Содержание к диссертации
Введение
1 Обзор литературы 5
1.1. Структурная организация ферментов. Классификация о-гликозилгидролаз, основанная на сходстве первичной последовательности 5
1.1.1. Каталитические домены различных семейств и особенности их укладки 14
1.1.2. Молекулярный механизм действия О-гликозилгидролаз 15
1.1.3. Эволюционные аспекты 16
1.1.4. Углевод-связывающие модули и их классификация . 17
1.1.5. Линкеры 20
1.2. Фукоиданы 20
1.3. Фукоиданазы (фукоидан гидролазы) 26
1.3.1. Распространение фукоиданаз 26
1.3.2. Выделение и очистка фукоиданаз 26
1.3.3. Сведения о свойствах фукоиданаз 27
1.4. Сульфатазы 29
1.5. Глюканазы (ламинариназы) из морских источников. 34
2. Экспериментальная часть 37
3. Результаты и их обсуждение 45
3.1. Распространение некоторых О-гликозилгидролаз в морских беспозвоночных 45
3.2. Выделение и характеристика О-гликозилгидролаз морского брюхоногого моллюска Littorina kurila 50
3.2.1. Фукоиданаза 51
3.2.1.1. Выделение и физико-химические свойства 51
3.2.1.2. Специфичность действия фукоиданаз 53
3.2.1.3. Функциональные группы фукоиданаз, участвующие в трансформации субстрата 58
3.2.2. -Фукозидаза 59
3.2.3. Сульфатаза 61
3.2.4. Изучение свойств и специфичности глюканаз 67
3.2.4.1. Глюканаза из гепатопанкреаса Littorina kurila 67
3.2.4.1.1. Физико-химические свойства 67
3.2.4.2. Глюканаза из неоплодотворенных яйцеклеток морского ежа Strongylocentrotus intermedius 74
Выводы 80
Список литературы 81
- Структурная организация ферментов. Классификация о-гликозилгидролаз, основанная на сходстве первичной последовательности
- Углевод-связывающие модули и их классификация
- Распространение некоторых О-гликозилгидролаз в морских беспозвоночных
- Глюканаза из неоплодотворенных яйцеклеток морского ежа Strongylocentrotus intermedius
Введение к работе
Актуальность проблемы. Полисахариды бурых водорослей (фуконданы, ал ьги новые кислоты, ламннараны) разнообразны по своей структуре и биологической активности. Фуконданы -сульфатированные ппероиолиеахариды - проявляют аіггнкоаіуляїггпос, иммуномодулирующее, противоопухолевое и антивирусное действие и в настоящее время уже предллаются как лекарственные средства. Альгинаты широко используются в пищевой промышленности и медицине Они способны связывать и выводить из организма ионы тяжелых металлов. Интерес к I—*3;1->6-Р-0-глюканам, к которым относится и ламннара», связан с их влиянием на системы иммунитета растений и животных. Несмотря на широкую известность этих полисахаридов, структуры их полностью не установлены Трудности связаны с тем, что содержание и структурные характеристики полисахаридов зависят не только от вида водоросли, но и от сезона сбора, возраста и т.д
Важными ннструменгами в структурных исследованиях полисахаридов служат фермешы (О-гликозилгидролазы, сульфатазы) с установленной специфичностью и механизмом действия Большой интерес предсіашіяст ферментативная іранеформация полисахаридов, позволяющая получль новые препараіьі с более высокой биологической активностью
Морские беспозвоночные, представленные большим количеством таксонов, находящихся на различных ступенях эволюции и отличающихся друг от друга способом питания и образом жизни, являются богатыми й сравнительно доступными источниками различных Очликшилгидролаз Некоторые виды морских беспозвоночных служат объектами марикультуры О-Гликошлгидролазы чаще всего содержатся в пищеварительных трактах морских живої пых, которые попадают в отходы при их' промышленной переработке
Исходя из вышесказаннош. представляются актуальными сисгсматическис исследования распространения в морских беспозвоночных ферменгов. принимающих участие в деградации полисахаридов, разработка методов выделения индивидуальных ферментов; изучение их свойств, специфичности, мсхаии іма действия и возможности их применения в структурных исследованиях углеводов и для получения новых биологически активных веществ
Цель и задачи исследования. Целью работы является получение выеокоочшценных ферменгов. катализирующих іраисформацию полисахаридов бурых водорослей (фукондана и ламинар'аиа}.* установление их специфичное]и и механизма действия
Для достижения згой цели были носгавлепы следующие задач и-
1. Изучение распространения фукоиданаз, a-L-фукозида.! и других гликозидаз в морских
беспозвоночных Японского моря.
-
Выбор объекта для выделения индивидуальных ферменгов.
-
Разработка методов выделения фукоиданазы. a-L-фукозндазы. сульфатазы, I—З-Р-П-иноканазы из тшоианкреаса L кип la
4 Наследование топав, сисцифнчмоспії imia действия н возможное!и применения выделенных ферменюц.
4 5. Сравнение свойств и типа действия 1—З-р-О-глюканаз из яйцеклеток морского ежа Sfrongylocenlrotus intermedins с 1 —O-p-D-глюканазамн морского и наземного моллюсков
Положения, выносимые на защиту.
-
Фукоиданаза широко распространена в морских беспозвоночных. Уровень ее активности значительно ниже других 0-гликознлгидролаз. ,
-
Фукоиданаза из гспатопанкреаса L kurtla катализирует расщепление 1—»3 - 0-гликозидных связей в молекуле фукоидана с образованием сульфатированных олигосахарйдо» и фукозы.
3 Сульфатаза из L. kunla не действует на природный фукоидан, сульфати рованные
полиоксистероиды и фукозу, но катализирует десульфзтирование ксилты, входящей в состав гликозидов
голосганового ряда.
4 Экзо-1—'З-Р-О-глюкаиаза из неоплодотворенных яйцеклетох морского ежа S mtermedius имеет
необычные для экзо-фермента свойства осуществляет гидролиз ламинараиа с сохранением конфигурации
расщепляемой связи, действует на модифицированные субстраты и обладает трансгликозилирующеи
активностью
Научная новизна и практическая значимость работы. Изучено распространение фуконданаз среди морских беспозвоночных Японского моря Впервые из гепатопанкреаса морского брюхоногого моллюска L kurtla выделены фукоиданаза. a-L-фукозидаза, сульфатаза, 1—O-pVD-глюканаза Определены физико-химические свойства ферментов. Установлена структура продуктов ферментативной трансформации фукоидана из Fucus evanescens* что позволило сделать вывод о специфичности фукоиданазы Впервые показано, что сульфагаза катализирует специфичное десульфатирование гликозидов голосганового ряда, что дает возможность применять ее для получения новых веществ
Апробация работы. Результаты работы были доложены на'
Дальневосточной региональной конференции молодых ученых «Проблемы экологии и природолользовния Дальнего востока», г. Владивосток, 1998.
2-м Международном симпозиуме «Химия и химическое образование», г. Владивосток, 200G
10-th International Symposium on Marine Natural Products, Nago. Okinawa, 2001.
t XVI International symposium on glucocgnjugates. The Hague, The Netherlands, 2001.
Публикации. По материалам исследования опубликовано 7 научных работ.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, выводов и иіиска цитируемой литературы. Список литературы включает 138 публикаций Диссертация ишожена на НЯ етр машинописного текста, содержит 24 таблицы и 27 рисунков
Структурная организация ферментов. Классификация о-гликозилгидролаз, основанная на сходстве первичной последовательности
Многообразие углеводов требует такого же многообразия ферментов для селективного расщепления олиго- и полисахаридов (О-гликозилгидролазы), их перестройки (трансгликозидазы), биосинтеза (гликозилтрансферазы) и модификации (например: углеводэстеразы). Гликозилгидролазы (ЕС 3.2.1.x) являются ключевыми ферментами углеводного обмена в трех главных царствах (архебактерии, эубактерии, эукариоты). Множественность этих «углевод-активных» ферментов сразу поставила задачу их классификации.
Общепринятая номенклатура ферментов (1992) основывается на типе катализируемой реакции и на субстратной специфичности ферментов. Ферменты, имеющие код ЕС 3.2.1.x катализируют гидролиз О-гликозидных связей (3 -означает - гидролазы, 3.2 - гликозилгидролазы, 3.2.1 - О-гликозилгидролазы). Последняя цифра кода означает субстрат и в какой-то степени может отражать механизм действия фермента. Эта классификация позволяет избегать двусмысленностей и увеличения количества тривиальных названий.
Однако, по меньшей мере, в случае гликозилгидролаз, такая классификация не учитывает структурные особенности молекул ферментов и слабо отражает молекулярный механизм их действия. Кроме того, классификация, основанная преимущественно на субстратной специфичности, не принимает во внимание эволюционные процессы, такие как дивергенция или конвергентная эволюция (см. раздел 1.1.3). Другая проблема номенклатуры ферментов состоит в том, что она не подходит для ферментов, проявляющих широкую специфичность (т.е. для тех, которые действуют на различные субстраты).
Очевидно, что имеется прямая взаимосвязь между аминокислотной последовательностью и пространственной структурой молекул (Chothia, Lesk, 1986). С 1985 года начато систематическое сравнение первичных последовательностей гликозилгидролаз (Gilkes et al., 1991; Henrissat, 1991). В процессе этого сравнения возникла классификация, основанная на структурном сходстве молекул, и образованы семейства, объединяющие различные ферменты со сходной субстратной специфичностью. Классификация, которая отражает сходство первичной структуры ферментов (следовательно, структурное сходство) безусловно, полезна, особенно при быстро растущем числе расшифрованных генов гликозилгидролаз, и способствует увеличению числа установленных третичных структур. Предложенная Henrissat классификационная система коррелирует со структурой и молекулярным механизмом действия ферментов, что позволяет делать предположения относительно каталитических остатков и даже третичной структуры О-гликозилгидролаз. Однако, при таком подходе к систематизации ферментов в те или иные классы ферментов неизбежно попадают белки, функция которых может быть весьма далека от ферментативной трансформации углеводов. Например, некаталитические белки, которые могут специфически связываться с углеводами. Поэтому, тип катализируемого процесса не является отныне абсолютным критерием для классификации фермента. Более того, по мере накопления данных о структуре белков последняя все отчетливее выходит на первый план. Цель настоящей главы представить современное состояние и развитие такой классификации О-гликозилгидролаз.
Предложенная Henrissat классификация (Henrissat, 1991; Henrissat, Bairoch, 1993) разделяет известные ферменты на семейства по сходству консервативных областей генов, которые кодируют соответствующие ферменты, а также привлекает для классификации механизм действия ферментов. Все семейства отнесены к какому-либо клану на основании наличия и расположения ос - спиралей и р - слоев, т.е. в соответствии со вторичной структурой. Ранее в 1976 г. М. Levitt и С. Chothia разделили по этому признаку все белки с известной структурой на 5 классов. 1. Белки, состоящие только из а - спиралей, уложенных в глобулярную структуру. 2. Белки, состоящие только из Р - слоев и формирующие глобулу в виде бочонка. 3. Белки, включающие а - спирали и р - слои (сс+р белки), но разобщенные в третичной структуре. 4. Белки ос/р, в которых ос - и Р - структурные участки чередуются в первичной структуре, формируя третичную структуру, в центре которой находятся обычно параллельно уложенные Р - слои, окаймленные с обеих сторон а - спиралями. 5. Небольшие молекулы с большим количеством S-S - мостиков или ассоциированные с крупным кофактором "неупорядоченные белки", обладающие слабой вторичной структурой. Авторы другой классификации белков (SCOP - The Structural classification of Proteins) разделили белки на 11 классов (Conte et al., 2000). 1. Белки, состоящие только из а - спиралей. 2. Белки, состоящие только из Р - слоев. 3. аи Р белки (а/Р) состоящие, главным образом, из параллельных Р - слоев (р-ос-р единиц). 4. (сс+(3) - состоящие из антипараллельных Р - слоев (аир структуры разобщены). 5. Мультидоменные белки (а и Р), состоящие из двух и более доменов, принадлежащих к различным классам. 6. Белки мембран и поверхности клеток, а так же пептиды (исключая белки иммунной системы). 7. Белки небольшой молекулярной массы (часто имеют в качестве лиганда ионы металлов и обладают большим числом дисульфидных мостиков). 8. Белки в виде колец. 9. Низкоорганизованные белковые структуры. 10. Пептиды. 11. Экспериментально полученные белки с последовательностью, существенно отличающейся от природных белков. # Эта классификация относится ко всем белкам, структуры которых известны. Классификация Henrissat В. относится только к гликозилгидролазам, что для нас представляет большой интерес. Поэтому, остановимся на ней подробнее. К настоящему времени классифицировано более 5000 ферментов, которые разделены на 87 семейств (1-87); семейства, в свою очередь, отнесены к одному из 10 (A-J) кланов. Семейства формируются на основании сходства консервативных областей генов, кодирующих соответствующие ферменты, а кланы на основе сходства третичных структур (табл. 1).
Углевод-связывающие модули и их классификация
Многообразие углеводов требует такого же многообразия ферментов для селективного расщепления олиго- и полисахаридов (О-гликозилгидролазы), их перестройки (трансгликозидазы), биосинтеза (гликозилтрансферазы) и модификации (например: углеводэстеразы). Гликозилгидролазы (ЕС 3.2.1.x) являются ключевыми ферментами углеводного обмена в трех главных царствах (архебактерии, эубактерии, эукариоты). Множественность этих «углевод-активных» ферментов сразу поставила задачу их классификации.
Общепринятая номенклатура ферментов (1992) основывается на типе катализируемой реакции и на субстратной специфичности ферментов. Ферменты, имеющие код ЕС 3.2.1.x катализируют гидролиз О-гликозидных связей (3 -означает - гидролазы, 3.2 - гликозилгидролазы, 3.2.1 - О-гликозилгидролазы). Последняя цифра кода означает субстрат и в какой-то степени может отражать механизм действия фермента. Эта классификация позволяет избегать двусмысленностей и увеличения количества тривиальных названий.
Однако, по меньшей мере, в случае гликозилгидролаз, такая классификация не учитывает структурные особенности молекул ферментов и слабо отражает молекулярный механизм их действия. Кроме того, классификация, основанная преимущественно на субстратной специфичности, не принимает во внимание эволюционные процессы, такие как дивергенция или конвергентная эволюция (см. раздел 1.1.3). Другая проблема номенклатуры ферментов состоит в том, что она не подходит для ферментов, проявляющих широкую специфичность (т.е. для тех, которые действуют на различные субстраты).
Очевидно, что имеется прямая взаимосвязь между аминокислотной последовательностью и пространственной структурой молекул (Chothia, Lesk, 1986). С 1985 года начато систематическое сравнение первичных последовательностей гликозилгидролаз (Gilkes et al., 1991; Henrissat, 1991). В процессе этого сравнения возникла классификация, основанная на структурном сходстве молекул, и образованы семейства, объединяющие различные ферменты со сходной субстратной специфичностью. Классификация, которая отражает сходство первичной структуры ферментов (следовательно, структурное сходство) безусловно, полезна, особенно при быстро растущем числе расшифрованных генов гликозилгидролаз, и способствует увеличению числа установленных третичных структур. Предложенная Henrissat классификационная система коррелирует со структурой и молекулярным механизмом действия ферментов, что позволяет делать предположения относительно каталитических остатков и даже третичной структуры О-гликозилгидролаз. Однако, при таком подходе к систематизации ферментов в те или иные классы ферментов неизбежно попадают белки, функция которых может быть весьма далека от ферментативной трансформации углеводов. Например, некаталитические белки, которые могут специфически связываться с углеводами. Поэтому, тип катализируемого процесса не является отныне абсолютным критерием для классификации фермента. Более того, по мере накопления данных о структуре белков последняя все отчетливее выходит на первый план. Цель настоящей главы представить современное состояние и развитие такой классификации О-гликозилгидролаз.
Предложенная Henrissat классификация (Henrissat, 1991; Henrissat, Bairoch, 1993) разделяет известные ферменты на семейства по сходству консервативных областей генов, которые кодируют соответствующие ферменты, а также привлекает для классификации механизм действия ферментов. Все семейства отнесены к какому-либо клану на основании наличия и расположения ос - спиралей и р - слоев, т.е. в соответствии со вторичной структурой. Ранее в 1976 г. М. Levitt и С. Chothia разделили по этому признаку все белки с известной структурой на 5 классов. 1. Белки, состоящие только из а - спиралей, уложенных в глобулярную структуру. 2. Белки, состоящие только из Р - слоев и формирующие глобулу в виде бочонка. 3. Белки, включающие а - спирали и р - слои (сс+р белки), но разобщенные в третичной структуре. 4. Белки ос/р, в которых ос - и Р - структурные участки чередуются в первичной структуре, формируя третичную структуру, в центре которой находятся обычно параллельно уложенные Р - слои, окаймленные с обеих сторон а - спиралями. 5. Небольшие молекулы с большим количеством S-S - мостиков или ассоциированные с крупным кофактором "неупорядоченные белки", обладающие слабой вторичной структурой. Авторы другой классификации белков (SCOP - The Structural classification of Proteins) разделили белки на 11 классов (Conte et al., 2000). 1. Белки, состоящие только из а - спиралей. 2. Белки, состоящие только из Р - слоев. 3. аи Р белки (а/Р) состоящие, главным образом, из параллельных Р - слоев (р-ос-р единиц). 4. (сс+(3) - состоящие из антипараллельных Р - слоев (аир структуры разобщены). 5. Мультидоменные белки (а и Р), состоящие из двух и более доменов, принадлежащих к различным классам. 6. Белки мембран и поверхности клеток, а так же пептиды (исключая белки иммунной системы). 7. Белки небольшой молекулярной массы (часто имеют в качестве лиганда ионы металлов и обладают большим числом дисульфидных мостиков). 8. Белки в виде колец. 9. Низкоорганизованные белковые структуры. 10. Пептиды. 11. Экспериментально полученные белки с последовательностью, существенно отличающейся от природных белков. Эта классификация относится ко всем белкам, структуры которых известны. Классификация Henrissat В. относится только к гликозилгидролазам, что для нас представляет большой интерес. Поэтому, остановимся на ней подробнее. К настоящему времени классифицировано более 5000 ферментов, которые разделены на 87 семейств (1-87); семейства, в свою очередь, отнесены к одному из 10 (A-J) кланов. Семейства формируются на основании сходства консервативных областей генов, кодирующих соответствующие ферменты, а кланы на основе сходства третичных структур (табл. 1).
Распространение некоторых О-гликозилгидролаз в морских беспозвоночных
В лаборатории химии ферментов ТИБОХ в течение ряда лет проводятся систематические исследования по распространению ферментов углеводного обмена в морских организмах, обитающих как в северных, так и в тропических водах Мирового Океана. Показано, что в пищеварительных органах морских беспозвоночных, различающихся способом питания и занимающих разные экологические ниши, содержатся активные О-гликозилгидролазы: 1—»3-3-D-глюканазы, альгиназы, целлюлазы, хитиназы (Sova et al., 1970; Elyakova 1968; Elyakova et al., 1981; Широкова и др., 1974; Клесов и др., 1982). В экстракте гепатопанкреаса брюхоногого моллюска Littorina sp., наряду с другими карбогидразами ранее было отмечено присутствие фукоидан гидролазы (фукоиданазы) (Elyakova et al., 1968). В настоящее время возрос интерес к этим ферментам, которые являются важными инструментами для изучения структурных особенностей и биологической активности фукоидана.
С целью поиска источников активных фукоиданаз и гликозидаз (олигосахарид-гидролаз) было исследовано распространение этих ферментов в 61 виде морских беспозвоночных, относящихся к 6 типам.
Для поиска фукоиданаз были использованы субстраты, структурные характеристики, которых приведены в табл. 9. При поиске гликозидаз использовали синтетические субстраты - и-нитрофенильные производные соответствующих Сахаров.
Результаты эксперимента показали (табл. 10), что фукоиданазы имеются практически у всех животных. Однако большинство из них обладало слабой активностью, и только моллюски, а также некоторые представители иглокожих (Echinocardium cordatum, Apostichopus japonicus) и ракообразных (Balanus rostratum) обладали заметной активностью (100 ед./мг белка и более), сопоставимой с активностью фукоиданаз из других источников (Kitamura et al., 1992; Sasaki et al., 1996). Характер распределения фукоиданаз и гликозидаз в пищеварительных органах морских беспозвоночных был аналогичен полученному нами ранее для других О-гликозилгидролаз (Sova et al., 1970; Elyakova et al., 1981), за исключением одной особенности. Если для других О-гликозилгидролаз (ламинариназ, целлюлаз, хитиназ и др.) уровень активности их в кристаллических стебельках моллюсков был в 10-1000 раз выше, чем в гепатопанкреасе, то для фукоиданаз и гликозидаз такой зависимости не наблюдалось.
Многие экстракты с различной эффективностью катализировали расщепление фукоиданов из L. cichorioides и F. evanescens. Экстракты большинства исследованных видов хуже гидролизовали фукоидан из L. cichorioides. Исключение составляли экстракты гепатопанкреаса моллюсков Crenomytilys grayanus и Peronidia venulosa, которые обнаружили практически одинаковую способность гидролизовать фукоиданы из L. cichorioides и F. evanescens, а также экстракт из пищеварительных органов морского ежа Echinocardium cordatum, гидролизующий только фукоидан из L. cichorioides. Различное действие экстрактов морских беспозвоночных на 2 образца фукоидана, вероятно, связано со специфичностью ферментов к некоторым элементам структуры субстратов (табл. 9): например, к степени сульфатирования фукоиданов и различному положению сульфатных групп. Согласно результатам анализа (табл. 9) соотношение Fuc:S042 для фукоидана из L. cichorioides составляет 1:1,7, а для фукоидана из F. evanescens 1:0,8. Следовательно, можно предположить, что фукоиданазы большинства исследованных морских беспозвоночных обладают специфичностью к низкосульфатированиому фукоидану из F. evanescens и только фермент из Е. cordatum специфичен к высокосульфатированному фукоидану из L. cichorioides. Фукоиданазы из С. grayanus и P. venulosa, по-видимому, не обладают чувствительностью к данному структурному элементу. Кроме того, различная активность некоторых ферментов по отношению к фукоиданам из L. cichorioides и F. evanescens может быть обусловлена разным типом гликозидных связей между остатками фукозы в молекулах полисахаридов.
Показано, что из 4 исследованных гликозидаз (P-D-глюкозидаза, (3-D-галактозидаза, oc-D-маннозидаза, oc-L-фукозидаза) наиболее распространены в морских беспозвоночных глюкозидазы, наименее - маннозидазы. Высокая активность практически всех исследованных гликозидаз обнаружена в гепатопанкреасе брюхоногих моллюсков рода Littonna, двустворчатого моллюска S. sachalinensis и краба Cancer amphioetus.
Мы провели полуколичественную оценку содержания активности a-L-фукозидазы в экстрактах. Результаты исследований показали, что экстракты 25 видов из 33 проанализированных способны катализировать расщепление п-нитрофенил-сх-Ь-фукопиранозида. Экстракты четырех видов моллюсков (L. brevicula, L. squalida, Acmea pallida, S. sachalinensis) и краба С. amphioetus обладали высокой активностью. Однако, присутствие в экстрактах активной a-L-фукозидазы не увеличивало их способность гидролизовать фукоиданы. Интересно отметить, что в экстрактах иглокожих (Echinoidea) при практическом отсутствии активности cc-L фукозидазы отмечен высокий уровень других гликозидаз (P-D-глюкозидазы, 0-D-галактозидазы и oc-D-маннозидазы).
Не исключено, что значения ферментативной активности, полученные для морских звезд, могут быть несколько занижены, так как в экстрактах их пищеварительной системы ранее обнаружены (Kozlovskaya, Vaskovsky, 1970) активные протеазы. Несмотря на это, высокая фукоиданазная активность была обнаружена у морской звезды Disolasterias aligans.
Таким образом, результаты проведенного поиска показали, что фукоиданазы и гликозидазы различной специфичности широко представлены в морских беспозвоночных. Необходимо отметить, что активность фукоиданаз в этих же источниках в 100-1000 раз меньше активности ламинариназ - ферментов, трансформирующих другой полисахарид бурых водорослей - ламинаран (Elyakova et al., 1981). Представители Mollusca, Echinoidea и Arthropoda Японского моря, у которых активность фукоиданаз наиболее высокая среди исследованных видов, могут являться объектами для выделения и детального изучения ферментов, расщепляющих фукоиданы (Бурцева и др., 2000).
В качестве объекта для выделения фукоидан-деградирующих ферментов был выбран брюхоногий моллюск L. kurila, густо населяющий прибрежную зону, выдерживающий длительную транспортировку в морской воде. Исследование состава и уровня активности различных О-гликозилгидролаз гепатопанкреаса L. kurila показало (табл. 11), что в экстракте присутствуют высокоактивные гликозидазы (P-D-галактозидаза, a-D-маннозидаза, P-D-глюкозидаза, a-L-фукозидаза), сульфатаза и глюканазы (1— -3-Р-С -глюканаза, амилаза, целлюлаза). Однако, активность фукоиданазы была более чем на порядок ниже активности других ферментов, гидролизующих полисахариды.
Глюканаза из неоплодотворенных яйцеклеток морского ежа Strongylocentrotus intermedius
В процессе гидролиза ламинарана ЛП наблюдалось равномерное увеличение величины оптического вращения раствора до положительного значения, которое резко уменьшалось до равновесного при добавлении капли аммиака - катализатора реакции аномеризации. Аналогичная картина, полученная для экзо-1— 3-p-D-глюканазы из Helix pomatia (Marshall, Grand, 1975), позволила заключить, что гидролиз ламинарана под действием этого фермента приводит к образованию а-глюкозы.
Ранее методом ЯМР-спектроскопии было показано, что JIIV гидролизует ламинаран с сохранением конфигурации расщепляемой связи (Isakov et al., 1972). Согласно данным табл. 23 при гидролизе ламинарана JIIV оптическое вращение раствора не только не достигает высокого положительного значения, но и не изменяется при добавлении аммиака. Еще медленнее происходит увеличение оптического вращения в случае действия на ламинаран 1— 3-3-0-глюканазы Ле из яйцеклеток морского ежа и практически не меняется с добавлением капли аммиака.
Вероятнее всего, что также, как и в случае JIIV, здесь образуются продукты, имеющие р-конфигурацию при С1.
Известно, что субстраты с измененным невосстанавливающим концом молекулы не подвергаются действию экзоферментов, тогда как такая модификация практически не сказывается на скорости гидролиза этих субстратов эндоферментами. Среди исследуемых глюканаз только ЛИ не катализировала расщепление модифицированного ламинарана, JIIV и Ле гидролизовали его с высокой скоростью (табл. 24). Близкими оказались скорости гидролиза глюканазами ЛГУ и Ле высокомолекулярного 1— 3-Р-Б-глюкана - пахимана и смешанного 1—»3;1-»4-(3-В-глюкана - лихенана.
Известно, что эндогликаназы катализируют как реакцию гидролиза, так и реакцию трансгликозилирования, а экзоферменты, за редким исключением, осуществляют только гидролиз гликозидных связей субстрата. Сведения о трансгликозилирующих свойствах 1— 3-Р-0-глюканаз крайне ограничены. В большинстве публикаций лишь отмечается присутствие или отсутствие трансгликозилирующих свойств у этой группы ферментов (Moore, Stone, 1972; Manners, Marshall, 1973). Ранее нами было показано, что для эндо-1—»3-P D-глюканаз из морских моллюсков характерна повышенная способность по сравнению с другими карбогидразами к реакциям трансгликозилирования (Звягинцева и др., 1998). Сравнительная оценка величины трансгликозилирующей активности 1— 3-3-В-глкжаназ из различных источников приведена нами в работе (Сова и др., 1997). Трансгликозилирующую способность оценивали по скорости образования меченных «-нитрофенолом продуктов, образующихся при использовании ламинарана в качестве донора, а я-нитрофенил-P-D глюкопиранозида - в качестве акцептора реакции. Было показано, что 1— 3-3-D глюканаза ЛИ не катализирует реакцию трансгликозилирования. При равной гидролитической активности за 1 час в одинаковых условиях JIIV катализировала включение 11,5% акцептора в продукты реакции, а Ле 0,4%. Трансгликозилирующая активность Ле значительно меньше ЛГУ, но сопоставима с активностью эндо-1- 3-Р-0-глюканаз растений (Сова и др., 1997). Таким образом, 1- 3-(3-0-глюканаза из яйцеклеток морского ежа S. intermedius осуществляет гидролиз ламинарана с сохранением конфигурации расщепляемой связи и с образованием большого количества глюкозы в продуктах реакции, действует на модифицированные субстраты. Фермент обладает трансгликозилирующей активностью (Сова и др., 2003). Все эти свойства делают его более похожим на эндо-1— 3-(5-D-nnoKaHa3y ШМ из морского моллюска, чем на экзо-1— 3-(3-0-глюканазу ЛИ из наземной улитки. Некоторые отличия в составе продуктов гидролиза ламинарана l-»3-(3-D-глюканазами ЛІУ и Ле, их трансгликозилирующей способности, вероятно, связаны с различным строением их активных центров. 1. Впервые проведен анализ содержания фукоиданаз и некоторых гликозидаз в 61 виде морских беспозвоночных Японского моря. Показано, что гликозидазы и фукоиданазы различной специфичности достаточно широко распространены в морских беспозвоночных. Моллюски, некоторые представители иглокожих и ракообразных, показавшие наиболее высокий уровень ферментативной активности, могут служить хорошими источниками для выделения этих ферментов. 2. Из морского моллюска L. kurila выделены высокоочищенные препараты ферментов, которые могут принимать участие в трансформации фукоидана: фукоиданаза, cc-L-фукозидаза и сульфатаза. Установлены молекулярные массы, Кт, термостабильность и рН-оптимумы выделенных ферментов. Установлено, что a-L-фукозидаза гидролизует синтетический субстрат (и-нитрофенил-a-L-фукопиранозид) и не действуют на природный фукоидан. 3. Сульфатаза из L. кигйа не действует на сульфатированные полиоксистероиды, ингибирующие ферментативную активность. Фермент не действует на природный фукоидан, сульфатированные производные фукозы, но десульфатирует остатки ксилозы, входящие в состав гликозидов голостанового ряда. 4. Впервые показано, что фукоиданаза из L. kurila расщепляет доступные а-1— 3 связи между остатками фукозы в молекуле фукоидана с образованием сульфатированных олигосахаридов и фукозы. 5. Глюканаза из гепатопанкреаса морского моллюска L. kurila отнесена к ферментам эндо-типа действия. Она катализирует гидролиз (3-1— 3 связей в (3-1— 3;1— 6 - глюканах (ламинаране и трансламе) с образованием олигосахаридов (и = 2-10) и глюкозы и обладает трансгликозилирующей активностью. 6. Из неоплодотворенных яйцеклеток морского ежа S. intermedius выделена 1—»3 P-D-глюканаза. Показано, что эта 1—»3-(3-0-глюканаза осуществляет гидролиз ламинарана с сохранением конфигурации расщепляемой связи и с высоким выходом глюкозы в продуктах реакции, действует на модифицированные субстраты. Она обладает трансгликозилирующей активностью и является, по видимому, ферментом эндо-типа действия.
Похожие диссертации на О-гликозилгидролазы морских беспозвоночных. Свойства и специфичность фукоиданаз, сульфатаз и 1->3-b-D-глюканаз
