопасности и противодействия биотерроризму в современных условиях» (Волгоград, 2005), Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ «Чрезвычайные ситуации международного значения в общественном здравоохранении в решениях Санкт-Петербургского саммита «Группы восьми» и санитарная охрана территорий государств-участников Содружества Независимых Государств»» (Оболенск, 2006), XI Региональной конференции молодых исследователей Волгоградской области (Волгоград, 2006), 65-й юбилейной научно-практической конференции молодых ученых с международным участием «Актуальные проблемы экспериментальной и клинической медицины» (Волгоград, 2007), V международном конгрессе по мелиоидозу (Thailand, 2007), а также на ежегодных итоговых научных конференциях Волгоградского НИПЧИ.
По теме диссертации опубликовано 83 научные работы. Материалы исследований использованы при написании трех монографий - «Мелиоидоз», под ред. Н.Г. Тихонова, Волгоград, 1995, «Практическое пособие для подготовки врачей-бактериологов и эпидемиологов по вопросам противодействия биотерроризму», Волгоград, 2004 и «Специфическая индикация патогенных биологических агентов. Практическое руководство», под ред. академика РАМН, Г.Г.Онищенко.- М: ЗАО «МП Гигиена».- 2006.
Структура и объем работы
Диссертация изложена в форме монографии на 268 листах машинописного текста, состоит из введения и 6 глав, включающих описание литературных данных и результаты собственных исследований, заключения и выводов. Работа иллюстрирована 21 таблицей и 61 рисунком. Список цитируемой литературы включает 386 источников, в том числе 82 отечественных и 304 иностранных работ.
