Введение к работе
Актуальность проблемы. Оксидаза D-аминокислот относится к классу FAD-содержащих оксидоредуктаз и катализирует окислительное дезаминирование D-аминокислот в соответствующие а-кетокислоты (КФ 1.4.3.3, DAAO). Фермент играет исключительно важную роль в метаболизме микроорганизмов. В организме животных и человека DAAO отвечает за поддержание определенного уровня D-аминокислот в клетке. Например, в тканях мозга фермент контролирует содержание D-серина, который участвует в регуляции деятельности нервной системы. В настоящее время установлено, что повышенная активность DAAO в мозге служит одной из причин возникновения шизофрении. У пациентов, страдающих болезнью Альцгеймера, наблюдается снижение активности фермента, в результате чего в тканях мозга значительно возрастает содержание D-аланина. Пониженная активность DAAO характерна также для некоторых почечных заболеваний. Кроме того, оксидаза D-аминокислот принимает участие в регуляции процессов старения.
На практике этот фермент используется главным образом в биокаталитическом процессе окисления цефалоспорина С в 7-аминоцефало-спорановую кислоту (7-АЦК) - исходное соединение для производства полусинтетических цефалоспоринов различных поколений (доля бета-лактамных антибиотиков составляет 10% от стоимости всех производимых в мире фармацевтических препаратов). Помимо этого, DAAO активно применяется в аналитической биотехнологии, хирапьном синтезе, получении неприродных L-аминокислот и а-кетокислот и имеет большое потенциальное значение для создания систем диагностики и мониторинга ряда психосоматических (шизофрения, амиотрофический боковой склероз, болезни Альцгеймера и Паркинсона и др.) и онкологических заболеваний.
Несмотря на высокую теоретическую и практическую значимость, оксидаза D-аминокислот до недавнего времени была малоизученным ферментом. Фактически в настоящее время накоплен достаточно большой объем экспериментальных данных для DAAO из почки свиньи (pkDAAO) и из дрожжей Rhodotorula gracilis (RgDAAO). Трехмерные структуры этих ферментов были определены в 1996 и 2000 годах соответственно. Для pkDAAO и RgDAAO в литературе имеются данные по детальному изучению механизма действия этих ферментов методом направленного мутагенеза. В 2006 году была опубликована структура еще одной DAAO - фермента из человека (hDAAO). Интерес ученых к этому ферменту активно растет в последние годы в связи с открытием новых аспектов, связанных с физиологической ролью hDAAO в организме человека.
Среди всех известных оксидаз D-аминокислот наиболее широкое применение на практике находит фермент из дрожжей Trigonopsis variabilis (TvDAAO), поскольку по сравнению с известными ферментами из других источников TvDAAO обладает самой высокой температурной стабильностью и активностью с цефалоспорином С. Создание высокоэффективных биокатализаторов на основе TvDAAO невозможно без проведения фундаментальных исследований по изучению взаимосвязи структуры и
функции этого фермента и направленной инженерии его свойств, в частности, температурной стабильности и субстратной специфичности. Другой очень важной задачей по инженерии TvDAAO является повышение активности фермента в реакции окисления цефалоспорина С.
Одним из самых эффективных методов как для фундаментального исследования структуры и функции ферментов, так и для направленного изменения их каталитических свойств и стабильности является метод рационального дизайна. Этот метод сочетает анализ трехмерной структуры фермента с последующим введением выбранных на основе анализа аминокислотных замен с помощью направленного мутагенеза. В настоящее время в литературе имеется небольшое количество публикаций по белковой инженерии TvDAAO. Это связано с отсутствием у исследователей данных по трехмерной структуре фермента, хотя эксперименты по кристаллизации TvDAAO проводились во многих лабораториях более 20 лет. В 2007 году в нашей лаборатории была решена первая структура мутантной TvDAAO, которая остается единственной до настоящего времени. Наличие трехмерной структуры TvDAAO создает основу для проведения экспериментов по белковой инженерии этого фермента с помощью рационального дизайна.
Цели исследования. Основной целью работы было изучение взаимосвязи структура-функция в оксидазе D-аминокислот из дрожжей T.variabilis методами белковой инженерии. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:
исследование роли водородных связей в области межсубъединичного контакта TvDAAO;
оптимизация структуры FAD-связывающего домена;
повышение температурной стабильности TvDAAO;
улучшение каталитических параметров TvDAAO в реакции окисления цефалоспорина С.
Научная новизна. В ходе выполнения данной работы проведен анализ структуры оксидазы D-аминокислот из дрожжей T.variabilis, и выбраны перспективные положения для введения аминокислотных замен. Методом направленного мутагенеза получены 27 мутантных ферментов с аминокислотными заменами в области субстрат- и кофактор-связывающих доменов, а также в области межсубъединичного контакта. Кроме этого, к TvDAAO для повышения термостабильности впервые применен подход гидрофобизации а-спиралей. Введение точечных аминокислотных замен позволило увеличить каталитическую эффективность с рядом D-аминокислот в 2-16 раз. Показано, что введение различных аминокислотных замен в одно и то же положение приводит к получению мутантных форм фермента с различным профилем субстратной специфичности. Методом рационального дизайна получены мутантные TvDAAO с улучшенной эффективностью в реакции окисления цефалоспорина С. Ряд замен привел к повышению температурной стабильности фермента.
Практическая значимость работы. Получение мутантных TvDAAO с измененным узким спектром субстратной специфичности открывает перспективы для
создания селективных биосенсоров на D-аминокислоты для целей медицинской диагностики и аналитической биотехнологии. Мутантные ферменты с повышенной термостабильностью и улучшенной эффективностью в реакции окисления цефалоспорина С могут быть успешно использованы в биферментом биокаталитическом процессе получения 7-АЦК из цефалоспорина С.
Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были представлены на международных конгрессах, конференциях и школах: International Conference "Biocatalysis: Fundamentals & Applications" (Arkhangelsk, 2009), Пятый, Шестой и Седьмой Московский международный конгресс "Биотехнология: состояние и перспективы развития" (Москва, 2009, 2011, 2012), XI Международная конференция молодых ученых «Леса Евразии - Брянский лес» (Брянск, Россия, 2011), 14th International Biotechnology Symposium. (Rimini, Italy, 2010), Международный молодежный форум «Ломоносов-2011» (Москва), 2-я международная школа «Наноматериалы и нанотехнологии в живых системах. Безопасность и наномедицина» (Пансионат «Заря», Московская область, Россия, 2011), Международная конференция «Ломоносов и Гумбольдт: научное сотрудничество России и Германии - от истоков до наших дней» (2011), XIX Молодежная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (Москва, 2012), The 20th INPEC Conference "Engineering Protein - Systems, Functions and Applications", (Taipei, Taiwan, 2012), 9th International Conference on Protein Stabilization - ProStab2012 "From Molecular Level to market applications" (Lisbon, Portugal, 2012), V International Meeting "Early events in Human Pathologies" (Listvyanka, Baikal, Russia, 2012).
По результатам выполненных исследований автор в 2012 г. был удостоен почетного звания «Лауреат стипендии имени ВЛ.Кретовича».
Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 5 статей в ведущих международном и российских журналах (все журналы входят в Перечень рецензируемых научных журналов ВАК РФ), 14 тезисов докладов конференций и подана одна заявка на патент РФ на изобретение.
Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Диссертация изложена на 166 страницах и содержит 41 рисунок, 31 таблицу и 164 ссылки.
