Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 8
1.1. Роль щавелевой кислоты и ее солей в ионном балансе растений 8
1.2. Организация транспорта и обмена нитратного и аммонийного азота в растениях 15
1.3. Участие минеральных катионов в процессах ионного гомеостатирования у растений 23
1.4. Функциональная роль хлорида в процессах ионного гомеостатирования у растений 30
Глава 2. Материалы и методы 35
2.1. Объект исследования 35
2.2. Методика постановки вегетационного опыта 35
2.3. Методы анализа ионного состава растений 40
2.4. Статистическая обработка результатов 42
Глава 3. Результаты и обсуждения 42
3.1. Особенности формирования ионного состава листьев амаранта метельчатого Amaranthus cruentus L. на разных этапах онтогенеза 42
3.2. Исследование характера обмена оксалата и минеральных катионов в листовых пластинках Amaranthus cruentus L. в зависимости от типа источника азота 48
3.3. Формирование пулов оксалата и катион-анионного баланса в условиях разной обеспеченности растений амаранта минеральными катионами 60
3.4. Формирование пулов оксалата и минеральных ионов в листовых пластинках амаранта в условиях разной обеспеченности хлоридом 77
Заключение 91
Выводы 919
Список использованной литературы 101
- Организация транспорта и обмена нитратного и аммонийного азота в растениях
- Функциональная роль хлорида в процессах ионного гомеостатирования у растений
- Методы анализа ионного состава растений
- Исследование характера обмена оксалата и минеральных катионов в листовых пластинках Amaranthus cruentus L. в зависимости от типа источника азота
Введение к работе
Поддержание основных параматеров внутренней среды растительного организма, в том числе и его ионного состава, на генетически заданном уровне является одним из необходимых условий для функционирования растения как целостного организма, адекватного реагирующего на изменения во внешней среде. Исследования последних лет позволили в достаточной степени охарактеризовать работу транспортных систем плазмалеммы и тонопласта, участвующих в обеспечении гомеостаза таких минеральных ионов, как калий [Walker et al., 1996; Leigh, 2001; Shabala, 2003], натрий [Horie, Schroeder, 2004; Chinnusamy et al., 2006], кальций [Williams, 1998] и нитрат [Miller, Smith, 1996; van der Leij et al., 1998] в цитозоле, в том числе, при засолении [Munns, 2005] или дефиците ионов в среде [Maathuis et al., 2003]. В то же время, не менее важным в поддержании ионного состава растений представляется вовлечение в этот процесс продуктов углеродного метаболизма. Так, еще Cram [1980] была высказано предположение о том, что основой поддержания тургора в клетках гликофитных растений, в отличие от галофитов, может быть контролируемая аккумуляция калиевых солей органических кислот. В дальнейшем [Осмоловская, 1998] было высказано предположение о важной роли обмена органических кислот при формировании калиевого гомеостаза в цитозоле клеток листа гликофитов. На функциональную значимость этих метаболитов неоднократно указывалось также при анализе роли вакуоли в гомеостатической регуляции ионного состава цитозоля растительных клеток [Андреев, 2001; Leigh et al., 1994; Martinoia et al., 2000] и в компартментации ассимилятов [Дубинина и др., 2001; Smith, Raven, 1979; Ryan et al., 2001], а также при оценке влияния формы источника азота на состояние ионного баланса в листьях растений [Осмоловская, Иванова, 1989; Kirkby, Mengel, 1967; Curtin, Wen, 2004]. Вместе с тем, специальные исследования, направленные на анализ роли
органических кислот при формировании ионного состава и ионного гомеостаза в клетках гликофитов, в литературе отсутствуют.
Для представителей ряда семейств характерным является накопление ими значительных количеств щавелевой кислоты [Francheshi, Horner, 1980; Магомедов, 1988; Землянухин, 1995]. У некоторых видов растений (Rumex sp., Begonia, Oxalis) она присутствует в основном в свободной форме, тогда как в других растениях щавелевая кислота может находиться как преимущественно в форме растворимых солей, как правило, калия или натрия (Spinacia, Portulaca) [Brogren, Savage, 2003; Palaniswamya et al., 2004], либо в основном быть представлена пулом нерастворимых оксалатов, как правило, кальция и магния (Amaranthus, Cammelia) [Осмоловская и др., 2002; Morita et al., 2004]. Основное внимание при анализе механизмов аккумуляции оксалата в клетках растений приковано к вопросам формирования и роли кристаллов оксалатов кальция, которые, как полагают, у оксалат-аккумулирующих растений активно вовлекаются в процессы детоксикации избытка поступившего в растения кальция [Zindler-Frank et al., 2001; Francheshi, 2001]. Помимо этого, предполагается их участие в осморегуляции [Ruiz, Mansfield, 1994], обеспечении жесткости тканей [Hudgins et al., 2003; Nakata, 2003], защите растений от патогенов и травоядных [Ruiz et al., 2002; Dias et al., 2006], детоксикации ионов тяжелых металлов [Seuntjens et al., 2004; Jauregui-Zuniga et al., 2005].
Однако, несмотря на очевидную способность многих растений накапливать значительные количества оксалата, исследования, направленные на оценку степени его вовлечения в формирование ионного гомеостаза растений, крайне малочисленны [Осмоловская и др., 2002; Singh, 1974; Curtin, Wen, 2004], и процессы синтеза щавелевой кислоты в них, как правило, трактуются как вторичные по отношению к минеральному обмену растительного организма.
К числу растений, для которых характерно накопление значительных количеств щавелевой кислоты, относится Amaranthus sp. [Noonan, Savage, 1999]. Растения этого рода характеризуются как представители С4-пути фотосинтеза аспартатного типа [Магомедов, 2008]. Присутствие в них высокого содержания лизина, сквалена, ненасыщенных жирных кислот, витаминов Е и С определяет высокую пищевую и кормовую ценность амаранта [Чиркова, 1999]. Также не менее важной особенностью амаранта является его устойчивость к стрессовым условиям окружающей среды, таким как засуха, повышенная температура [Чиркова, 1999], засоление [Архипова и др., 1993] и затопление корневой системы [Белоногова и др., 1995]. При этом большинство исследований, выполненных на амаранте, ориентированы, прежде всего, на изучение его углеродного обмена [Teli et al., 2007; Kong et al., 2008; de la Rosa et al., 2008] и практически не затрагивают вопросы становления ионного гомеостаза в надземных органах и степень вовлечения в механизмы его формирования анионов щавелевой кислоты.
В связи с этим целью настоящего исследования явилось изучение функциональной роли щавелевой кислоты в организации ионного гомеостаза в надземных органах амаранта метельчатого Amranthus cruentus L.
В задачи исследования входило:
1) выяснение особенностей формирования пулов щавелевой кислоты в
листовых пластинках амаранта метельчатого в ходе онтогенеза;
2) изучение влияния экзогенных источников азота на обмен
минеральных ионов и оксалата в листьях растений амаранта;
3) анализ функциональной взаимосвязанности процессов
формирования пулов оксалата и обмена минеральных катионов (калия,
кальция, магния) в листьях амаранта метельчатого;
4) оценка зависимости формирования пулов оксалата и минеральных
катионов в листьях амаранта от анионного состава среды;
5) анализ основных принципов становления ионного гомеостаза в
листьях амаранта метельчатого в зависимости от параметров среды.
Организация транспорта и обмена нитратного и аммонийного азота в растениях
Нитрат является основным источником азота в почве для растительного организма. Исследования, проведенные в широком диапазоне концентраций экзогенного нитрата, показали, что процесс его поглощения обеспечивается двумя транспортными системами [King et al., 1992]. При высоких концентрациях нитрата в среде (1-50 мМ) функционирует конститутивная транспортная система с низким сродством к нитрату, а при низких (до 1 мМ) транспорт нитрата обеспечивается высокоаффиной системой переносчиков с высоким сродством к нитрату. В последнем случае его поглощение тесно связано с функционированием нитратредуктазы, катализирующей восстановление нитрата до нитрита [Glass et al., 2001].
Предполагается, что высокоафинный транспорт опосредуется 2-мя системами: CHATS и IHATS [King et al., 1992]. Конститутивная высокоаффинная транспортная система (CHATS) работает при концентрации экзогенного нитрата от 2,5 до 500 мкМ. Vmax для этой системы составляет 0.3-0.82 мкМ (г час)"1, a Km 6-20 мкМ. Индуцибельная высокоаффинная транспортная система (IHATS) имеет более высокие Km и Vmax (обычно 20-100 мкМ и 3-8 мкМ (г час)"1 соответственно) и активируется экзогенным нитратом. При концентрации нитрата во внешней среде больше 1 мМ индуцируется работа низкоаффинной (LATS) системы [Kronzucker et al., 1995; Crawford, Glass, 1998; Glass et al., 2001].
В настоящее время выделены 2 семейства транспортеров нитрата: NRT1 и NRT2 [Crawford, Glass, 1998]. Гены, кодирующие белки семейства NRT2, найдены в растениях арабидопсиса, томата и табака. Было показано, что они входят в семейство MFS и имеют 12 трансмембранных доменов. В частности, в арабидопсисе идентифицированы 7 генов семейства NRT2. Все эти белки работают как высокоаффинные транспортеры (как индуцируемые, так и конститутивные). Большинство гомологов NRT2.1 из различных растительных видов быстро индуцируются нитратом, а ингибируются восстановленными формами азота, такими как аммоний или глутамин [Crawford, Glass, 1998].
NRTl-семейство, которое входит в надсемейство белковых транспортеров PTR, включает гены, кодирующие транспортеры нитрата, и, как предполагается, опосредующие поглощение нитрата в области его высоких экзогенных концентраций. Экспрессия некоторых из этих генов индуцируется нитратом, тогда как на большую часть генов этого семейства нитрат такого действия не оказывает [Crawford, Glass, 1998; Glass et al., 2000; Williams, Miller, 2001].
Процессы поглощения и усвоения нитрата зависят от внешних факторов среды, таких как концентрация экзогенного нитрата, рН, ионный состав питательного раствора, температура, свет [Осмоловская, Иванова, 1989; Blom-Zandstra et al., 1988; Lillo, Appenroth, 2001] и находятся под метаболическим и генным контролем [Crawford, Glass, 1998; Touraine et al., 1994]. В большинстве случаев, скорость поглощения NO3" намного ниже, чем поглотительная способность корней, и определяется скоростью роста растения. Исследования показали, что существуют внутренние механизмы регуляции, направленные на поддержание нитратного гомеостаза в растении. Эти механизмы включают сигналы, которые являются специфичными для контроля поглощения нитрата, продуцируются побегом и транспортируются в корни. Дискуссии об их природе привели к созданию гипотезы, согласно которой эти сигналы являются продуктами ассимиляции нитрата в побеге [Touraine et al., 1994]. На роль внутренних контролирующих сигналов претендуют органические кислоты и аминокислоты. Было показано, что органические кислоты оказывают положительный эффект на скорость поглощения нитрата, тогда как аминокислоты, напротив, угнетают ее [Touraine et al., 1994; Forde, 2002]. Однако, не стоит исключать и возможность регулирования ферментов азотного метаболизма непосредственно анионом нитрата, а не производными его ассимиляции. В частности, в опытах с нуль-мутантами арабидопсиса по нитратредуктазе [Wang et al., 2004] было показано, что при добавлении в среду нитрата происходила активация целого ряда генов, прямо или косвенно вовлеченных в процессы поступления и ассимиляции нитрата в растении (NRT1.1, NRT2.1, NiR, Fd NADP редуктазы и т.д.), как в растениях дикого типа, так и у мутантов. Исходя из этих данных, авторами делается вывод о том, что нитрат сам по себе может служить сигналом как для активации генов, ответственных непосредственно за ассимиляцию нитрата, так и «сопутствующих» генов.
Активность нитратредуктазы, основного фермента, участвующего в утилизации нитрата в растении и в значительной степени определяющего его накопление и распределение в клетке, может определяться а) доступностью субстратов в цитоплазме и б) уровнем функционально активного фермента [Campbell, 1999]. Ингибирование ее активности происходит в присутствии двухвалентных катионов, таких как Са2+ и Mg2+, вероятно, за счет связывания их с 14-3-3-белками, которые, связываясь с нитратредуктезой, вызывают переход последней в функционально-неактивное состояние [Campbell, 1999; Atliwal et al., 1998]. Также ингибирование активности нитратредуктазы возможно в результате действия избыточного содержания NaCl в питательном растворе [Deboubaa et al., 2006].
В цитоплазме растительной клетки нитрат может быть: редукцирован до нитрита ферментом нитратредуктазой; выведен обратно в апопласт; переведен в запасной вакуолярный пул [Crawford, Glass, 1998]. В зависимости от генотипа в растении восстанавливается 60-90% поглощенного им нитрата [Allen et al., 1985; 1988]. Нередуцированный нитрат распределяется по пространственно разделенным (цитозольный, вакуолярный, свободного пространства) и функционально различным (метаболический, запасной, транслокационный, индукционный) фондам [Булгакова, 1999; Алехина и др., 2000; Miller, Smith, 1996]. Локализованный в разных фондах нитрат не только является субстратом для последующего белкового синтеза, но и играет роль осмотика (в основном в вакуоли) [Leigh etal., 1994].
Функциональная роль хлорида в процессах ионного гомеостатирования у растений
Как известно, формирование ионного статуса происходит не только за счет минеральных катионов и анионов органических кислот, но в этот процесс могут также активно вовлекаться минеральные анионы, такие как сульфат, фосфат, хлорид. Наибольшее внимание исследователей привлекает хлорид, как правило, рассматриваемый в связи с засолением почвы солями NaCl.
Хлорид является необходимым микроэлементом в питании растений [Marschner, 1995]. В вакуоли растительной клетки хлорид вовлекается в процессы осморегуляции и участвует в поддержании тургора, тогда как в цитоплазме он регулирует активности энзимов.
В почве содержание хлорида составляет 1-1000 кг га"1 в зависимости от типа почвы. Поступление хлорида в растения в условиях низкого содержания иона СГ в среде на уровне плазматической мембраны корней является энергозависимым процессом, тогда как в условиях засоления это пассивный процесс. Транспорт хлорида через плазматическую мембрану может происходить как через С17 БҐ" - симпортер, так и через анионные каналы. К настоящему времени показано, что кроме СГ, эти каналы могут пропускать также нитрат, сульфат, малат и некоторые другие анионы [White, Broadley, 2001]. Все эти каналы являются потенциал-зависимыми и классифицируются в зависимости от их кинетики и фармакологии [Barbier-Brygoo et al., 1999]. Помимо этого, у растений арабидопсиса были выявлены катион-хлоридные котранспортеры (ССС). Функциональная характеристика генов At ССС указывает на то, что белок работает как Na+:K+:C1" котранспортер [Colmenero-Flores et al., 2007].
Согласно классификации, предложенной White и Broadley [2001], по устойчивости растений к высоким концентрациям хлорида в среде их можно подразделить на четыре группы: 1) галофиты, которые, в свою очередь, включают а) виды растений, рост которых стимулируется в условиях засоления (Sueda maritima), и б) виды, ингибирование роста которых наблюдается лишь при концентрации хлорида во внешней среде 200 мМ (Atriplex hastata); 2) гликофиты (Festuca rubris, Hordeum vulgare, Amaranthus); 3) сверхчувствительные гликофиты (лимон, многие виды древесных растений).
Накопление хлорида в растении может широко варьировать в зависимости от рода, вида и сорта. В целом, в тканях гликофитов, выросших в естественных условиях обитания, содержание хлорида составляет 7-70 мМ, тогда как в тканях галофитов оно достигает 340-475 мМ [White, Broadley, 2001; Essa, 2002]. Различия в накоплении хлорида наблюдаются также между разными органами и тканями растения. У растений-гликофитов, выросших в условиях засоленности, содержание хлоридов увеличивается по мере старения листа, а у галофитов, напротив, во всех листьях концентрация хлоридов практически одинакова [Greenway, Munns, 1980]. В разных тканях одного и того же органа содержание хлорида также может существенно различаться [Martinoia et al., 1986]. В опытах с листьями ячменя [Leigh et al., 1994] было показано, что в условиях засоления значительные количества иона СГ обнаруживались в клетках эпидермиса, тогда как в клетках мезофилла листа его концентрация практически равнялась нулю и такая ситуация изменялась лишь при 150 мМ содержании NaCl в среде. Учитывая вышесказанное, следует отметить, что традиционное причисление хлорида к микроэлементам достаточно условно, поскольку многие растения способны накапливать значительные концентрации хлорида в тканях.
Исследования показывают, что засоление питательной среды, задаваемое хлоридом натрия, приводит к снижению скоростей фотосинтеза и транспирации, содержания хлорофилла, уменьшению листовой поверхности, увеличению содержания в растениях хлорида и натрия [Ashraf, Bashir, 2003; Као et al., 2006; Neocleous, Vasilakakis, 2007].
Одним из механизмов солеустойчивости растений предполагается способность задерживать поступление в побег Na+ на уровне корня и поддерживать высокий уровень калия в побеге [Zhu, 2003]. Действительно, как правило, у гликофитов уже незначительное повышение содержания в среде NaCl вызывает усиление поступления натрия в надземную часть, в то время как для галофитов характерным является поддержание постоянным соотношения калия к натрию в побеге при засолении [Ashraf, Bashir, 2003; Mansour, Salama, 2004; Luo et al., 2005]. Эффект засоления на накопление двухвалентных катионов, очевидно, определяется видовой принадлежностью растения. Согласно литературным данным, засоление может вызывать как снижение общего содержания кальция в надземной части у разных видов растений (Glycine tabaciana, G. tomentella, Phaseolis vulgaris, Citrus spp.), так и, напротив, оказывать стимулирующий эффект на процессы его накопления {Glycine soja, Oriza sativa) [Zekri, Parsons, 1992; Ashraf, Bashir, 2003; Kao et al., 2006; Zhao et al., 2006]. Следует отметить, что даже растения, принадлежащие к разным видам одного рода, могут по-разному, зачастую диаметрально противоположно, реагировать на засоление [Zeng, 2005].
При этом умеренное засоление, задаваемое хлоридом калия, при прочих равных условиях может быть даже более токсичным для растений, чем засоление, задаваемое хлоридом натрия, из-за возникающего переизбытка калия в надземных органах [Benlloch-Gonzalez et al., 2005].
На накопление хлорида в растении существенное влияние оказывают также условия минерального питания. Увеличение содержания в среде NCV приводит к снижению поступления хлорида в растения (также как и наличие в среде хлорида, и соответствующее этому повышение его содержания в тканях растения, оказывает ингибирующий эффект на поступление в растения анионов нитрата), тогда как присутствие аммония, напротив, может стимулировать этот процесс [Осмоловская, Иванова, 1989; Новак, Якимов, 1991; Cerezo et al., 1999; White, Broadley, 2001]. Предполагается, что такая зависимость накопления хлорида в тканях растения определяется его участием в осморегуляции и поддержании тургора и ионного баланса в клетке. В то же время, на фоне присутствия аммония в питательном растворе, можно говорить о том, что в этом случае речь идет скорее о возможности подкисления среды, способствующего симпорту Н7СГ [Clarkson, 1985].
В лабораторных условиях легко могут быть продемонстрированы симптомы хлоридного дефицита, проявляющиеся при концентрации хлорида в тканях растения, равной 0.1-5.7 мг/г сухого веса. Подобная ситуация, однако, достаточна редка в природных условиях, поскольку содержание хлорида в почвах, как правило, полностью удовлетворяет потребностям растений в этом микроэлементе [Xu et al., 2000].
В настоящее время внимание исследователей в основном сосредоточено на изучении влияния засоления на рост, развитие и функционирование растений. Критическое содержание хлорида в растительном организме, оказывающее токсическое действие, составляет 4-7 и 15-50 мг/г сухого веса для СГ-чувствительных и СГ-устойчивых растений. Предполагается, что различия растений в устойчивости к засолению определяется, главным образом, их способностью ограничивать транспорт хлорида из корня в побег [White, Broadley, 2001].
Методы анализа ионного состава растений
По окончании опытов на интактных растениях проводили съем растений, причем фиксацию растительного материала (пластинка листа и черешок с центральной жилкой соответственно нижнего, среднего и верхнего ярусов) проводили раздельно для последующего анализа их ионного состава. В опытах на высечках из листьев растений высечки промывали в дистиллированной воде, затем фильтровальной бумагой удаляли лишнюю воду. Полученный таким образом растительный материал фиксировали в термостате при 105С в течение 60 минут, затем сушили до постоянного веса при 80С в течение 24 часов. Высушенный материал измельчали на электрической мельнице до порошковидного состояния и использовали для определения содержания в нем щавелевой кислоты и основных минеральных катионов и анионов.
Содержание водо- и кислоторастворимой форм щавелевой кислоты определяли в сухом материале путем экстракции щавелевой кислоты, соответственно, водой или 1 N НС1 и титрования оксалатов в кислой среде с использованием метода перманганатометрии по Плешкову [1985] в нашей модификации, как было описано ранее [Осмоловская и др., 2000]. 0,5 г навески растительного материала заливали 15 мл (ІН2О или IN НС1 и нагревали до температуры 70-80 С. Полученный раствор титровали 0,02 N КМп04 до образования розового окрашивания, не исчезающего, по крайней мере, в течение 30 сек. Реакции, происходящие при титровании, можно записать как: СаС204 + H2S04= CaS04 + Н2С204 2KMn04 + 3H2S04 + 5Н2С204 = K2S04 + 2MnS04 + 10СО2 + 8Н20
Для определения водорастворимых форм основных минеральных катионов и анионов проводили экстракцию навески растительного материала dH20 (60 мг: 12 мл) при температуре 90С в течение 30 минут. В полученном таким образом экстракте анализировали содержание калия, магния, кальция, натрия и хлорида.
Кислоторастворимые формы кальция и магния анализировали в экстрактах из сухого материала, полученных в результате 30-минутного кипячения измельченной растительной пробы с 0.1 N НС1 (1 г: 20 мл). Содержание калия, кальция и натрия определяли на пламенном фотометре Flapho-4 ("Carl Zeiss", Германия). Измерения проводили непосредственно в полученном экстракте, предварительно разбавленном в 20 раз. Магний определяли на СФ-26 ("ЛОМО", Россия) по образованию окрашенного комплекса с титановым желтым в щелочной среде [Чесноков и др., 1960] в модификации [Медведев и др., 1996]. Хлорид определяли с использованием метода аргентометрии [Новиков и др., 1980]. Магний, фосфат и сульфат определяли на СФ-26 ("ЛОМО", Россия): магний - по образованию окрашенного комплекса с титановым желтым в щелочной среде [Чесноков и др., 1960] в модификации [Медведев и др., 1996], фосфат - по образованию молибденовой сини с амидолом в качестве восстановителя [Чесноков и др., 1960] в модификации [Медведев и др., 1996], сульфат - турбидиметрически по образованию взвеси BaS04 при использовании реактива ВаС12 (0.1 М) в СНзСООН (1 М) [Магницкий, 1972]. Нитрат определяли колориметрически с салициловой кислотой [Cataldo et al., 1975].
Сравнения выборок проводилось с помощью однофакторного дисперсионного анализа. В таблицах и на рисунках приведены средние арифметические из 3 опытов, проведенных в 5-кратной биологической повторности, и их стандартные ошибки.
Исследование характера обмена оксалата и минеральных катионов в листовых пластинках Amaranthus cruentus L. в зависимости от типа источника азота
Как известно из литературы [Тищенко, Магомедов, 1988], тип азотного питания является одним из доминирующих факторов, определяющих условия формирования и поддержания пула органических кислот в листьях растений. Это справедливо и в отношении аккумуляции щавелевой кислоты [Землянухин, 1995] в частности. Существенным в данном случае является не только уровень обеспеченности растений азотом, но и форма его присутствия в среде, то есть нитратным или аммонийным является источник азота. Согласно ряду исследований, применение аммония в качестве источника азота приводило к редукции содержания щавелевой кислоты в таких растениях, как Portulaca oleraceae L., Actinidia delisiosa, Oriza sativa [Rinallo, Modi, 2002; Palaniswamy et al., 2004; Xu et al., 2006], в то время как нитрат, напротив, стимулировал формирование органических кислот, включая оксалат [Осмоловская и др., 2000; Магомедов и др., 2003].
Основываясь на этих положениях, интересным представлялось изучить влияние форм азота на процессы формирования пулов оксалата и общий ионный состав в листовой пластинке амаранта метельчатого Amaranthus cruentus L. при выращивании растений в течение 7 суток на питательных растворах, содержащих либо нитрат (далее NO3), либо аммоний (далее NH4). В качестве контрольного в данном случае был выбран вариант 7 сут выращивания растений на питательном растворе, не содержащем азота (далее —N). Для анализа содержания водо- и кислоторастворимых форм минеральных ионов и оксалата были выбраны зрелые листья растений амаранта метельчатого. Выбор именно зрелых листьев амаранта определялся тем, что основную долю в клетках листьев этого возраста составляет вакуоль, содержание ионов в которой может служить косвенным показателем направленности процессов ионного гомеостатирования. Как известно из литературы [Leigh, 1994], в первую очередь поддержание определенного уровня ионов осуществляется в цитоплазме, где они активно участвуют в клеточном метаболизме, тогда как их содержание в вакуоли в значительной степени определяется вовлечением ионов в формирование осмотического потенциала клетки. Соответственно, и уровень их аккумуляции в вакуоли варьирует в более широких пределах [Андреев, 2001], что, в частности, связано с тем, что в этой функции возможна взаимозаменяемость ионов.
Как видно из данных, приведенных в табл. 4, при использовании нитратной формы азота содержание оксалата как в растворимой, так и в нерастворимой фракциях в зрелых листьях растений амаранта было максимальным по отношению к другим вариантам питания и составило 42 и 175 мг-экв/100 г сухой биомассы, соответственно.
Перевод растений на аммонийную форму азота приводил к значительному снижению содержания обеих форм оксалатов (на 45% для растворимой и на 48% - для нерастворимой формы по сравнению с нитратным вариантом). При этом, отношение содержания оксалатов растворимой фракции к нерастворимой оставалось стабильным во всех случаях модификации азотного питания и составляло 0,22-0,27, что позволяет говорить о том, что изменения в N-метаболизме влияют на обмен щавелевой кислоты на этапах, непосредственно предшествующих ее синтезу.
Изменение условий азотного питания отразилось также и на аккумуляции минеральных анионов в листьях амаранта. Использование в качестве источника аммонийного азота NH4C1 привело к 2-кратному повышению аккумуляции хлорида в листовой пластинке по сравнению с его содержанием в варианте без азота и 4-кратному - по сравнению с нитратным вариантом. В то же время, следует отметить, что если на нитрате аккумуляция ионов хлорида была в 1,7 раз ниже уровня растворимого оксалата, то при выращивании растений на питательном растворе, дефицитном по азоту или содержащем NH4CI, анионы хлорида в растворимой фракции анионов, напротив, преобладали над анионами оксалата, и содержание СГ было уже в 1,7 и 4 раза, соответственно, выше, чем содержание оксалата.
Формирование пула катионов в растворимой фракции, формируемого катионами калия и магния, в данном случае существенно не зависело от модификаций азотного питания. Однако, отмечалась некоторая тенденция к снижению содержания калия и магния при выращивании растений на аммонийном источнике азота, что, вероятно, может быть связано с наличием конкурентных отношений при поступлении между ионами аммония и минеральными катионами [Howitt, Udvardi, 2000].
Так же как и нерастворимый оксалат, уровень кальция в нерастворимой фракции был выше на нитратном источнике азота, составив 108 мг-экв/100 г сухой биомассы. При замене нитрата аммонием наблюдалось снижение концентрации нерастворимого кальция в листовой пластинке до уровня 84 мг-экв/100 г сухой биомассы. Следует отметить, что содержание нерастворимых форм оксалата и катионов при аммонийном питании снижалось сильнее, чем растворимых форм.
Полученные данные, в соответствии с которыми максимальный уровень оксалата в листьях амаранта достигался при выращивании на нитратном источнике азота, хорошо согласуются с известным представлением о стимуляции синтеза органических кислот в растениях как одной из реакций биохимического рН-стата - для нейтрализации избытка ОН" , образующегося в результате ассимиляции нитрата [Raven, Smith, 1976]. Кроме того, в одной из последних работ, посвященных синтезу оксалата, связанному с поступлением нитрата, на растениях риса показано, что необходимым условием формирования оксалата является именно опосредованная работой нитратредуктазы ассимиляция нитрата в растении [Tian et al., 2008].
Отмеченное нами ингибирующее действие аммония на формирование пулов оксалата в листьях амаранта может, по-видимому, объясняться как переключением углеродного метаболизма растения на преимущественный синтез аминокислот [Scheible et al., 2004], связанный с необходимостью быстрой утилизации поступающего аммония, повышенные эндогенные концентрации которого токсичны для растений [Mengel, Pilbem, 1992; Marscliner, 1995], так и стимуляцией активности оксалатоксидазы [Morita et al., 2004].
