Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Обзор литературы 12
1.1. Липоксигеназы растений 12
1.1.1. Липоксигеназная реакция и субстратные предпочтения 15
1.1.2. Модели специфичности действия липоксигеназ 22
1.1.3. Ренгеноструктурный анализ липоксигеназ 27
1.1.4. Липоксигеназа-3 кукурузы (ZmLOX3) 32
1.2. Липоксигеназная сигнальная система растений 33
1.2.2. Алленоксидсинтазный путь 37
1.2.3. Гидропероксидлиазный путь 40
1.2.4. Дивинилэфирсинтазный путь 42
1.3. Постановка цели исследования 45
Глава II. Материалы и методы 47
2.1. Получение продуцентов рекомбинантных ферментов 47
2.2. Полимеразная цепная реакция 50
2.3. Сайт-направленный мутагенез 52
2.4. Определение нуклеотидной последовательности 53
2.5. Получение рекомбинантного фермента 54
2.7. Кинетические исследования 57
2.8. Дериватизация продуктов реакции 58
2.9. Высокоэффективная жидкостная хроматография 58
2.10. Масс-спектрометрические исследования 58
Глава III. Результаты и их обсуждение 60
3.1. Получение рекомбинатного фермента ZmLOX3 60
3.1.1. Экспрессия и лизис культуры-продуцента 60
3.1.2. Очистка рекомбинантного фермента 62
3.1.3. Стабильность рекомбинантного фермента ZmLOX3 64
3.2. Окисление свободных жирных кислот 67
3.2.1. Окисление линолевой кислоты при участии ZmLOX3 67
3.2.2. Окисление высших гомологов линолевой кислоты при участии ZmLOX3 и GmLOXl 70
3.2.3. Окисление жирных кислот гексадеканового ряда при участии ZmLOX3 и GmLOXl 74
3.2.4. Особенности окисления свободных жирных кислот при участии ZmLOX3 и GmLOX 76
3.3. Гексадеканоидный путь в растениях 80
3.3.1. Идентификация производных 16:3 в растениях in vivo 80
3.3.2. Участие (7і!>)-гидроперекиси 16:3 в липоксигеназном пути 84
3.4. Сайт-направленный мутагенез ZmLOX3 86
3.4.1. Создание мутантных форм ZmLOX3 86
3.4.3. Окисление линолевой кислоты при участии мутантных форм ZmLOX3 88
3.4.4. Окисление сложных липидов при участии ZmLOX3 дикого типа и ее мутантной формы Ala562Gly 94
3.4.1. Трехмерная модель ZmLOX3 98
3.5. Модель позиционирования субстратов в активном центре липоксигеназ 100
Заключение 107
Выводы 111
Список литературы 112
- Модели специфичности действия липоксигеназ
- Липоксигеназная сигнальная система растений
- Получение продуцентов рекомбинантных ферментов
- Особенности окисления свободных жирных кислот при участии ZmLOX3 и GmLOX
Введение к работе
Постановка проблемы и ее актуальность. Окисленные производные жирных кислот - оксилипины - выступают в качестве сигнальных молекул, определяющих физиологическое состояние растений, животных и микроорганизмов [Guerrero et al, 1997; Hamberg et al, 1998; Su, Oliw, 1998; Hornsten et al, 2002; Vance et al, 2004; Vidal-Mas et al, 2005]. Эти вещества участвуют в регуляции роста, развития, ответа на ряд биотических и абиотических стрессоров у растений. Являясь продуктами жизнедеятельности многих микроорганизмов, оксилипины задействованы в процессах коммуникации между патогеном и хозяином.
Ключевым ферментом липоксигеназного пути является липоксигеназа (ЛОГ; линолеат:кислород оксидоредуктаза ЕС 1.13.11.12). Липоксигеназы животных, водорослей, грибов и микроорганизмов используют в качестве субстрата Сго-жирные кислоты (например, арахидоновую кислоту), в то время как липоксигеназы растений катализируют превращение Сі8-жирньгх кислот (линолевой и а-линоленовой кислоты). У многих видов растений, животных и микроорганизмов определены нуклеотидные последовательности генов липоксигеназ. В то же время лишь некоторые из них клонированы с целью исследования функциональных белковых продуктов.
В зависимости от образуемых региоизомеров продуктов реакции, липоксигеназы растений разделяются на (9S)- и (135)-специфичные. Относительно механизмов катализа, определяющих специфичность действия ферментов данного класса, единого мнения у исследователей не существует. Классическим объектом для исследования моделей взаимодействия субстрата с активным центром является (135)-специфичная липоксигеназа-1 сои (GmLOXl), для которой получены данные рентгеноструктурного анализа [Tomchick et al, 2001]. Предложено несколько моделей взаимодействия активного центра липоксигеназ с арахидоновой и линолевой кислотами. Эти модели достаточно хорошо описывают каталитические свойства (135)-специфичных липоксигеназ, однако не согласуются с экспериментальными данными, полученными при изучении ^^-специфичных липоксигеназ. Не исследованным остается вопрос о каталитической активности липоксигеназ растений в отношении других ненасыщенных жирных кислот, кроме линолевой и а-линоленовой, в том числе жирных кислот гек-садеканового ряда, составляющих до 20% от общего количества липидов в 16:3 растениях [Jamieson, Reid 1971; Mongrand et al, 2005].
У всех изученных видов растений обнаружено несколько изоформ как (9S)-, так и (135)-специфичных липоксигеназ. Это затрудняет изучение отдельных ферментов, выделяемых из гомогенатов тканей [Gardner, 1989]. В этой связи, перспективным подходом для изучения каталитических особенностей индивидуальных ферментов является клонирование соответствующих генов с последующей их экспрессией в ге-терологичных системах. Данная технология также облегчает проведение направленных модификаций первичной структуры изучаемых белков, что служит эффективным инструментом для проверки предполагаемых моделей катализа.
Цель и задачи исследования. Целью нашего исследования являлось выяснение механизма каталитического действия рекомбинантной (^^-специфичной липоксиге-назы-3 (ZmLOX3) кукурузы.
Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:
Получение и характеристика рекомбинантного фермента ZmLOX3.
Сравнение регио- и стереоспецифичности действия ZmLOX3 и (135)-специфичной (GmLOXl) липоксигеназы-1 сои при использовании в качестве субстратов гомологов линолевой и а-линоленовой кислот с разной длиной углеродной цепи.
Выявление особенностей каталитически важных доменов ZmLOX3 и определение вариантов их направленной модификации.
Получение мутантных форм ZmLOX3. Сравнение особенностей превращения линолевой кислоты и сложных липидов при участии фермента дикого типа и его му-тантной формы.
Построение моделей взаимодействия ZmLOX3 и GmLOXl с субстратами на основании экспериментальных данных и компьютерного моделирования.
Научная новизна работы. Проведенные исследования расширяют представления о теории специфичности действия ферментов липоксигеназ. На основании компьютерного моделирования и полученных экспериментальных данных определены факторы, влияющие на специфичность окисления субстратов при участии (9S)- и (135)-липоксигеназ растений (ZmLOX3 и GmLOXl). Показано, что позиционирование субстратов в активном центре GmLOXl и ZmLOX3 различается, однако, вне зависимости от региоспецифичности фермента проникновение субстрата в активный центр липоксигеназ осуществляется метильным концом вперед. Специфичность действия ZmLOX3 определяется лимитированным объемом активного центра, его пространственной структурой, положением ключевых аминокислотных остатков и атома железа. Выявлено, что проявление специфичности действия ZmLOX3 возможно при использовании жирных кислот октадеканового и гексадеканового ряда, встречающихся в растениях.
Полученные данные открывают перспективы для изучения гексадеканоидного липоксигеназного пути и физиологической роли его продуктов в растениях. Впервые обнаружено, что ZmLOX3 и GmLOXl диоксигенируют жирные кислоты с укороченной по сравнению с линолевой кислотой углеродной цепью по (п-2) и (п+2) типу в зависимости от специфичности действия ферментов. Показано участие (7Z,10Z,13Z)-гексадекатриеновой кислоты в классическом 9-липоксигеназном пути растений.
Результаты работы могут способствовать разработке алгоритмов направленной модификации белков с целью получения ферментов с заданными свойствами. На основе разработанной модели выявлены консервативные участки полипептидной цепи ZmLOX3 и предложены варианты мутаций, с высокой вероятностью влияющие на каталитические свойства фермента. В результате единичной аминокислотной замены изменена региоспецифичность действия ZmLOX3.
Научно-практическая значимость работы. Полученные данные вносят вклад в понимание функционирования одной из ключевых сигнальных систем растения, способствующей его адаптации к неблагоприятным условиям. Изучены механизмы образования продуктов функционирования липоксигеназной сигнальной системы -оксилипинов, участвующих в процессах онтогенеза растений, таких как созревание плодов, прорастание семян, образование пыльцы, развитие цветков, корней и других органов, а также в формировании ответа на стрессовые факторы.
Разработаны системы получения и очистки препаративных количеств липокси-геназ растений. Использование технологии рекомбинантных ДНК и различных систем экспрессии дало возможность получения рекомбинантных белков данного класса для последующего возможного использования в промышленности, поскольку количество многих белков часто ограничено низкой доступностью в природе.
Возможность направленных превращений ферментов открывает новые способы модификации их каталитических свойств. Качественное изменение ферментативного катализа при сайт-направленном мутагенезе представляет потенциальный интерес для практического использования в области биоинженерии с целью получения ферментов с заданными свойствами.
Экспериментальные данные и методические приемы, изложенные в работе, могут быть использованы в учреждениях медицинского, сельскохозяйственного, биологического и биотехнологического профилей, занимающихся получением рекомбинантных ферментов, исследованием взаимосвязи структуры и функций белков, а также в учебном процессе при чтении курсов лекций по биохимии, физиологии растений и молекулярной биологии в ВУЗах.
Связь работы с научными программами и собственный вклад автора в исследования. Работа проводилась с 2006 по 2009 гг. в соответствии с планом научных исследований УРАН КИББ КазНЦ РАН по теме «Липоксигеназы растений. Изучение молекулярных механизмов катализа и поиск новых физиологически активных продуктов» (гос. регистрационный номер 0120.0 603843). Исследования автора, как исполнителя данной тематики, поддержаны грантом РФФИ № 06-04-48430-а «Липоксигеназы растений. От первичного строения - к пониманию молекулярных механизмов действия», и грантом Президиума РАН (программа «Молекулярная и клеточная биология»), а также грантом ведущей научной школы академика И.А. Тарчевского НШ-5492.2008.4. Научные положения и выводы диссертации базируются на результатах собственных исследований автора.
Апробация работы. Результаты диссертационной работы доложены на 12-ой Международной школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2008); на I Всероссийском конгрессе студентов и аспирантов «Симбиоз Россия 2008» (Казань, 2008); на Международной школе-конференции «Генетика микроорганизмов и биотехнология» (Москва-Пущино, 2008); на IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008); на II Между-
народной конференции «Постгеномная эра в биологии и проблемы биотехнологии» (Казань, 2008); на Международном симпозиуме «Растительные липиды и оксилипи-ны» (Казань, 2008); на Международном симпозиуме «Регуляторные оксилипины» (Швейцария, Лозанна, 2009); на Международной конференции «Симбиоз-2009: Биология - расширение границ» (Казань, 2009); на II Всероссийском конгрессе студентов и аспирантов «Симбиоз Россия-2009» (Пермь, 2009); на 13-ой Международной Пу-щинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пушино, 2009); на IV Российском симпозиуме «Белки и пептиды» (Казань, 2009). Работа награждена дипломом I степени I Всероссийского конгресса студентов и аспирантов «Симбиоз Россия-2008» (Казань, 2008).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 15 работ, из них три статьи в рецензируемых изданиях.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 139 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, изложения и обсуждения результатов, заключения, выводов и списка литературы, включающего 266 источников, из них 259 зарубежных. В работе представлено 6 таблиц и 33 рисунка.
Модели специфичности действия липоксигеназ
Существует несколько моделей, объясняющих специфичность действия липоксигеназ растений. Гипотеза «ориентации субстрата» говорит о том, что ключевым фактором в определении специфичности действия липоксигеназ является ориентация субстрата в субстрат-связывающем кармане (рис. 3). Для 13-специфичных ферментов характерно проникновение субстрата в активный центр метальным концом, для 9-специфичных липоксигеназ -карбоксильным концом [Gardner, 1989]. Эта теория базируется на результатах эксперимента с выделенной из растений сои липоксигеназой-1. Преобладающим продуктом при щелочных значениях рН являлась (135)-гидроперекись, при кислых значениях рН увеличивалось количество (95)-гидроперекиси (25% продуктов). Однако такая зависимость специфичности действия липоксигеназы от значений рН была вскоре опровергнута при экспериментах с рекомбинантным ферментом [Coffa et al., 2005]. Тем не менее, для 9-специфичных липоксигеназ растений характерен более кислый оптимум рН, для 13-специфичных - более щелочной [Boeglin et al., 2008]. Специфичность действия клонированной недавно ЛОГ момордики горькой (Mormordica charantia) продемострировала зависимость от значений рН. [Hornung et al., 2008]. При рН 7.5 преобладающим продуктом была 9-гидроперекись, при более высоких значениях рН 13-гидроперекись.
На основе ранее предложенной модели «ориентации субстрата» возникла модель, согласно которой специфичность зависит от отдельного аминокислотного остатка активного центра (рис. 4). Аминокислотный остаток аланина в последовательности GmLOXl определял соотношение продуктов реакции [Oldham et al., 2005; Coffa et al., 2005]. Согласно предложенной модели субстрат-ферментного комплекса (135)-специфичной GmLOXl, линолевая кислота располагалась в активном центре в ориентации «метальным концом вперед». Боковая группа аланина, расположенная у С-9 субстрата, перекрывала доступ к этой позиции кислорода. В результате аналогичных Ala542Gly замен в последовательностях мышиной (85)-ЛОГ, человеческой (155)-ЛОГ-2 глицин, не имеющий боковой группы, открывал доступ к С-9 и приводил к смене региоспецифичности действия фермента [Coffa et al., 2005]. Расположение субстрата для (8Я)-ЛОГ коралла и (12/?)-ЛОГ человека соответствовало ориентации «карбоксильным концом вперед».
При этом аналогичная Ala542Gly мутация делала доступной для кислорода С-13 позицию. Окисление при участии ( -специфичной липоксигеназы проходило по 12-ой позиции скелета арахидоновой кислоты, а в случае обратной ориентации боковая группа Ala заслоняла удобное для добавления кислорода место, поэтому фермент проявлял (85)-специфичность действия [Coffa et al., 2005]. Карбонильный кислород А1а542 располагался на расстоянии водородной связи с амидным азотом Leu546 и Пе547, который находился на той же спирали. Кроме того, эффект гетерогенности последовательности Ие547, находящейся в тесном контакте с Тгр500, мог распространяться на Leu546 и Ие547, которые играли важную роль в кинетической эффективности и региоспецифичности [Gan et al., 1996; Knapp et al., 2001; Hughes et al., 2001b; Coffa et al., 2005]. При этом, ориентация субстрата в активном центре полностью соответствовала ранее приведенной в теории Гарднера [Gardner, 1989].
Дополнительное подтверждение модель получила при использовании в качестве субстратов сложных липидов. Фосфатидилхолиновые эфиры и другие липиды окислялись только теми ферментами, которые позволяли проходить субстрату в активный центр метальным хвостом вперед (8К-ЛОГ, 128-ЛОГ, 158-ЛОГ). При участии ферментов с обратной ориентацией субстрата ((5)-ЛОГ, (85)-ЛОГ и (12Д)-ЛОГ) [Brash et al., 1987; Takahashi et al., 1993; Coffa, Brash, 2004] сложные липиды не окислялись. В то же время, некоторые растительные (95)-ЛОГ были способны окислять амиды, например анандамид (часть этаноламида) и 1-глицерол-линолеат [van Zadelhoff et al., 1998; Butovich, Reddy, 2001], что явно противоречило теории «обратной ориентации».
Модель «внутреннего объема» субстрат-связывающего кармана была основана на данных по липоксигеназам млекопитающих [Gilmor et al, 1997; Sloane et al., 1995]. Субстрат проникает в активный центр липоксигеназы всегда метальным концом настолько глубоко, насколько позволял внутренний объем субстрат-связывающего кармана фермента. Позиция диоксигенирования субстрата зависела только от глубины его проникновения. Замена объемных аминокислотных остатков [Yamamoto et al., 1997; Bryant et al., 1982] (Ile418 и Met419) в 15-ЛОГ на меньшие по размеру Val и Ala, характерные для 12-ЛОГ человека привели к изменению специфичности фермента с (15S) на (12 [Sloane et al., 1991]. Как показал рентгеноструктурный анализ, ключевые аминокислотные остатки лежали на внутренней поверхности субстрат-связывающего канала и регулировали положение жирной кислоты во время катализа [Borngraber et al., 1999] (рис. 5). При замене объемных аминокислотных остатков Met418 или Phe353 в последовательности 15-ЛОГ человека или 15-ЛОГ ретикулоцитного типа кролика на меньший по объему аминокислотный остаток, субстрат глубже проникал в субстрат-связывающий карман и ближе располагался к железу [Borngraber et al., 1996; Sloane et al., 1991]. При этом изменялся номер атома углерода, от которого происходило удаление водорода на первом этапе реакции, но не тип перегруппировки радикала (в обоих случаях п+2). Кроме того, для 15-липоксигеназы кролика аминокислотный остаток Phe353, соответствующий Ser491 липоксигеназы-1 сои, составлял другую важнейшую детерминанту позиционной специфичности [Borngraber et al., 1996]. Тем не менее, выравнивание последовательностей растительных липоксигеназ не выявило различий в этих позициях между (135)- или {9S)-липоксигеназами. Хотя для растительных липоксигеназ замена Val576Phe липоксигеназы картофеля приводила к преобладанию (115)-гидроперекиси арахидоновой кислоты вместо (55)-гидроперекиси [Andreou et al., 2008]. При обратной замене в последовательности (135)-липоксигеназы огурца преобладающим продуктом становилась (95)-гидроперекись линолевой кислоты [Homung et al., 1999].
Липоксигеназная сигнальная система растений
Для быстрой адаптации к изменяющимся условиям окружающей среды растения используют множество сложных сигнальных путей, использующих в качестве сигнальных молекул салициловую кислоту, ауксин, этилен, абсцизовую кислоту и другие соединения. Сложные взаимодействия между этими путями обеспечивают контроль процессов роста растения и ответов на стрессоры [Lorenzo, Solano 2005; Fujita et al., 2006]. Воспринимая отдельные сигналы, растение активирует и интенсивно перепрограммирует транскрипцию генов, что приводит к усилению устойчивости к атакам насекомых и патогенов. В клетках растений благодаря ряду последовательных реакций из гидроперекисей жирных кислот образуются травматин, жасмоновая и абсцизовая кислоты [Siedow, 1991;], дивиниловые эфиры, играющие немаловажную роль в патогенезе, ответе растения при ранении, а также в регуляции роста и развития растений. Таким образом, благодаря действию липоксигеназы - первого фермента липоксигеназного пути, живой организм получает возможность синтезировать и использовать по назначению большое количество разнообразных оксилипинов (рис. 8).
В сигнальной липоксигеназной системе первым звеном является трансмембранный рецепторный белок [Scheer, Ryan, 1999], который изменяет свою конформацию при взаимодействии с лигандом, например, элиситором [Gundlach et al., 1992; Muller et al., 1993]. Далее сигнал передается на ассоциированный с рецептором гетеротримерный комплекс G-белков [Тарчевский, 2002; Okamoto et al, 2009]. В качестве элиситора могут выступать фрагменты клеточной стенки бактерий (фрагменты глюкана, олигомеры хитина), липохитоолигосахариды и гликопротеины [Mueller, 2002], а также секретируемые белки (элиситин, ксиланаза, целлюлаза, гарпины и другие) [Cardinale et al., 1995] и липиды микроорганизмов, например, арахидоновая кислота Phytophtora infestans, сиринголид Pseudomonas syringae и эргостерины [Cardinale et al., 1995].
Изменение конформации G-белков приводит к активации а-субъединицы [Aharon et al., 1998]. Освободившиеся из комплекса а-субъединицы взаимодействуют с фосфолипазой А2, катализирующей освобождение жирных кислот из состава мембранных липидов, в том числе и фосфолипидов. Образовавшиеся мембранные лизофосфолипиды служат фактором, определяющим изменение экспрессии генов [Kudo, Murakami, 2002].
В липоксигеназной сигнальной системе происходит усиление сигнала за счет повышения концентрации свободного Са в цитозоле клетки [Mueller, 2002], приводящее к активации фосфолипаз А и повышению скорости освобождения жирных кислот [Тарчевский, 2002]. При повышении уровня Са"+ в цитозоле наблюдается потеря К+ и СГ и приток Н+ [Jabs et al., 1997]. Вслед за активацией кальциевых каналов идет фосфорилирование белков, при этом киназы митоген-активирующих белков способствуют активации транскрипции генов защитного ответа [Mueller, 2002]. Снижение уровня Са в среде приводит к блокированию активации этих генов [Aharon et al., 1998]. Вторым усилителем сигнала выступают жасмонаты и метилжасмонаты, которые приводят к увеличению экспрессии генов липоксигеназ [Тарчевский, 2002]. Дополнительными усилителями являются активация метилжасмонатами генов десатуразы жирных кислот (приводит к превращению линолевой кислоты в линоленовую) и метилтрансферазы (приводит к образованию из жасмоновой кислоты метилжасмоната).
Освободившаяся жирная кислота (линолевая или линоленовая) выступает в качестве субстрата для липоксигеназной реакции с образованием гидроперекисей жирных кислот. Далее молекула гидроперекиси преобразуется цитохромами Р450 семейства CYP74 до соответствующих соединений, несущих сигнальную функцию. Растения мха Physcomitrella patens используют в сигнальном липоксигеназном пути как октадеканоиды, так и эйкозаноиды [Anterola et al., 2009]. Липоксигеназа-10 листьев кукурузы, обладающая (13)-специфичностью, экспрессируется в ответ на абиотический стресс (холод) и при поражении насекомыми и патогенами (экзогенные жасмоновая кислота, салициловая кислота, абсцизовая кислота и инокуляция непатогенным штаммом Cochliobolus carbomim) [Nemchenko et al., 2006]. Липоксигеназа-11 кукурузы повышает уровень экспрессии исключительно при действии абсцизовой кислоты. В ходе пероксигеназной реакции ненасыщенные жирные кислоты превращаются в эпокси-производные и гидроперекиси [Blee, Joyard, 1996], которые являются источником синтеза кутикулярного покрова растения. Выделенная из хлоропластов кукурузы липоксигеназа-6 не имеет классической липоксигеназной активности, но может разрезать 13-гидроперекиси жирных кислот на со-оксокислоты и другие соединения [Gan et al., 2008], роль которых в липоксигеназном каскаде еще не показана. Индукция экспрессии этого фермента достигается за счет жасмоновой кислоты, а также специфическим патогеном Cochliobolus carbomim, но ингибируется абсцизиновой, салициловой кислотой и этиленом.
Растительные цитохромы Р450 участвуют в синтезе фенилпропаноидов, алкалоидов, терпеноидов, липидов, а также гиббереллинов, жасмоновой кислоты, брассиностероидов и других биологически активных веществ [Chappie, 1998]. В состав подсемейства CYP74 входят такие ферменты, как алленоксидсинтаза, гидропероксидлиаза и дивинилэфирсинтаза. Однако ферменты семейства CYP74 имеют несколько отличий от типичных цитохромов Р450. Ферменты семейства CYP74 используют кислород из субстрата - гидроперекиси жирной кислоты, образованной ЛОГ [Song, et al., 1993; Feussner et al., 2001], а не молекулярный кислород. Также в отличие от цитохромов Р450 при химических реакциях ферменты семейства CYP74 не используют NADPH или NADPH-зависимую цитохромредуктазу и не обладают повышенным сродством к СО [Chappie, 1998]. Ферменты семейства CYP74, а также пероксигеназы и эпоксиалкогольсинтазы преобразуют гидроперекиси жирных кислот в разные оксилипины, такие как жасмонаты, альдегиды, кетолы, эпоксиды, дивиниловые эфиры. Количество отдельных оксилипинов незначительно для растения, находящегося в нормальных условиях, но многократно возрастает в ответ на механические повреждения, атаку насекомых и патогенов и другие события, обусловленные развитием и окружающей средой.
Получение продуцентов рекомбинантных ферментов
Особенности специфичности действия ZmLOX3 исследовали в присутствии жирных кислот, содержащих 16 атомов углерода: (9Z,12Z)-гексадекадиеновой кислоты (16:2) и (7Z,10Z,13Z)-гeкcaдeкaтpиeнoвoй кислоты (16:3), структурные формулы которых представлены на рис. 16.
Скорость окисления гексадекадиеновой кислоты (2,02 ± 0,15 мкмоль/мин) при участии ZmLOX3 соответствовала скорости окисления линолевой кислоты. Согласно анализу с помощью ГХ/МС продуктами реакции являлись 9-гидроперекись (97%) и 13-гидроперекись (3%) 16:2 (рис. 19). Преобладающим продуктом окисления 16:2 при участии GmLOXl являлась 13-гидроперекись (95%), а минорным - 9-гидроперекись (5%). Основные продукты реакции: 13-гидроперекись, образуемая при участии GmLOXl, и 9-гидроперекись, образованная при участии ZmLOX3, являются (6)-энантиомерами. i
Скорость окисления гексадекатриеновой кислоты (177,1 ± 7 нМ/мин) при участии ZmLOX3 соответствует 8,8% скорости окисления линолевой кислоты. Мажорным продуктом реакции является 7-гидроперекись 16:3 (93,3%) (рис. 20). Преобладающим продуктом реакции GmLOXl с 16:3 являлась 11-гидроперекись.
Согласно хирально-фазовой ВЭЖХ, основные продукты реакций при участии ZmLOX3 и GmLOXl были представлены (5)-энантиомером.
Окисление гексадекадиеновой и гексадекатриеновой кислот при участии ZmLOX3 и GmLOXl происходило с высокой стерео- и региоспецифичностью действия липоксигеназ, несмотря на укороченную по сравнению с линолевой кислотой, углеродную цепь. Скорость реакции, катализируемой ZmLOX3, зависела от расстояния между карбоксильной группой до прохирального центра пентадиенильного фрагмента субстрата. В случае гексадекадиеновой и линолевой кислоты эти расстояния совпадали, как и скорости окисления этих субстратов.
Окисление свободных жирных кислот, представленных в работе, можно рассматривать с учетом нескольких параметров: 1) длины углеродной цепи, 2) расстояния от карбоксильной группы до центра вступающего в реакцию пентадиенильного фрагмента субстрата, 3) расстояния от метильного конца субстрата до центра вступающего в реакцию пентадиенильного фрагмента субстрата, 4) количества двойных связей, 5) присутствия в высших растениях. Наибольшая длина углеродной цепочки была у докозадиеновой кислоты (22 атома), далее следует эйкозадиеновая (20 атомов), линолевая и линоленовая (18 атомов), гексадекадиеновая и гексадекатриеновая кислоты (16 атомов). Расстояние от карбоксильной группы до центра вступающего в реакцию пентадиенильного фрагмента было максимально для докозадиеновой кислоты (15 атомов), меньше для эйкозадиеновой (13 атомов) и еще меньше для всех остальных жирных кислот (11 атомов). Расстояния от метильного конца субстрата до вступающего в реакцию пентадиенильного фрагмента было примерно равно 8 атомам для всех жирных кислот, кроме гексадекадиеновой кислоты, у которой это расстояние соответствовало 6 атомам. Гомологи линолевой кислоты (докозадиеновая, эйкозадиеновая и гексадекадиеновая кислоты) содержали одно пентадиеновое основание, гексадекатриеновая кислота (как и линоленовая кислота) содержала три сопряженных двойных связи, образующих два смежных пентадиеновых основания. Растения, в липидоме которых преобладали линолевая и а-линоленовая кислоты, называют 18:3 растениями. Растения, в липидоме которых преобладала (до 20%) гексадекатриеновая кислота, называют 16:3 растениями. [Jamieson, Reid 1971; Mongrand et al., 2005]. Остальные жирные кислоты в высших растениях не встречались вообще, или встречались в незначительных количествах. Окисление докозадиеновой и эйкозадиеновой кислот при участии ZmLOX3 происходило неспецифически и с низкой скоростью реакции. Согласно полученным в нашей лаборатории неопубликованным данным, ZmLOX3 была неспособна окислять арахидоновую кислоту (20 атомов углеродной цепи и 4 сопряженные двойные связи), которая является классическим субстратом для липоксигеназ млекопитающих. (135)-Специфичная липоксигеназа GmLOXl окисляла арахидоновую кислоту [Brash, 1999], а также эйкозадиеновую и докозадиеновую кислоты высоко специфически. Однако названные жирные кислоты не встречаются в высших растениях. Возможно, проявление (95)-специфичности ZmLOX3 было обусловлено ее специализацией к окислению жирных кислот растительного происхождения.
Гексадекадиеновая кислота окислялась при участии ZmLOX3 специфически, хотя имела укороченную с метильного конца углеродную цепь. Скорость окисления гексадекадиеновой кислоты соответствовала скорости окисления линолевой кислоты. Полученные данные свидетельствуют о том, что укорочение углеродной цепи с метильного конца существенно не влияло на позиционирование субстрата в активном центре липоксигеназы.
Особенности окисления свободных жирных кислот при участии ZmLOX3 и GmLOX
Для введения замен в ходе полимеразной цепной реакции нами были сконструированы попарно комплементарные друг другу олигонуклеотидные последовательности ZmlF и ZmlR, Zm2F и Zm2R, содержащие кодоны для замены Ala560Gly и Ala562Gly, соответственно (табл. 1). Праймеры для сайт-направленного мутагенеза попарно комплементарны противоположно направленным нитям плазмиды за исключением отдельного сайта мутации, расположенного в середине праймера. Длина праймера составляет от 25 до 45 нуклеотидных основания, что гарантирует минимальное количество вторичных структур и максимальную эффективность реакции. Данные олигонуклеотидные праймеры использовались в полимеразной цепной реакции для сайт-направленного мутагенеза (рис. 25). В дальнейшем экспрессия и очистка ферментов мутантного типа была проведена по схеме, аналогичной для получения фермента дикого типа.
Анализ продуктов, полученных при окислении линолевой кислоты при участии мутантных форм ZmLOX3, позволил определить специфичность действия этих ферментов. Преобладающим продуктом окисления линолевой кислоты при участии мутатной формы Ala560Gly ZmLOX3 была (9S)-гидроперекись, количество минорных продуктов: ((9І?)-, (135)-, (13І?)-гидроперекисей 18:2) составляло не более 3%, что соответствовало картине окисления при участии ZmLOX3 дикого типа (рис. 26). Скорости реакции при участии ZmLOX3 дикого типа и Ala560Gly с 18:2 были примерно одинаковыми. Согласно компьютерной модели (стр.98), боковая группировка А1а560, входящего в состав той же а-спирали, что и А1а562, не образует внутренней поверхности субстрат-связывающего кармана. По-видимому, субстрат, находясь в активном центре, не взаимодействует с данным аминокислотным остатком.
Данные, представленные для (9і?)-специфичной ЛОГ Nostoc и ее мутантных форм по сайту Коффа Alal62Gly, А1а16211е и Alal62Val, позволяют предположить, что лишь более объемные боковые группы аминокислотных остатков играют роль в определении специфичности ЛОГ [Andreou et al, 2008].
Продуктами окисления линолевой кислоты при участии мутантной формы ZmLOX3 Ala562Gly являлись 9-гидроперекись (68,5%) и 13-гидроперекись (31,5%) (рис. 26). С помощью хирально-фазовой ВЭЖХ показано, что среди 9-гидроперекисей линолевой кислоты преобладали ()-энантиомеры (97%), тогда как среди 13-гидроперекисей преобладали (R)-энантиомеры (96%) (рис. 26). Для ZmLOX3 дикого типа константа Михаэлиса составила 20,2 мкМ, для мутантной формы Ala562Gly ZmLOX3 -3,2 мкМ. Согласно картине кинетики окисления при участии ZmLOX3 Ala562Gly (данные не приведены), наблюдалось удлинение лаг-фазы реакции. Понижение значения константы Михаэлиса и удлинение лаг-фазы реакции наблюдались для Ala542Gly GmLOXl и мутантных форм других ферментов [Coffa, Brash, 2004; Coffa et al., 2005], что объяснялось эффектом ингибирования реакции при высоких концентрациях субстрата. Таким образом, мутация Ala562Gly привела к изменению региоспецифичности по сравнению с диким типом ZmLOX3, так как (13і?)-гидроперекись (30,2%) является дополнительным продуктом окисления линолевой кислоты (табл. 5).
GmLOXl, обладающая (ІЗ -специфичностью, имела оптимум активности при щелочных значениях рН, когда карбоксильная группа жирной кислоты была сильно ионизированна. Согласно теории Коффа [Coffa, Brash, 2004], при щелочных значениях рН субстрат входит в активный центр фермента своим метальным концом. (9)-специфичные липоксигеназы имеют оптимум при кислых значениях рН, когда ионизации карбоксильной группы не происходит. При этом для образования (9)-гидроперекиси субстрат должен проникнуть в активный центр карбоксильной группой вперед. Боковая группа аминокислотного остатка А1а542 GmLOXl (соответствовала А1а562 ZmLOX3), расположенного у входа в субстрат-связывающий карман, используется для правильного позиционирования субстрата в активном центре. Предполагается, что для (135)-специфичных липоксигеназ боковая группа Ala «загораживает» от молекулы кислорода 9-ый атом углеродной цепи субстрата (рис. 4, стр. 24). Для (9і )-специфичньіх липоксигеназ боковая группа Ala «загораживает» 13-ый атом углеродной цепи субстрата. Если произведена замена аминокислотного остатка Ala на Gly, боковая группировка которого состоит из атома водорода, то «загораживание» места присоединения кислорода не происходит и фермент способен катализировать реакцию с образованием и 9- и 13-гидроперекисей. В случае замены Ala на Gly в последовательности ZmLOX3, по-видимому, во-первых, нарушилась фиксация углеродного скелета в активном центре; во вторых, не происходило «загораживания» 13-го атома углеродной цепи, что открыло доступ кислороду у этому атому углеродной цепи. Поэтому мутантная форма Ala562Gly производила не только (9S)-, но и (13І?)-гидроперекиси линолевой кислоты. Полученные данные свидетельствуют об изменении региоспецифичности действия Ala562Gly ZmLOX3 по сравнению с ZmLOX3 дикого типа.
Доказательством обратных ориентации субстратов для (9S)- и (13.S)-специфичных липоксигеназ, послужили данные по окислению сложных липидов in vitro. Было показано, что (135)-липоксигеназы способны окислять сложные липиды: GmLOXl окисляла остатки арахидоновой и линолевой кислоты в составе фосфатидилхолина [Brash et al., 1987, Perez-Gilabert et al., 1998], ЛОГ огурца окисляла трилиноленин сразу по трем остаткам жирных кислот [Hornung et al., 1999]. (9)-Специфичные липоксигеназы (томата [Regdel et al., 1994], картофеля [Huang et al., 2008] и ячменя [Holtman et al., 1997]) не были способны окислять сложные липиды. Эти данные объяснялись тем, что массивная группировка на карбоксильном конце субстрата являлась стерическим препятствием, не позволяющим субстрату проникнуть в активный центр (9)-липоксигеназ карбоксильной группой.
