Содержание к диссертации
ВВЕДЕНИЕ 6
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 9
Глава I. Структура и функции урокиназы 9
Структура урокиназы 9
Функции урокиназы 10
Глава П. Регуляция активности урокиназы 16
Регуляция экспрессии урокиназы 16
Посттрансляционные модификации урокиназы 17
Белки-регуляторы протеолитической и сигнальной функции урокиназы 18
Глава Ш Фибулин-5 - новый регулятор ремоделирования сосудов и тканей 46
Структурная организация семейства фибулинов 46
Структура и функции фибулина-5 47
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 53
Химические реактивы 53
Культуральные среды и пластик 54
Антитела 54
Рекомбинантная урокиназа 55
Рекомбинантный фибулин-5 55
Определение концентрации белка в пробах 56
Иммобилизация белков 56
Аффинная хроматография белков, связывающихся 57
сурокиназой без «ростового» домена 57
Секвенирование белков 58
Приготовление вектора pCMV-FBLN5 58
Сайт-направленный мутагенез 59
Получение химически компетентных клеток Е.соН 59
Выделение плазммдной ДНК изЕ. соЗі 60
Культивирование итрансфекция культуры клеток 60
Аффинная хроматография и иммунопреципитация фибулина-5 из кондиционных сред
трансфецированных клеток линии СНО и НЕК293 61
Иммуноцитохимическое окрашивание клеток 62
Биотинилирование урокиназы 62
ДСН-электрофорез 63
Иммуноблоттинг. 63
Лигандный блоттинг 63
Получение общего клеточного лизата , 64
Измерение активности урокиназы 64
Зимография урокиназы 64
Твердофазный анализ связывания белков 65
Количественный метод обратной транскрипции-полимеразной цепной реакции в
реальном времени 65
РЕЗУЛЬТАТЫ 66
1. Выделение и идентификация белков, связывающих урокиназу 66
1-1. Поиск белка, связывающего урокиназу без «ростового» домена 66
1-2. Идентификация белка с кажущейся молекулярной массой 65 кДа методом масс-
спектрометрии _ 66
2. Взаимодействие урокиназы и белка внеклеточного матрикса фибулина-5 68
2.1. Клонирование кДНК фябулина-5 и его экспрессия в клетках СНО 68
Прямое взаимодействие урокиназы и фибулина-5 71
Взаимодействие фибулина-5 с урокиназой на клеточной поверхности 73
2.4. Доменная специфичность взаимодействия урокиназы и фибулина-5 77
2,6 Фибулин-5 как возможный протеолитический субстрат урокиназы 80
3. Влияние фибулина-5 на протеолитическую активность урокиназы 82
Влияние фибулина-5 на амидолитическуго активность урокиназы и скорость активации плазминогена 82
Влияние фибулина-5 на активность урокиназы в клетках и тканях легкого 84
3.4. Влияние фибулина-5 на подавление активности урокиназы под действием РАІ-Ї,, 86
4, Влияние фибулина-5 на хемотактические свойства урокиназы 90
ОБСУЖДЕНИЕ 94
Взаимодействие урокиназы с интегрин-связьшающими белком фибулином-5 94
Фибулин-5 участвует в регуляции протеолитической активности урокиназы 97
Фибулин-5 является ингибитором хемотактических свойств урокиназы 100
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 102
ВЫВОДЫ 103
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 104
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
bFGF
CREB
EGFR
ERIC
FPRL1
gp330/megalin
IL-lp
INF-y
LRP/a3-MR
МАРК
MLCK
PAI-1
PAI-2
PDGF
фактор роста фибробластов -2
белок, связывающийся с цАМФ-зависимыми элементами эпидермальный фактор роста рецептор эпидермального ростового фактора киназа, регулируемая внеклеточным сигналом киназа фокальных контактов эмбриональная бычья сыворотка рецептор, подобный рецептору формил-пептида -1 «ростовой» домен урокиназы гликопротеин 330/мегалин ростовой фактор гепатоцитов интерлейкив ір
гамма- интерферон
крингл-домен урокиназы
липопротеины низкой плотности
низкомолекулярная форма урокиназы
белок, родственный рецептору липопротеидов низкой плотности/рецептор
аг-макроглобулина,
протеинкиназа, активируемая митогенами
киназа легких цепей миозина
ингибитор активаторов плазминогена-1
ингибитор активаторов плазминогена-2
тромбоцитарный фактор роста
PICA PKC
PN-1
sc-uPA
TGF-J3
uPAAGFD
uPAR
VLDLR
ПААГ
ПВДФ
ФМСФ
ФНО-а
ц-АМФ
ЭДТА
цАМФ-зависимая протеинкиназа протеинкиназа С протеазный нексин 1 одноцепочечная форма урокишзы трансформирующий фактор роста (3 фактор некроза опухоли тканевой активатор пламиногена
активатор плазминогека урокиназного типа (двухцепочечная урокиназа, урокиназа)
урокиназа без «ростового» домена рецептор урокиназы
рецептор липопротеинов очень низкой плотности бычий сывороточный альбумин гладкомышечные клетки гликозилфосфатидилинозитол додецилсульфат натрия полиакриламидный гель поливинилидендифлуорид феяилметилсульфонилфторид фактор некроза опухолей а
фосфатно-солевой буфер
циклический аденозинмонофосфат
этилендиаминтетраацетат
Введение к работе
Активатор плазминогена урокиназкого типа (урокиназа) играет важную роль в регуляции таких биологических процессов, как ангиогенез (Rabbani et al., 2001) ранозаживление (Berta et al., 1990), воспаление (Busso et al, 1998), атеросклероз (Okada et al., 1998), образование аневризмы (Carmeliet et al., 1997) и метастазировагше опухолей (Ossowskl et al., 1991). Урокиназа специфически расщепляет плазминоген и обеспечивает протеолиз фибриновых сгустков (Vassalli et al., 1991), а также стимулирует клеточную адгезию и миграцию (Chapman et al., 1997). Удаление гена урокиназы у мышей приводит к увеличению количества спонтанных тромбозов и отложению фибрина в кишечнике, синусоидных капиллярах печени (Carmeliet et al, 1994). Для мышей, лишенньос гена урокиназы, характерна меньшая выживаемость при микроэмболии легких (Bdeir et al., 2000) и усиление процессов тромбообразования в ответ на воздействие эндотоксинами (Carmeliet et al., 1994) или гипоксией (Pinsky et al., 1998). С другой стороны, у этих мышей наблюдалось значительно менее выраженное образование неоинтимы в ответ на повреждение сосуда (Carmeliet et al., 1997).
Урокиназа является протеазой серинового типа и состоит из 3 доменов: N-концевого домена, гомологичного эпидермальному фактору роста (GFD, аминокислоты 1-43), крингл домена (KD, аминокислоты 44-135) и протеолитического домена (LMW, аминокислоты 136-411) (Степанова и Ткачук, 2002). Через «ростовой» домен урокиназа связывается с высокоаффинным рецептором uPAR (Appella et al., 1987; Ploug et al 1998). Протеазный домен урокиназы содержит активный центр фермента и опосредует активацию плазминогена. Активность урокиназы контролируется ее физиологическими ингибиторам, важнейшим из которых является представитель из семейства серпиновых ингибиторов JPAI-1, образующий ковалентную связь с серином в активном центре (LoskutofF et al., 1989). Крингл-домен урокиназы принимает участие в связывании интегринов (Pluskota et al., 2004), а также стабилизирует связывание урокиназы с uPAR (Bdeir et al., 2003). В нашей лаборатории было показано, что крингл домен опосредует хемотактический эффект урокиназы (Mukhina et al., 2000).
Секретируемая клетками одноцепочечная форма урокиназы проявляет низкую пептидазную активность в отношении синтетических субстратов (Pannell et al., 1987). При активации плазмином происходит расщепление связи LysbS-Ile159, и образуется двухцепочечная форма урокиназы, которая состоит из двух полипептидных цепей,
і ло ото
связанных между собой дисульфидной связью Cys -Cys (Kasai et al., 1985), Активная
7 двухцепочечная форма урокииазы обладает пептидазной активностью по отношению к синтетическим субстратам и шшминогеиу (Lijnen et al., 1990). Двухцеггочечная урокиназа быстро и необратимо инактивируется РАМ, присутствующим в плазме в большом молярном избытке. Более того, при образовании тромба концентрация РА1-1 значительно увеличивается в результате секреции РАТ-1 тромбоцитами и сосудистыми клетками (Fajii et al,, 1992; Schafer et al., 2003). uPAR-связанный ковалентный комплекс урокииазы с PAI-1 взаимодействует с рецептором из семейства LRP и интернализуется через окаймленные ямки. Урокиназа и PAI-1 подвергаются деградации в лизосомах, в то время как uPAR возвращается на поверхность клетки (Nykjaer et al., 1994; Czekay et al, 2001). Урокиназа, связанная с uPAR, менее подвержена ингибированию под действием PAI-1, чем свободная форма фермента (Ellis et al., 1990). Молекулярные механизмы сохранения протеолитической активности двухцепочечной урокииазы в условиях избытка PAI-1 в процессах лизиса тромба, клеточной миграции и ремоделирования сосудов не выяснены.
Недавно в нашей лаборатории было показано существование на клетках дополнительных участков связывания для урокиназы, один из которых взаимодействует с урокиназой через ее протеолитический домен (Poliakov et al., 2001), тогда как другой проявлял способность связывать крингл-домен. Взаимодействие со вторым участком не зависело от присутствия в структуре урокиназы «ростового» домена и приводило к стимуляции урокиназой миграции клеток (Mukhina et al., 2000). Также было установлено, что на поверхности клеток может происходить образование формы урокиназы, лишенной «ростового» домена, которая не способна связываться с uPAR. Урокиназа без «ростового» домена подвергалась при этом быстрому LRP-зависимому эндоцитозу и внутриклеточной деградации (Poliakov et al, 2001). Посколысу было показано, что LRP опосредует активацию миграции и пролиферации клеток, а также вовлечен в регуляцию проницаемости сосудистой стенки (Liliis et al., 2005), нами было высказано предположение, что новая мишень, совместно с LRP, может обеспечивать связывание урокиназы без «ростового» домена с поверхностью клеток, а также принимать участие в регуляции ее ферментативной и хемотактической активности.
В связи с этим, щелью нашей работы было выделение, идентификация и характеристика еовой мишени связывания урокиназы, отличной от швестного рецептора uFAR/CD87. Для этого мы поставили перед собой следующие задачи:
1. Выделить и идентифицировать белок, представляющий собой новый участок связывания урокиназы без «ростового» домена.
2. Охараісгєризовать аффинность и доменную специфичность взаимодействия урокиназы с
новой мишенью.
3. Изучить влияние нового партнера урокиназы на ее функциональные свойства-
протеолитическую активность, взаимодействие с физиологическим ингибиторами, а также
хемотактические свойства.
