Введение к работе
Актуальность проблемы. Оксидаза D-аминокислот относится к классу FAD-содержащих оксидоредуктаз и катализирует окислительное дезаминирование D-аминокислот с образованием соответствующих а-кетокислот (КФ 1.4.3.3, DAAO*). Фермент играет исключительно важную роль в метаболизме микроорганизмов. В организме животных и человека DAAO отвечает за поддержание определенного уровня D-аминокислот в клетке. Например, в тканях мозга фермент контролирует содержание D-серина, который участвует в регуляции деятельности нервной системы. В настоящее время установлено, что повышенная активность DAAO в мозге служит одной из причин возникновения шизофрении. У страдающих болезнью Альцгеймера наблюдается снижение активности фермента, в результате чего в тканях мозга значительно возрастает содержание D-аланина. Пониженная активность DAAO характерна также для некоторых почечных заболеваний. Кроме того, оксидаза D-аминокислот принимает участие в регуляции процессов старения.
На практике этот фермент используется, главным образом, в биокаталитическом процессе окисления цефалоспорина С в 7-аминоцефалоспора-новую кислоту - исходное соединение для производства полусинтетических цефалоспоринов различных поколений (доля бета-лактамных антибиотиков составляет 10% от стоимости всех производимых в мире фармацевтических препаратов). Помимо этого, DAAO активно применяется в аналитичебкой биотехнологии, для хирального синтеза и имеет потенциальное значение для создания систем диагностики и мониторинга ряда психосоматических (шизофрении, болезни Альцгеймера и Паркинсона и др.) и онкологических заболеваний.
Среди всех известных оксидаз D-аминокислот наиболее широкое применение на практике находит фермент из дрожжей Trigonopsis variabilis (TvDAAO). Это связано с его высокой температурной стабильностью и наиболее высокой активностью с цефалоспорином С среди DAAO из других источников. Однако, несмотря на более чем 30-летнюю историю исследования TvDAAO, количество экспериментальных данных о структуре и механизме действия этого фермента в настоящий момент невелико. Можно выделить несколько первоочередных задач и проблем, которые требуют решения для масштабного применения фермента на практике. Первой проблемой является отсутствие эффективной системы получения TvDAAO. В основном для биосинтеза фермента используют мутантные штаммы Т. variabilis и рекомбинантные штаммы бактерий Е. со//' и дрожжей Pichia pastoris,
' В настоящей работе приняты следующие сокращения: DAAO - оксидаза D-аминокислот, TvDAAO - оксидаза D-аминокислот из дрожжей Trigonopsis variabilis, wt-TvDAAO -рекомбинантнаЗ оксидаза D-аминокислот дикого типа, RgDAAO - оксидаза D-аминокислот из дрожжей Rhodotorula gracilis, FAD - фпавинадениндинуклеотид, ИПТГ -изопропил-р-О-тиогалактозид.
однако высокого содержания целевого продукта в клетке достичь не удается. Поэтому в настоящее время себестоимость получения TvDAAO достаточно высока. Во-вторых, несмотря на то, что TvDAAO является наиболее термостабильным ферментом среди известных оксидаз D-аминокислот, ее операционная и температурная стабильности недостаточно высоки для эффективного применения на практике. В-третьих, фермент проявляет высокую активность с ограниченным набором D-аминокислот. Поэтому для повышения его каталитической активности с остальными D-аминокислотами и другими перспективными субстратами (как природными, так и неприродными) стоит задача получения мутантных форм фермента с заданной субстратной специфичностью. Наконец, среди четырех наиболее активно исследуемых оксидаз D-аминокислот - из свиньи, человека, дрожжей Rhodotorula gracilis (RgDAAO) и Т. variabilis, данные о трехмерной структуре имеются только для трех первых ферментов. Для TvDAAO данные о структуре отсутствуют, что не позволяет проводить детальное исследование механизма действия фермента и направленное изменение его свойств методами белковой инженерии. Те немногочисленные эксперименты по направленному мутагенезу TvDAAO, которые описаны в литературе, не привели к улучшению каталитических или каких-либо иных свойств полученных мутантных форм по сравнению с ферментом дикого типа.
Цели исследования. Целью данной работы было решение следующих задач:
Разработка высокоэффективной системы экспрессии гена tvdaao в клетках Е. coli.
Изучение свойств рекомбинантного фермента дикого типа.
Получение мутантных форм TvDAAO с измененной субстратной специфичностью и повышенной температурной стабильностью.
Определение трехмерной структуры оксидазы D-аминокислот из дрожжей Т. variabilis.
Исследование каталитической эффективности фермента дикого типа и мутантных TvDAAO в реакции окисления цефалоспорина С.
Научная новизна. Впервые для TvDAAO детально изучен механизм температурной инактивации при различных температурах и концентрациях фермента. Показано, что в диапазоне температур 50-60 С реализуется диссоциативный механизм термоинактивации, при более высоких и низких температурах инактивация протекает в соответствии с мономолекулярным механизмом.
В настоящей работе впервые были получены мутантные формы оксидазы D-аминокислот из дрожжей Т. variabilis с улучшенными свойствами. Введение точечных аминокислотных замен позволило увеличить каталитическую эффективность с рядом D-аминокислот в 2-8 раз. Температурная стабильность одного из мутеинов была увеличена в 2,2 раза по сравнению с ферментом дикого
типа (wt-TvDAAO). Было показано, что введение различных аминокислотных замен в одно и то же положение приводит к получению мутантных форм фермента с различным профилем субстратной специфичности.
Использование подхода по гидрофобизации белковой глобулы позволило получить кристаллы мутантного фермента. В результате впервые для оксидазы D-аминокислот из дрожжей Trigonopsis variabilis была определена трехмерная структура (разрешение 1,8 А).
Практическая значимость работы. Разработана высокоэффективная система экспрессии рекомбинантной TvDAAO в клетках E.coli с выходом 35000 Ед с литра среды, что превышает известные мировые аналоги минимум в^-2 раза. Получены две мутантные формы фермента, каталитическая эффективность которых в реакции окисления цефалоспорина С в 3 и 4,4 раза выше по сравнению с ферментом дикого типа. Три мутантные TvDAAO не взаимодействуют с D-аланином, что делает их идеальными кандидатами для использования в электрохимических биосенсорах для селективного определения D-серина в нервных тканях. Разработана методика количественного определения DAAO как в биологических жидкостях, так и в колониях целых клеток, что было использовано для скрининга библиотек мутантных клонов. Определение трехмерной структуры фермента позволило создать основу для проведения экспериментов по его белковой инженерии.
Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были представлены на международных конференциях: International Symposium on Biocatalysis and Biotransformations "Biotrans" (Delft, The Netherlands, 2005, Oviedo, Spain, 2007), International Symposium on Environmental Biocatalysis: From Remediation With Enzymes to Novel Green Processes (Cordoba, Spain, 2006), the 4th Moscow International Congress "Biotechnology: State of the Art and Prospects of Development" (Moscow, Russia, 2007), International Conference "Biocatalysis: Fundamentals & Applications" (Moscow-St.Petersburg, Russia, 2007), the 2nd International Conference "Biocatalysis in Non-Conventional Media" (Moscow, Russia, 2008), the 13m International Biotechnology Symposium and Exhibition (Dalian, China, 2008) и на IV Съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, Россия, 2008).
Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 5 статей и 8 тезисов докладов конференций, получено положительное решение на выдачу патента РФ.
Стуктура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа содержит 161 страниц печатного текста, 49 рисунков, 24 таблицы и 229 ссылок.
