Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы. Интродукция амаранта как источника биологически активных веществ и антиоксидантов 17
1.1. Происхождение, распространение, биологическая ценность и практическое использование 17
1.2. Характеристика растений рода Amaranthus L 20
1.2.1. Систематика семейства амарантовых или щирицевых (Amaranthaceae) 20
1.2.2. Морфо-биологические свойства 23
1.2.3. Физиолого-биохимические характеристики растений амарант 25
1.2.3.1. Особенности фотосинтеза у растений С4-типа 25
1.2.3.2.Азотный обмен амаранта 29
1.2.3.3.Водообеспечение амаранта 33
1.2.3.4.Экологическая пластичность и устойчивость амаранта 34
1.2.3.5.Продуктивность растения амарант 39
1.3. Беталаиновые пигменты растений рода Amaranthus 44
1.3.1. Структура беталаинов 46
1.3.2. Биосинтез беталаиновых пигментов 49
1.3.3. Метаболические превращения бетацианинов 52
Глава 2. Экспериментальная часть 56
2.1. Объекты и методы исследования 56
2.1.1. Материал, использовавшийся в эксперименте 56
2.1.2. Методика выращивания проростков и растений 56
2.2. Фотохимические методы исследования 58
2.2.1. Определение содержания хлорофиллов, каротиноидов и амарантина 58
2.2.2. Выделение хлоропластов 59
2.2.3. Определение фотовосстановительной активности хлоропластов 60
2.2.4. Определение интенсивности фотосинтеза 61
2.3. Регистрация спектров ЭПР 61
2.4. Биохимические методы исследования 61
2.5. Аналитические методы исследования 62
2.6. Определение антиокислительной активности (АОА) препаратов амарантина 64
2.6.1. Определение антиокислительной активности амарантина в модельной водной системе на основе гемоглобина-перекиси водорода - люминола 64
2.6.2. Определение антиоксидантных свойств амарантина в липидной гетерогенной системе 64
2.6.3. Определение антиоксидантной активности препаратов амарантина в водной модельной системе глицилтриптофан - рибофлавин 65
2.7. Методы препаративного получение бетацианинов 65
2.8. Люминесцентные исследования 67
2.9. Влияние величины рЫ и температуры на спектры поглощения амарантина при 537 нм 68
Глава 3. Физиология роста и развития различных видов амаранта в связи с биосинтезом амарантина в онтогенезе 69
3.1. Особенности ростовых процессов амаранта в онтогенезе 69
3.2. Фотосинтез и рост у зеленого и краснолистных видов амаранта на начальном этапе онтогенеза 71
3.3. Изучение транспорта электронов в хлоропластах у зелено- и краснолистных форм амаранта 81
3.4. Фотосинтетическая продуктивность и содержание амарантина в краснолистных видах амаранта 84
3.5. Закономерности накопления амарантина в листьях амаранта разного яруса 89
Глава 4. Экзогенные факторы, регулирующие биосинтез амарантина в листьях амаранта 92
4.1. Возможность резервирования азота алкалоидами амарантина 92
4.1.1. Влияние минерального питания на содержание амарантина 93
4.2. Световой контроль биосинтеза амарантина 96
4.2.1. Современные проблемны фотобиологии ультрафиолета 98
4.2.2. Роль пигментов в защитно-приспособительных реакциях растений при фотострессах 102
4.3. Влияние интенсивности освещения и УФ-А света на биосинтез амарантина 105
4.3.1. Особенности накопление амарантина в семядольных листьях этиолированных и световых проростках амаранта 105
4.3.2. Влияние УФ-А света на предпосевную обработку семян 113
4.3.3. Стимулирующее действие УФ-А света на содержание амарантина в проростках 118
4.3.4. Действие УФ-А-облучения, дополнительного к естественному свету различной интенсивности на содержание амарантина и пластидных пигментов 124
4.3.5. Действие УФ - А света, дополнительного к естественному освещению различной продолжительности на биосинтез пигментов в листьях разного возраста 128
4.3.6. Влияние УФ, белого света и цитокининовых фиторегуляторов на биосинтез амарантина и фотосинтетических пигментов 135
Глава 5. Выделение, свойства и биологическая активность амарантина 146
5.1. Выделение и идентификация амарантина 146
5.1.1. Способ получения натурального красно-фиолетового пищевого красителя 146
5.1.2. Фракционирование и очистка амарантина 146
5.1.3. Выделение форм амарантина 147
5.2. Физико-химические свойства амарантина 154
5.3. Окислительно-восстановительные свойства амарантина 160
5.3.1. Влияние амарантина на светозависимый сигнал ЭПР в суспензии хлоропластов 162
5.3.2. Влияние условий освещения хлоропластов на сигнал ЭПР амарантина 170
5.3.3. Влияние амарантина на образование трансмембранной разности рН 174
5.3.4. Взаимодействие амарантина с фотосенсибилизатором рибофлавином 176
5.3.5. Влияние амарантина на фотовосстановительную активность хлоропластов 178
5.3.6. Влияние амарантина на термолюминесценцию листьев бобов 179
5.4. Антиокислительная активность амарантина 182
5.5. Амарантин - участник системы защиты от неспецифического окислительного стресса 195
5.5.1.Влияние УФ-А света на интенсивность процессов ПОЛ и систему защиты от окислительной деструкции 195
5.5.2. Влияние пониженных температур на биосинтез амарантина 199
5.6. Биологическая активность амарантина 200
Глава 6. Селекция амаранта на повышенное содержание амарантина 224
6.1. Разработка нового направления в селекции с целью создания сортов и гибридов овощных культур с повышенным содержанием биологически активных веществ и антиоксидантов 224
6.2. Содержание амарантина в листьях различных видообразцов амаранта 229
6.3. Содержание метаболитов шикиматного пути в листьях амаранта сорта Валентина 232
6.4. Биологически активные вещества и химические элементы листьев амаранта сорта Валентина 241
6.5. Амарант сорта Валентина-источник ценного сырья для практического использования 250
6.5.1. Пищевая добавка Амвита 252
6.5.2. Пищевой краситель Амфикра 252
6.5.3. Технология получения пищевого красителя Амфикра 255
6.5.4. Технология производства новых видов чая на основе сырья амаранта сорта Валентина 256
Заключение 262
Основные выводы 265
Список литературы 268
Приложения 305
- Характеристика растений рода Amaranthus L
- Определение антиоксидантных свойств амарантина в липидной гетерогенной системе
- Изучение транспорта электронов в хлоропластах у зелено- и краснолистных форм амаранта
- Особенности накопление амарантина в семядольных листьях этиолированных и световых проростках амаранта
Введение к работе
Актуальность работы. Интродукция овощных растений с высоким содержанием белка, незаменимых аминокислот и биологически активных веществ (БАВ) актуальна во всем мире в связи с недостатком этих соединений в рационе питания населения многих стран, в том числе и в России.
Недостаток продуктов отечественного производства: пищевого белка, красителей и БАВ (пектин, соединения с Р-витаминной активностью, незаменимые аминокислоты, беталаины и др.) из растительного сырья пытаются восполнить импортом этих веществ в составе белковых концентратов, в основном из трансгенных растений сои, модифицированных продуктов, биологически активных добавок и синтетических красителей.
Особенно актуальна проблема окраски пищевых продуктов, где цвет вместе со вкусовыми свойствами, является одним из показателей качества пищевых изделий. В качестве пищевых красителей могут использоваться натуральные и синтетические красители. Основным недостатком синтетических красителей является токсичность (в большей или меньшей степени) не только самих пигментов, но и их составных компонентов -химических реагентов, присутствующих в красителе в виде примесей (Гордон, Грегори 1987г.; Смирнов, Вереснева, 1991; Aldich,1991).
Материалом для получения натуральных красителей чаще всего является растительное сырье (Бокучава и др., 1976; Луцкая, Славуцкая, 1977; Рахимханов и др., 1983; Харламова, Кавка,1979).В настоящее время Госсанэпидемнадзором России разрешены к применению натуральные красители, вырабатываемые из каротиноидсодержащего (Е160, Е161) и антоциансодержащего растительного сырья (Е163), бетацианинсодержащей столовой свеклы (Е162). Натуральные красители не только безопасны для здоровья человека (при условии экологической чистоты используемого природного сырья), но и полезны как из-за биологической активности самих
пигментов, так и за счет сопутствующих примесей: полифенолы, органические кислоты, витамины и др. биологически активные соединения.
Во всем мире современной тенденцией производства полноценных пищевых продуктов наибольшее значение отводится натуральным пищевым красителям, в связи, с чем необходим поиск новых источников воспроизводимого растительного сырья, обогащенного пигментами. Именно поэтому интродуцируемое растение амарант с высоким содержанием белка и природных красящих пигментов (бетацианинов, каротиноидов, флавоноидов, хлорофиллов и др.) все больше привлекает внимание ученых и промышленников.
Растение амарант относится к числу культур, которые отличаются высоким содержанием белка, большой продуктивностью биомассы, а также высокими адаптационными свойствами, приспособленные к произрастанию практически на всей территории России и которые характеризуются высокой эффективностью фотосинтетических процессов (Магомедов, 1995, 1997, 1999; Чиркова, 1995, 1997).
Пищевая ценность белка амаранта в сравнении с «идеальным» белком ФАО достаточно высока и составляет 75%. Повышенное содержание в листьях белка (до 20%) и веществ, обладающих биологической и антиокислительной активностью, а также микро-и макроэлементов, делают культуру амарант перспективным возобновляемым сырьем для использования в пищевой промышленности.
Острой проблемой современного общества является экологическая. Амарант служит эффективным фитомелиоратором, а экстракты из листьев и соцветий обладают антибактериальными, фунгицидными и нематицидными свойствами, что позволяет при использовании амаранта в земледелии сократить использование химических удобрений и пестицидов (Кононков и др. 1997; Войно, Гине М., 2001; Удалова и др., 2003). В листьях амаранта содержится пектин и пищевые волокна, которые способны снижать
8 накопление радионуклидов в организме и связывать тяжелые металлы. В условиях постоянного возрастания ухудшения экологической обстановки использование амаранта для получения веществ, обладающих защитным и иммунностимулирующим действием,обосновано. Выделение антиоксидантов из листьев амаранта, изучение их свойств и механизмов действия необходимо для понимания поиска закономерностей защиты растений от неспецифического окислительного стресса и приспособления их к новым условиям вегетации.
Следует отметить, что природные пигменты широко распространены в растительном мире. Большинство из них обладает биологической и витаминной активностью и являются необходимыми компонентами, как для растения, так и для человека. Предполагается, что одной из основных функций растительных пигментов является защита компонентов клетки от избытка световой энергии, УФ-радиации и других фотострессоров (Бриттон, 1986; Delgardo-Vargas at all.,2000). К настоящему времени подробно изучены функции и участие фотосинтетических пигментов, каротиноидов и антоцианов в защитно-приспособительных реакциях при стрессовых воздействиях (Запрометов, 1974, 1993; Удовенко, 1979, 1981, 1995; Удовенко, Гончарова, 1982,1989; Гудвин, Мерсер, 1986).
В растениях порядка Centrospermae распространены окрашенные алкалоиды - беталаины, которые разделяются на красно-фиолетовые пигменты - бетацианины и желтого цвета - бетаксантины (Piatelli, 1975, Mabry,1980, Гине М.,2001, 2002).
Бетацианиновые пигменты обнаружены в красноокрашенных овощных растениях амаранта (Amaranthus), квиноа (Chenopodium quinoa), а также столовой свеклы (Beta vulgaris) и мангольда, которые способны накапливаться в различных органах растений. Красно-фиолетовый алкалоид бетацианин, выделенный из краснолистных видов амаранта, получил название амарантин, который является азотсодержащим гетероциклическим
9 соединением. Его эмпирическая формула имеет вид C29H31N2O19, а молекулярная масса равна 711 Да. По своей природе бетацианиновые пигменты относятся к алкалоидам. Известно, что многие алкалоиды представляют собой физиологически активные соединения. Следует отметить, что, свойства и биологическая активность бетацианинов слабо изучены, в том числе и бетацианинового пигмента - амарантина из растений рода Amaranthus. Изучение физико-химических свойств и биологической активности амарантина в различных модельных системах необходимо для выяснения физиологических функций амарантина, которые он выполняет в растительной клетке.
Последовательность реакций синтеза молекулы амарантина из его предшественников - тирозина и фенилаланина подробно изучена с использованием меченых атомов углерода и азота (Гудвин, Мерсер,1986). Однако в литературе представлены неоднозначные данные по влиянию света на биосинтез пигмента. Особый интерес вызывают вопросы, касающиеся механизмов и путей регуляции синтеза амарантина и его накопления в листьях и стебле при действии света различного спектрального состава и интенсивности освещения.
Учитывая, что одним из центров происхождения амаранта являются высокогорные районы Латинской Америки, где растения подвергаются интенсивному УФ-облучению (Covas, 1996), актуальными являются исследования биологического действия длинноволнового УФ-А света в области 350-370 нм на содержание амарантина и фотосинтетических пигментов в листьях амаранта. Известно, что действие УФ- излучения и света высокой интенсивности усугубляется в присутствии фотосенсибилизаторов- веществ, которые повышают чувствительность растения и человека к свету, вызывая^ соответственно, фототоксические и фотоаллергические реакции. В связи с этим поиск природных соединений, которые способны защищать водорастворимые компоненты клетки от
10 поражающего действия светового излучения^ и изучение механизмов их функционирования является актуальным и своевременным.
Одним из наиболее важных аспектов изучения биологической роли пигментов, в том числе и амарантина, является проблема защитно-приспособительной реакции растений амаранта к световому потоку, а также выявление механизмов протекторной функции амарантина по отношению к компонентам клетки при действии фотострессоров.
В мировой медицинской практике в настоящее время отмечается устойчивая тенденция увеличения использования,, наряду с лечебными, профилактических препаратов растительного происхождения. По прогнозам Всемирной организации здравоохранения в XXI веке только 20% химически чистых препаратов и лекарственных средств будет использоваться в практической медицине, тогда как более 80 % лекарственных средств будут использоваться в виде экстрактов и пищевых добавок, содержащих биологически активные вещества (БАВ).
В связи с этим разработка пищевых и биологически активных препаратов на основе воспроизводимого растительного сырья'из амаранта, обогащенного природным красно-фиолетовым пигментом - алкалоидом амарантином и другими БАВ и АО,является актуальным для профилактики здоровья человека. Актуальность исследования в этом направлении вытекает и из правительственной «Концепции государственной политики в области здорового питания населения России на период до 2005 года». В соответствии с Концепцией в области производства пищевых продуктов необходимо создать технологии производства качественно новых пищевых продуктов с направленным изменением химического состава, соответствующего потребностям организма человека ? и использовать воспроизводимое растительное сырье для производства полноценных продуктов питания.
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы является многоплановое изучение культуры амарант в связи с биосинтезом амарантина: определение физико-химических свойств, механизмов его функционирования, биологической активности и выяснение его роли при действии фотострессоров, а также разработка новых функциональных продуктов на основе сырья амаранта.
Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:
изучить динамику роста, накопления биомассы и биосинтеза алкалоида амарантина у растений амаранта в онтогенезе и выявить взаимосвязь между фотосинтетической продуктивностью и накоплением алкалоида;
изучить особенности роста и фотосинтеза у зелено- и краснолистных видов амаранта в связи с биосинтезом алкалоида амарантина;
установить закономерности накопления амарантина в зависимости от биологических особенностей растений амаранта и экзогенных факторов;
разработать способы выделения амарантина и изучить окислительно-восстановительные свойства и антиоксидантную активность амарантина в модельных системах in vitro и in vivo; оценить возможные механизмы его взаимодействия с активными формами кислорода;
проанализировать сортовую взаимосвязь между накоплением амарантина и содержанием метаболитов в шикиматном пути хлоропластов в растениях амаранта при селекции на повышенное содержание амарантина;
разработать новые технологии получения обогащенных и комбинированных продуктов питания функционального назначения.
Научная новизна исследования. Впервые показана ценность культуры амарант как источника биологически активных веществ, в том числе, алкалоида амарантина. Экспериментально обосновано, что одним из факторов аккумуляции амарантина в красноокрашенных видах амаранта является оптимизация световых и температурных условий выращивания, а
12 также минерального питания, при которых усиливается биосинтез пигмента. При этом различные генотипы существенно различаются между собой по способности накапливать амарантин в темноте и на свету, что связано с возможностью альтернативных путей биосинтеза амарантина в нефотосинтезирующих тканях и хлоропластах. В серии экспериментов с набором сортов амаранта, подвергнутых воздействию факторов стрессового характера (дефицит и избыток освещения, УФ-А свет, пониженные температуры), показана неодинаковая изменчивость содержания амарантина в зависимости от вида растения и возраста листьев. Представленные в работе данные являются новой информацией для понимания путей регуляции содержания амарантина — в онтогенезе растения, а также при действии света различного спектрального состава и интенсивности освещения и минерального питания. Новыми являются данные о способности УФ-А света индуцировать биосинтез амарантина в семядольных листьях этиолированных проростков амаранта.
Впервые в различных модельных системах in vitro изучена антиоксидантная активность амарантина и выявлены механизмы' его антиокислительного действия. Совокупность результатов, полученных в итоге многоплановых экспериментальных исследований,, позволили выдвинуть новые представления о механизмах антиокислительного действия амарантина путем ингибирования супероксид анион-радикала и свободных радикалов, образующихся при окислительном стрессе, инициированном облучением УФ-А светом и светом высокой интенсивности, а также образования активных комплексов с ионами металлов переменной валентности, которые катализируют и регулируют свободно-радикальные реакции.
В модельной системе с изолированными хлоропластами впервые обнаружена способность амарантина восстанавливаться при взаимодействии с компонентами электрон-транспортной цепи на акцепторном участке фотосистемы II (ФСП), расположенными до пластохинона. Выявлено
13 неоднозначное влияние различных концентраций амарантина на показатели медленной индукции флуоресценции и термолюминисценции, что свидетельствует о различной эффективности функционирования ФСИ в присутствии амарантина. Показано, что амарантин влияет на перенос электронов на участке фотосистемы І (ФСІ), частично восстанавливая реакционные центры ФСІ.
Из листьев амаранта выделены три формы амарантина: низкомолекулярная и две высокомолекулярные, одна из которых связана с белком, а другая с пектином, изучен их биохимический состав. Впервые выявлен характер общих закономерностей между накоплением амарантина и изменением содержания флавоноидов, лигнина, ауксинов, синтезирующихся по шикиматному пути в хлоропластах, а также белка и клетчатки в листьях амаранта сорта Валентина.
Новизна разработанных способов получения амарантина подтверждена тремя патентами на изобретения (№ 2118971, № 2140432 и № 2214710), а создание салатного сорта амаранта Валентина подтверждено авторским свидетельством Российской Федерации № 31748, который внесен в Госреестр селекционных достижений России, допущенных к использованию в сельском хозяйстве и перерабатывающей промышленности. Научно-практическая значимость работы. Полученные результаты имеют прежде всего теоретическое значение, расширяя знания о восстановительных и антиоксидантных свойствах, биологической активности и функциональной роли алкалоида амарантина, а также углубляя представления о возможности регуляции содержания амарантина светом в листьях проростков и взрослых растений амаранта.
Впервые разработана методология биохимической селекции с использованием биохимических показателей для создания сортов овощных культур с повышенным содержанием биологически активных веществ. Использование семейственного отбора растений амаранта на повышенное
содержание амарантина позволило создать сорт Валентина с высоким содержанием амарантина, флавоноидов, пектина с целью использования его в пищевой промышленности в качестве технической культуры для получения функциональных продуктов нового поколения.
Разработанный способ получения амарантина из листьев краснолистного сорта Валентина и выявленные закономерности накопления пигмента амарантина в онтогенезе растения могут найти применение в промышленной биотехнологии для получения натурального растительного пищевого красителя, экономически более эффективного по сравнению со свекольным.
Разработаны и утверждены в установленном порядке технические условия (ТУ) и технологическая инструкция на производство пищевого красителя "Амфикра" (ТУ 9169-001-31890466-97), пищевой приправы "Амвита" (ТУ 9161-001-45727225-01), новые продукты чая (ТУ 9191-431-04605473-01): чай черный байховый с листьями амаранта (60% чая и 40% листьев амаранта) и чай зелённый с листьями амаранта (80% чая и 20% листьев амаранта) сорта Валентина. На основании проведенных исследований на научную документацию получены удостоверения МЗ РФ о возможности производства вышеуказанных функциональных продуктов и приправ на пищевые цели, которые по сравнению с традиционными продуктами обеспечивают:
-повышение питательных (высокое содержание белка, липидов), и антистрессовых (большой набор антиоксидантов) свойств;
-экологическую безопасность (отсутствие токсических веществ, болезнетворных микроорганизмов, высокое содержание пектинов, способных связывать ионы тяжелых металлов и выводить их из организма).
Народнохозяйственная значимость выполненной работы состоит в том, что широкое внедрение амаранта в сельскохозяйственное производство и создание на его базе высокобелково — витаминного сорта Валентина
15 обеспечивает пищевую промышленность ценным растительным сырьём, увеличивает производство, расширяя ассортимент лечебно-профилактических продуктов с повышенным содержанием БАВ, АО и микронутриентов, а также имеет определенное социальное значение в решении проблемы здоровья нации.
Основные положения диссертации, выносимые на защиту:
онтогенетические особенности фотосинтеза, роста и развития растений красноокрашенных видов амаранта в связи с биосинтезом алкалоида амарантина;
физико-химические и антиоксидантные свойства амарантина как основа, определяющая физиолого-биохимические функции (протекторную, резервирование азота, переносчика электронов) и биологическую активность пигмента (эффекты стимуляции прорастания семян, реакций фотосинтеза, активность ферментов, роста и развития растений, нарастания биомассы бифидобактерий);
системный подход к формированию пула амарантина у растений амаранта с учетом их биологических особенностей, воздействия света различной интенсивности и спектрального состава и оптимизированных элементов (азот, фосфор, калий);
эффективность селекции амаранта по содержанию амарантина как результат изменения содержания и соотношения основных продуктов биосинтеза клетки: белков, пектина, флавоноидов, аминокислот;
новые технологические процессы получения нового поколения обогащенных и комбинированных продуктов функционального назначения (Амфикра, Амвита, чай черный с амарантом, чай зеленый с амарантом) и биохимическая оценка их качества.
Апробация работы. Основные положения и результаты диссертационной работы были доложены и обсуждены на I, II, III, IV и V Международных симпозиумах "Новые и нетрадиционные растения и
16 перспективы их практического использования" (Пущино, 1995, 1997, 1999, 2001, 2003 гг.); Международной конференции по действию УФ и синего света (Марбург, 1996); I Всероссийской конференции фотобиологов (Пущино, 1997); XII Международном конгрессе фотобиологов (Вена, 1997), Международной научно-практической конференции "Интродукция нетрадиционных и редких сельскохозяйственных растений" (Пенза, 1998), II Международном съезде фотобиологов (Пущино, 1998), IV Международной научно-практической конференции "Рынок и управление", (Москва, 1999), III съезде фотобиологов России (Воронеж, 2001), IV Международной научно-практической конференции "Интродукция нетрадиционных и редких растений" (Ульяновск, 2002), Научно-методической конференции "Состояние и перспективы развития нетрадиционных садовых культур" (Мичуринск, 2003), III Международной конференции "Регуляция роста, развития и продуктивности растений" (Минск, 2003).
Материалы диссертационной работы используются в учебном процессе на кафедре Растениеводства в РУДН при чтении лекций, на дипломной и курсовой практиках, включены в монографию соискателя «Биологически активные вещества амаранта. Амарантин: свойства, механизмы действия и практическое использование», 2002.
Опытные образцы нового поколения продуктов и информационно-справочный материал демонстрировались на выставках в городах: Москве, Челябинске и Рязани.
Характеристика растений рода Amaranthus L
Систематика семейства амарантовых или щирицевых (Amaranthaceae). Семейство амарантовых включает около 65 родов и более 900 видов, широко распространенных во всех климатических зонах. В СССР насчитывалось до 16 видов, большинство из которых сорные растения (Черепанов, 1981; Мироненко и др., 1990). Встречающиеся в Средней и Восточной Европе, в Сибири, представители рода амарант (Amaranthus) (А. retroflexus, A. albus, A. blitoides) исключительно заносные растения. Центр разнообразия рода Amaranthus лежит на юго-западе США и в Мексике, откуда все новые виды рода заносятся в Европу (Еленевский и др. 2001). Однако, огромное разнообразие форм и сортов, а также свободная межвидовая скрещиваемость этого растения значительно затрудняет его систематизацию. Большинство систематиков род Amaranthus L. относят к отделу покрытосеменных (Angiospermae), классу двудольных (Dicotyledoneae), к порядку центросеменных (Centrospermae), семейству амарантовых (Amaranthaceae), род амарант (Amaranthus).
К культивируемым видам амаранта относят от 7 видов (A. blitum L., A. caudatus L., A. mantegazzianus Passer., A. dubius mart., A. paniculatus L., A. spinosus L., A. tricolor) до 3 (A. caudatus L.,A. cruentus L., A. hipochondriacus L., или двух (A. cruentus L., A.caudatus L.) видов амаранта (Вульф,1969; Saunder, Becker, 1983; Черепанов, 1981). Огромное количество сортообразцов есть результат их скрещивания и отбора. Однако нет еще четкой классификации видов амаранта и система рода Amaranthus по мнению ботаников требует ревизии.В коллекции ВИР широко представлен мировой потенциал амаранта, содержащий 28 видов, из которых некоторые виды можно рассматривать как синонимы или различные подвиды, или разновидности (Гиренко, Бородкин, 1991). Однако, необходимость уточнения таксономии этого рода подтверждается и тем, что очень часто под одним и тем же видовым названием оказывается совершенно разный материал, а большинство местных сортообразцов еще требует видового определения. Это создает определенные трудности при анализе физиолого-биохимических показателей и продуктивности амаранта, представленных в работах разных авторов.
Работа по определению видового состава осложняется малой величиной частей цветка, наличием мужских и женских цветков, малыми размерами семян. А именно признаки цветка и семени лежат в основе построения классификации амаранта.В связи с вышесказанным, в России стоит очень остро проблема селекции амаранта для различных регионов. Потребность в районированных семенах амаранта диктуется успешной интродукцией этого растения, т.е. возможностью повсеместно выращивать и получать высокий урожай зеленой массы или семян. Для широкого внедрения амаранта в сельскохозяйственное производство требуются высокопродуктивные сорта с ценными биохимическими показателями, районированные в определенной зоне возделывания с четко организованной системой семеноводства.
К настоящему времени в Государственный реестр селекционных достижений, допущенных к использованию, входят всего несколько сортов амаранта кормового (силосного) и один сорт овощного направления. Это сорта:Шунтук - селекции Майкопской овощной селекционной станции ГНЦ РФ ВНИИ растениеводства им. Н.И. Вавилова, внесен в Государственный реестр в 1992 году, допущен к использованию в 5 регионах России: Северо-Западном, Центральночерноземном, Северо-Кавказском, Западно-Сибирском и Дальневосточном);
Чергинский - селекции Института цитологии и генетики СО РАН (г. Новосибирск) и Сибирского НИИСХ (г. Омск), внесен в Государственный реестр в 1995 году;Стерх - селекции ГНЦ РФ ВНИИ растениеводства им. Н.И. Вавилова (г. Санкт-Петербург), внесен в Государственный реестр в 1992 году;
Подмосковный - селекции ВНИИ кормов РАСХН (Луговая, Московской области), внесен в Государственный реестр в 2000 году; Кизлярец - селекции ВНИИ селекции и семеноводства овощных культур (Одинцово Московской области), внесен в Государственный реестр в 2001 году;
Валентина (амарант овощной) - селекции ВНИИ селекции и семеноводства овощных культур (Одинцово Московской области), внесен в Государственный реестр в 1999 году.Виды амаранта условно подразделяют на зерновые (A. cruentus, А. caudatus, A. hipochondriacus, A. mantegazzianus, A. paniculatus), овощные (А. tricolor, A. caudatus), кормовые, лекарственные и декоративные.1.2.2. Морфо-биологические свойства. Большинство видов рода Amaranthus L. (амаранта) являются однолетними травянистыми растениями. Известен только один вид овощного многолетнего амаранта - Amaranthus greggii S.Wats, произрастающий в устье реки в Мексике - Вера-Круз, семена которого были получены профессором Коненковым П.Ф. от доктора Коваса из Аргентины. Из полученных стратифицированных семян выращены в теплице ВНИИССОК растения, являющиеся типичными галофитами.
Анатомия и морфология амаранта разнообразна в зависимости от вида, места обитания и условий его выращивания. Высота растений достигает от 0,4 до 3 метров. Стебель у подавляющего большинства видов амаранта прямостоячий (диаметром до 5 см), реже встречается лежачий, ветвистый, облиственный. По степени ветвления растения амаранта можно разделить на слабо- и сильно ветвистые. При удалении верхушки стебля наблюдается интенсивное образование боковых побегов. Амарант является отавной культурой.Листья длинночерешковые, без прилистников, очередные или супротивные, яйцевидные, цельные, заостренные на верхушке, с клиновидным основанием. Форма листовой пластины эллиптическая, яйцевидно-ромбическая, продолговатая. Верхние листья имеют более короткие черешки, чем ниже расположенные, что создает возможность для более равномерного освещения растений (Тимонин, 1984). Среднее число листьев у одного растения в посеве может достигать 250 штук. Общая листовая поверхность одного растения при оптимальных условиях составляет около 8000 см2. Индекс листовой поверхности в зависимости от густоты стояния растения и других факторов может изменяться от 6 до 12 (Кадошников и др., 1989; Иванова, Шемет, 1998). Размеры листьев варьируют от крупных с хорошо выраженным жилкованием до мелких.
Определение антиоксидантных свойств амарантина в липидной гетерогенной системе
К полученной сухой липидной плёнке добавляли буферный раствор (20 мМ трис-HCl, рН 7,4) и образовавшуюся суспензию многократно перемораживали. Инициирование липидной пероксидации осуществляли введением 20 мкМ раствора FeS04 к реакционной среде, содержащей суспензию липосом ( 0,4 мг фосфолипидов на 1 мл ), 0,04 объёмных процента тритона Х-100, 0,1 мкМ активатора ХЛ производного кумарина С- 525 и 20 мМ трис НС1 буфера рН 7,4 с помощью синхронизированной с компьютером бюретки. Измерение ХЛ осуществляли на хемилюминометре ХЛМ-3 (БИКАП, Москва). Кинетика хемилюминесценции обрабатывалась с помощью системы Macintosh LC 11 - Maclab/2e (ADInstruments, Австралия). 2.6.3. Определение антиоксидантной активности препаратов амарантина в водной модельной системе глицилтриптофан - рибофлавин. Регистрировали влияние различных препаратов амарантина на выход хемилюминесценции (ХЛ), сопровождающей окисление пептида Glyrp при облучении УФ-светом в полосе поглощения фотосенсибилизатора рибофлавина. Принципиальная схема установки, использованной для изучения фото-хемилюминесценции растворов, приведена на рис.2.2.
Раствор, содержащей Glyry и исследуемое вещество в 0,01 моль/л фосфатном буфере (рН 7,4), помещали в термостатированную кювету и облучали ртутной лампой при постоянном перемешивании. Толщина облучаемого слоя раствора, как правило, составляла 0,1 см, время облучения -60с. Для регистрации сигнала облученный раствор перекачивали в кювету фотометрической установки. Абсолютную интенсивность ХЛ определяли сравнением с интенсивностью жидкого радиолюминесцентного источника по Хастингсу-Веберу (1 усл. ед.= 1,8x10 квантов ХЛ/(млхс)). 2.7. Препаративное получение бетацианинов. При изучении физико-химических свойств, биологической активности и механизмов действия бетацианинов необходимо иметь препараты пигментов достаточно высокой степени очистки. Водорастворимые бетацианиновые пигменты выделяют из различных органов растений: листьев, соцветий, стеблей, корней, корнеплодов. В опытах используют свежесобранный материал или высушенный при температуре 40С , с последующим измельчением до порошкообразного состояния. Растительный материал содержит большое количество сопутствующих соединений, которые необходимо отделить от бетацианинов. Для очистки пигментов используют традиционные методы препаративной биохимии: центрифугирование, ионообменную хроматографию, гельфильтрацию на различных носителях, диализ и др. Пигмент переводят в растворимое состояние путем экстракции сухого порошка водой или водно-спиртовыми растворами (до 70). Свежесобранный растительный материал измельчают в гомогенизаторе.
Для осаждения белков и высокомолекулярных соединений используют фракционное осаждение нейтральными солями, обычно (NH2) SO4. Важным условием является определение оптимальных значений рН, ионной силы и температуры. Величина рН должна соответствовать изоэлектрической точке белка, чтобы полнее освободить раствор пигмента от белка. Для предотвращения обесцвечивания белка, связанного с амарантином проводят осаждение при пониженной температуре (около 4С). Разделение низко- и высокомолекулярных фракций веществ осуществляют путем диализа. Для очистки пигментов эффективно использовать: метод высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), ионнообмен-ную хроматографию, в основе которой лежит различие в кислотно-основных свойствах веществ, фильтрацию на сефадексах, основанную на различиях молекулярных масс. Отличия в знаке и величине заряда в молекулах пигментов широко используют для разделения пигментов в поддерживающих средах (крахмал, агар, полиакриламиддекстран).
Обычно для оценки чистоты препарата пигментов или окрашенных белков применяют спектроскопические критерии - отношение оптических плотностей видимой (хромофорной) и ультрафиолетовой областей (Конев, 1979, Гине, 1991). Кривые термолюминесценции записывали на лабораторной установке кафедры биофизики физического факультета МГУ, описанной в работе (Караваев с соавт., 1997). Образцы облучали светом лампы накаливания КГМ-30-3009 мощностью 15 Вт/м . Для стандартизации начальных условий, образцы освещали через интерференционный фильтр с максимальным пропусканием при 725 нм (ДА=5 нм) одну минуту. Затем в стандартных опытах адаптировали их к темноте в
Изучение транспорта электронов в хлоропластах у зелено- и краснолистных форм амаранта
Амарант входит в аспартатную или НАД-малатдегидрогеназную (НАД-МДГ) группу Сграстений. Общие фотохимические затраты, у которых ас-партат и аланин являются главными метаболитами, вовлеченными в обмен между клетками мезофилла и паренхимной обкладки. Общие фотохимические затраты на фиксацию одной молекулы углекислоты у этой группы растений составляют: 2 молекулы АТФ в С4-цикле и 3 молекулы АТФ и 2 молекулы НАДФ-Нг в восстановительном пентозофосфатном цикле (ВПФЦ). Учитывая локализацию отдельных стадий ВПФЦ у Ограстений, общий баланс фотохимических затрат при аспартатном типе С4- фотосинтезе составляет: в хлоропластах мезофилла - 3 молекулы АТФ и одну молекулу НАДФ-Нг, а в хлоропластах паренхимной обкладки - две молекулы АТФ и одну молекулу НАДФ-Н2 (Эдварде, Уокер, 1976).
Известно, что у Сз-растений для фиксации углекислоты необходимо соотношение АТФ/ НАДФ-Н2 равное 3/2. У аспартатной группы С4-растений при фиксации углекислоты потребляется на 2 молекулы АТФ больше. Считают, что у Сз-растений около 1,33 молекулы АТФ синтезируется в нециклическом, а оставшееся количество АТФ - в циклическом транспорте электронов (Woo, 1983). В отношении Сз-растений в литературе обсуждается вопрос о возможности дополнительного синтеза АТФ в псевдоциклическом транспорте электронов. В связи с этим мы провели сравнительное исследование активности переноса электронов по нециклическому и псевдоциклическому пути у зеленолистного A. paniculatus и краснолистного A. cruentus, сорт Тампола видов амаранта.При исследовании фотовосстановительных реакций фотосинтеза в молодых листьях красноокрашенного и зеленого видов амаранта обнаружена сравнимая активность нециклического транспорта электронов в модельной системе хлоропластов в присутствии феррицианида (ФЦ), тогда как в листьях закончивших рост и стареющих скорость переноса электронов по нециклическому пути была выше у A. cruentus (рис. 3.5).
Скорость псевдоциклического транспорта электронов от воды к компонентам восстановительной стороны фотосистемы I была относительно низкой в молодых листьях (16±3 мкмоля СУмг хлорофилла в час) и постепенно возрастала по мере увеличения их возраста. Максимальная скорость переноса электронов на молекулярный кислород в зрелых листьях A. cruentus достигала 90 мкмолей 02/мг хлорофилла в час, а в листьях зеленой формы до мкмоля Ог/мг хлорофилла в час. В стареющих листьях происходило снижение активности псевдоциклического пути переноса электронов, особенно сильное в листьях A. paniculatus. В фазу цветения у A. paniculatus в молодых листьях доля переноса электронов на молекулярный кислород была выше чем в стареющих, тогда как у A. cruentus наблюдалась обратная тенденция. Исходя из полученных в результатов, можно предполагать, что в хлоропластах листьев амаранта псевдоциклический транспорт электронов играет важную роль, так как его активность сравнима с нециклическим переносом электронов, а в отдельных случаях превышает активность последнего.
Однако, скорость восстановления молекулярного кислорода в присутствии адреналина (Адр.), позволяющего регистрировать образование супероксидного анион-радикала в ФС I, во всех листьях краснолистного амаранта была существенно выше по сравнению с зеленолистным. Возможно это связано с особенностями вторичного метаболизма в листьях A. cruentus - с синтезом большого количества амарантина, в результате которого алкалоид способен инактивировать супероксидный анион-радикал, образующийся при восстановлении молекулярного кислорода. Не исключено, что дополнительное образование АТФ при восстановлении Ог у красноокрашенных растений амаранта в растущих и закончивших рост листьях обуславливает накопление значительного количества амарантина. Кроме того, лимитирование расхода восстановителя НАДФ-Нг и АТФ на ростовые процессы может быть связано с дополнительным его использованием в шикиматном пути на биосинтез предшественников амарантина и самого алкалоида.
Особенности накопление амарантина в семядольных листьях этиолированных и световых проростках амаранта
Свет оказывает не только субстратное, но и регуляторное воздействие на биосинтез разнообразных растительных пигментов в клетке. В литературе представлены неоднозначные данные по действию света на содержание амарантина. По-видимому, это связано, с тем, что биосинтез амарантина представляет собой сложную цепь последовательных реакций, где имеются отдельные фотохимические стадии, то есть химические реакции синтеза пигмента в норме, протекающие под действием света. Предполагается, что большинство стадий биосинтеза амарантина не нуждается в свете, однако на одной из заключительных стадий, свет может быть необходим при синтезе дигидропиридиновой части амарантина (Woodhead; Swain, 1974). В то же время обнаружены отдельные видообразцы амаранта, образующие красный пигмент в темноте (Piattelli et all, 1969).4.3.1. Накопление амарантина в листьях этиолированных и световых проростках амаранта. Для получения более полной информации о способности красноокрашенных форм различных видов амаранта образовывать амарантин в 7 сут этиолированных проростках амаранта, нами исследовано содержание амарантина у 32 видообразцов амаранта. Изученные образцы амаранта были разделены на 2 группы: в проростках 14 образцов амаранта не обнаружили амарантин, в то время как проростки 18 образцов амаранта содержали красный пигмент (рис. 4.1, 4.2). Количество амарантина в этиолированных проростках образцов, способных синтезировать пигмент в темноте, изменялось в широких пределах от 0,016 до 0,524 мкг на проросток, различа ясь между собой от 1,1 до 32,7 раза. Наибольшей способностью синтезировать амарантин в этиолированных проростках отличались сорт Валентина и образцы: К-99, К-23, К-185.
По результатам наших опытов выращивание проростков различных образцов амаранта на свету (8 клк) выявило разные потенциальные способности проростков синтезировать красный пигмент. Изученные образцы амаранта расположили по мере возрастания содержания амарантина в проростках, что позволило выявить следующую закономерность. Образцы амаранта, проростки которых при выращивании на свету образовывали амарантин в небольшом количестве до 0,18 мкг/проросток, в этиолированных проростках красный пигмент не содержали (рис.4.1). Высокой способностью образовывать амарантин на свету отличались образцы сорт Валентина, К-99, К-23, К-185 (рис. 4.2). При этом интервал варьирования содержания амарантина между изученными образцами был достаточно широк от 1,1 до 56,6 раз. Для характеристики образцов и сравнения их между собой по потенциальной способности накапливать амарантин в световых и этиолированных проростках мы ввели условный показатель потенциальной способности проростка (ПС) синтезировать амарантин на свету и в темноте:
Показатель ПС амарантина для проростков изученных образцов варьировал от 2,3 до 3,4, исключение составили К-185, у которого показатель ПС равнялся 8,59, а у К-151- 18,9. Следует подчеркнуть, что образцы, проростки которых на свету накапливали амарантин в количестве более 0,2 мкг/проросток, образовывали пигмент в этиолированных проростках (рис. 4.3).Изучали действие света на кинетику накопления амарантина в проростках. Как видно из рис. 4.3 после 2-х часового освещения этиолированных проростков амаранта образование амарантина начиналось спустя 4 часа и достигало максимального значения через 20 часов. Дальнейшее выдерживание проростков в темноте приводило к снижению содержания амарантина в семядольных листьях. Изучение зависимости изменения содержания амарантина в проростках от продолжительности светового воздействия выявило, что количество амарантина в семядольных листьях этиолированных проростков, освещенных светом в течение разного периода времени, возрастало с увеличением продолжительности световой экспозиции (рис. 4.4).Следовательно, с увеличением продолжительности времени действия естественного света на этиолированные проростки возрастает содержание красного пигмента.Поскольку потенциальные способности проростков амаранта образовывать амарантин существенно различаются при выращивании проростков
