Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 9
1.1. Агглютинин зародыша пшеницы (АЗП) как представитель лектинов злаковых 9
1.1.1. Структура и локализация АЗП 9
1.1.2. Предполагаемые функции АЗП 11
1.1.2.1. Запасная функция 11
1.1.2.2. Защитная функция 12
1.1.2.3. Участие АЗП в гормональной регуляции ростовых процессов растений пшеницы 15
1.1.2.4. Взаимодействие лектинов с другими белками 19
1.2. Физиолого-биохимические процессы растений при воздействии стрессовых факторов, вызывающих дефицит влаги 22
1.2.1. Роль АБК в развитии стресс-устойчивости растений 23
1.2.2. Стресс-индуцированная экспрессия генов защитных белков 24
1.2.3. Участие пролина в стрессовом ответе растений 27
1.2.4. Про/антиоксидантная система растений при стрессе 30
1.2.5. Активность ростовых процессов растения при стрессе 36
2. Материалы и методы 41
2.1. Объект исследования 41
2.2. Постановка опытов 41
2.2.1. Подбор оптимальных в стимуляции роста клеток концентраций АЗП 41
2.2.2. Постановка опытов при засолении 42
2.2.3. Постановка опытов при воздействии гипотермии 43
2.3. Экстрагирование фитогормонов и лектина из одной растительной навески 43
2.3.1. Метод ИФА для оценки содержания лектина и фитогормонов 44
2.4. Акцепторный метод определения генерации супероксид-аниона 45
2.5. Определение активности супероксиддисмутазы 46
2.6. Оценка выхода пероксида водорода в экстраклеточную среду 47
2.7. Использование микрометода для определения активности пероксидазы 48
2.8. Определение содержания малонового диальдегида 49
2.9. Оценка экзоосмоса электролитов из клеток в наружную среду 49
2.10. Метод определения митотической активности меристематических клеток и площади клеток в зоне растяжения корней 50
3. Результаты исследований и их обсуждение 52
3.1. Механизмы влияния АЗП на интенсивность ростовых процессов растений пшеницы 52
3.1.1. Сравнительный анализ влияния разных фитолектинов на рост и гормональный статус проростков пшеницы 52
3.1.2. Оценка сродства АЗП с фитогормонами методом иммуноанализа 60
3.1.3. Влияние АЗП на клеточный цикл пшеницы 66
3.1.4. Влияние АЗП на интенсивность ростовых процессов клеток корней других растений 68
3.1.4.1. Анализ роста клеток корней растений ячменя под влиянием АЗП 68
3.1.4.2. Влияние АЗП на рост клеток корней растений фасоли 70
3.2. Механизмы защитного действия АЗП на растения пшеницы 72
3.2.1. Эффект АЗП на интенсивность ростовых процессов растений пшеницы при гипотермии 72
3.2.2. Влияние АЗП на рост и гормональный статус растений при засолении 79
3.2.3. Вовлечение антиоксидантных ферментов в проявление антистрессового действия лектина на растения пшеницы при засолении 93
Заключение 100
Выводы 104
- Физиолого-биохимические процессы растений при воздействии стрессовых факторов, вызывающих дефицит влаги
- Постановка опытов
- Метод определения митотической активности меристематических клеток и площади клеток в зоне растяжения корней
- Механизмы защитного действия АЗП на растения пшеницы
Введение к работе
Актуальность. Агглютини н зародыша пшеницы (АЗП) является типичным представителем лектинов злаков, физико-химические и биологические свойства которого достаточно хорошо охарактеризованы [Chrispeels, Raikhel, 1991; Raikhel, Lee, 1993; Rudiger, 1997; Rudiger, Gabius, 2001; Шакирова, 2001], однако его функциональная значимость до сих пор дискутируется в литературе [Rudiger, Gabius, 2001; Антонюк, Игнатов, 2001; Шакирова, 2001; Bezverkhova et al., 2002]. В связи с тем, что этот белок обладает специфичностью к Л^-ацетил-О-глюкозамину (GlcNAc), к числу функций, h^ которые он реально может выполнять в растениях пшеницы, относится защита от фитопатогенных грибов [Mirelman et al., 1975; Chrispeels, Raikhel, 1991; Ciopraga et al., 1999; Шакирова, 2001]. Вместе с тем, имеются данные об индукции АБК-опосредуемого накопления АЗП в растениях пшеницы в ответ на воздействие засухи, осмотического шока, засоления, гипертермии [Cammue et al., 1989; Шакирова и др., 1993; 1995; Shakirova et al., 1996; Singh et al., 2000], что дает основание предполагать возможность участия лектина пшеницы в защите растений от неблагоприятных факторов среды также и абиотической природы, однако, в данном случае не ясно, в чем проявляется $L его антистрессовый эффект, В связи с тем, что АЗП в растениях пшеницы преимущественно синтезируется и аккумулируется в меристематических тканях [Mishkind et ah, 1982; Raikhel et ah, 1984; Stinissen et ah, 1985; Cammue et a 1., 1 989], можно предполагать участие этого белка в регуляции деления клеток. В пользу этого предположения свидетельствуют данные об активации экспрессии гена АЗП и накоплении этого белка в растениях пшеницы под влиянием индол илу ксусной (ИУК) и гибберелловой кислот, 24-эпибрассинолида, цитокинина 6-бензиламинопурина [Шакирова и др., 2000; Авальбаев и др., 2001; Безрукова и др., 2001; Shakirova et aL, 2001; Шакирова кл, и др., 2002], играющих, как известно, важную роль в стимуляции ростовых процессов растений.
7 Действительно, полученные к началу нашей работы данные о стимулирующем действии АЗП на рост клеток корней делением и растяжением [Авальбаев, 2001], указывают на вовлечение АЗП в сигнальную регуляцию ростовых процессов клеток. Далее важно было исследовать, что лежит в основе ростстимулирующей активности лектина, ограничивается ли это свойство АЗП только растениями пшеницы или он может проявлять его и на других видах растений. Следует отметить, что АЗП обладает способностью экскретироваться в окружающую среду [Mishkind et al., 1982; Cammue et al., 1989], но не ясно, какое значение это свойство лектина может иметь для роста клеток пшеницы. В связи с тем, что к числу характерных ответных реакций растений на повреждающие факторы среды относится торможение роста [Schuppler et al., 1998; Lin, Кж>, 2001; Колес, Онсел, 2004], встает вопрос, способен ли лектин оказывать защитное действие на ростовые процессы клеток корней в стрессовых условиях.
Цель и задачи исследований. Цель данной работы состояла в выяснении механизмов ростстимулирующего, а также защитного действия АЗП на ростовые процессы клеток корней проростков пшеницы при воздействии засоления и гипотермии. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи: изучить роль гормональной системы в реализации действия АЗП на рост клеток корней проростков пшеницы делением и растяжением в норме и при стрессе; сопоставить характер количественных изменений в уровне лектина в корнях проростков пшеницы с динамикой экскреции этого белка в окружающую среду в стрессовых условиях; провести анализ влияния АЗП на рост клеток корней ячменя (эволюционно близкий пшенице вид) и фасоли (эволюционно отдаленный вид) для оценки проявления ростстимулирующего действия АЗП на разных видах растений;
4) исследовать влияние АЗП на про- и антиоксидантный статус растений пшеницы;
8 5) в системе in vitro оценить способность АЗП к связыванию с фитогормонами методом иммуноанализа с использованием тест-систем, специфичных для каждого из исследуемых компонентов. Научная новизна. Выявлено, что в основе действия АЗП на рост клеток корней проростков пшеницы в нормальных и стрессовых условиях лежат вызванные обработкой лектином сдвиги в гормональном балансе. Показано, что ростстимулирующее свойство АЗП не является универсальным для различных видов растений. Получены приоритетные данные о проявлении АЗП свойства антиоксиданта, которое основывается на снижении под влиянием предобработки АЗП уровня продукции активных форм кислорода, перекисного окисления липидов, экзоосмоса электролитов в условиях засоления среды. Впервые показана принципиальная способность АЗП к связыванию с фитогормонами, не затрагивая углевод-связывающие сайты лектина.
Практическая значимость работы. Совокупность полученных результатов свидетельствуют о наличии у АЗП антиоксидантного и ростстимулирующего свойств, имеющих важное значение в проявлении защитного действия этого лектина на растения пшеницы в стрессовых условиях, что дополняет и расширяет наши знания о естественных механизмах устойчивости растений.
Физиолого-биохимические процессы растений при воздействии стрессовых факторов, вызывающих дефицит влаги
Как известно, к числу широко распространенных в природе стрессовых воздействий относятся засуха, гипотермия, засоление, вызывающие в клетках растений нарушение водного режима, отражением которого является потеря воды, сопровождаемая уменьшение тургорного давления клеток. Все эти упомянутые стрессовые факторы ограничивают также поступление воды в растения [Строганов, 1973; Frensch, Hsiao, 1994; Quartacci et al, 1995; Whitsitt et al., 1997; Sairam et al., 1998; Yu, Rengel, 1999; Кузнецов, Шевякова, 1999; Liu et al., 2000; Hsiao, Xu, 2000; Yang et al., 2001; Захарин, 2001; Munns, 2002; Lee et al., 2004], что отражается в уменьшении ее содержания в них [Griffith, Mclntyre, 1993; Iturbe-Ormaetxe et al., 1998; Chen, Plant, 1999; Tambussi et al., 2000; Gill et al., 2001; Cavalcanti et al., 2004]. Вместе с тем, по некоторым данным, охлаждение может не оказывать практически никакого влияния на содержание воды в проростках сорго [Gill et al., 2001] и пшеницы [Колес, Онсел, 2004], хотя, возможно, что отсутствие эффекта низкой температуры на этот показатель обусловлено временем воздействия стресс-фактора. Так, например, в первые 2,5 ч гипотермии водный потенциал листьев проростков кукурузы снижался, приводя к полной потере тургора, однако к 24 ч охлаждения этот показатель вернулся к норме [Melkonian et al., 2004]. В то же время, гипотермия, даже не вызывающая видимых повреждений, в целом оказывает глубокое и разностороннее действие на физиологические процессы, протекающие в клетках: при воздействии низкой температуры клетки теряют тургор вследствие влияния на осмотический потенциал клеток и/или нарушения доставки воды, что также ведет к уменьшению содержания внутриклеточной воды [Proseus et al., 2000; Климов, 2001; Чиркова, 2002]. Роль АБК в развитии стресс-устойчивости растений Как известно, в регуляции устойчивости растений к стрессовым факторам, вызывающим обезвоживание, ключевая роль отводится АБК [Lang et al., 1994; Leung, Giraurdat, 1996; Chen, Plant, 1999; Rock, 2000, Шакирова, 2001]. Ярким примером, демонстрирующим этот факт, могут служить работы с дефицитными по АБК мутантными растениями, не способными к эффективной регуляции водного обмена при стрессе [Weyers et al., 2001]. Как правило, в стрессовых условиях в растениях увеличивается содержание АБК [Anderson et al., 1994; Dunlap, Binzel, 1996; Bhaglal et al., 1999; Chen, Plant, 1999; Jiang, Zhang, 2002; Чиркова, 2002; Jia et al., 2002; Fricke et al, 2004; Melkonian et al., 2004; Таланова и др., 2004], что приводит к дисбалансу гормонального статуса [Yang et al., 2001]. В литературе имеется большое количество данных, указывающих на индукцию устойчивости растений под влиянием экзогенной АБК: в зависимости от концентрации она способствовала предадаптации растений пшеницы, томата и огурца к низкой температуре [Титов и др., 1985; Таланова и др., 2004], клеток растений табака к засолению [Singh et al., 1987]. Вероятно, немалый вклад в развитие устойчивости растений к неблагоприятным факторам среды, вызывающим водный стресс, вносит индукция экспрессии генов более десятка стрессовых белков в ответ на обработку АБК, что наблюдается также при воздействии засухи, гипотермии, засоления [Yamaguchi-Shinozaki, Shinozaki, 1994; Leung, Giraudat, 1996; Close, 1996; Shinozaki, Yamaguchi-Shinozaki, 1997; Rock, 2000; Боровский и др., 2002; Аллагулова и др., 2003], что показывает значение АБК-опосредованных процессов в формировании устойчивости к стрессам.
В качестве примера можно привести индукцию АБК экспрессии генов антиоксидантных ферментов, поскольку многие стрессовые факторы, включая и вышеперечисленные, вызывают в клетках растений окислительный стресс [Prasad et al., 1994; Sgherri, Navari-Izzo, 1995; Fadzilla et al., 1997; Pastori et al., 2000; Лукаткин, 2002; Bandeoglu et al., 2004; Farrant et al., 2004; Lee et al, 2004; Mittova et al., 2004]. Так, АБК способна индуцировать экспрессию генов Cu/Zn-супероксидцисмутазы (СОД) [Sakamoto et al., 1995; Guan, Scandalios, 19986], Мп-СОД [Zhu, Scandalios, 1994; Bueno et al., 1998] и каталазы [Anderson et al., 1994; Guan, Scandalios, 1998a]. Водные стрессы, вероятно, затрагивают одни и те же пути передачи сигнала на клеточном уровне и на уровне целого растения [Реагсе, 1999]. Так, например, трансмембранная двухкомпонентная гистидинкиназа арабидопсиса, по-видимому, может служить функциональным осмосенсором, поскольку такие воздействия, как АБК, гипотонические растворы, низкая температура, засоление регулируют экспрессию ее гена, что дает возможность предположить ее участие в запуске биосинтеза АБК и других ответов растений на стресс [Rock, 2000]. Роль АБК в формировании устойчивости к стрессам общепризнанна, хотя следует заметить, что накопление АБК при стрессе в тканях растений наблюдается не всегда. Тем не менее, в этом случае все равно происходит изменение в состоянии гормональной системы, вероятно, связанное с уменьшением уровня фитогормонов - активаторов метаболических процессов, например, таких как ауксины и цитокинины [Жолкевич, Пустовойтова, 1993; Веселов и др., 2002]. 1.2.2. Стресс-индуцированная экспрессия генов защитных белков Изменения в гормональном статусе растений приводят в действие сложную систему настройки клеток и организма в целом в ответ на экстремальные условия существования. Одним из компонентов этой системы настройки является индукция экспрессии и усиление синтеза специфических в связи с их адаптацией к конкретному стрессу защитных белков [Блехман, Шеламова, 1992; Singh et al., 1987; Титов и др., 1992; Dell Aquila, Spada, 1993; Prasad et al., 1994; Bracale et al., 1997; Sarhan et al., 1997; Thomashow, 1999] на фоне снижения тотального синтеза белка [Gulick, Dvorak, 1987; Chen, Plant, 1999; Kawasaki et al., 2001]. Действительно, при стрессовых воздействиях экспрессионная активность генов изменяется количественно, качественно и во времени [Ramagopal, 1987; 1990; Robinson et al, 1990; Даскалюк и др., 1992; Ступникова и др., 2001], В связи с этим можно отметить некую общность «белковых ответов» на водный стресс [Close, 1996; Реагсе, 1999; Nylander et al., 2001], что, вероятно, обусловлено их функциональной значимостью в предотвращении резких нарушений в гомеостазе клеток в новых (стрессовых) условиях и адаптации к ним [Winicov, 1998; Zhu, 2000]. Это предполагает наличие сходных путей узнавания сигнала, его восприятие и транс дукцию в клетке [Pastori, Foyer, 2002], хотя пути реализации стрессового ответа еще далеки от полного понимания. Так, разнообразные стрессы могут вызывать в растениях экспрессию генов белков теплового шока [Маргулис, Гужова, 2000; Титов и др., 2003], аквапоринов, регулирующих водную проницаемость клеток [Yamada et al., 1995; Javot, Maurel, 2002], а также дегидринов и других белков - представителей большого семейства LEA (late embryogenesis abundant) белков, предохраняющих клеточные биополимеры от вызываемой водным стрессом денатурации и часто обладающих свойствами шаперонов [Close, 1996; Danyluk et al., 1998; Tabaei-Aghdaei et al., 2000; Xiong, Zhu, 2002].
Предполагается, что некоторые из них обладают ДНК- и РНК-связывающей активностью, благодаря наличию в их составе заряженных аминокислотных остатков, облегчающих связывание с нуклеиновыми кислотами [Garay-Arroyo et ah, 2000]. К LEA белкам можно отнести, например, ген ячменя HVA1, в норме экспрессирующийся в алейроновом слое в конце эмбриогенеза, но индукция экспрессии этого гена наблюдается и в вегетирующих растениях в ответ на обработку АБК, засуху, засоление, гипо- и гипертермию [Hong et al., 1992; Титов и др., 2003], что предполагает вовлечение белковых продуктов этого гена в развитии устойчивости к вышеупомянутым стресс-факторам. Подтверждением этому служит опыты с трансгенными растениями риса, экспрессирующими ген ячменя HVA1 и накапливающими этот белок в большом количестве, которые проявили повышенную устойчивость к водному дефициту и засолению, что отражалось в усилении скорости роста и задержке развития симптомов поражения, вызываемых данными стрессами, а также в ускорении нормализации ростовых процессов после удаления стресс-факторов [Xu et al., 1996]. В то же время, контроль ответных реакций растений на стресс гораздо более сложный, несмотря на выявляемые их сходства [Tabaei-Aghdaei et al., 2000]. Так, низкая температура вызывает в клетках индукцию синтеза антифризных белков, предохраняющих клетки растений в последующем, при понижении температуры ниже нулевой отметки, от возможного повреждения клеток кристаллами льда, а в митохондриях - белков, разобщающих окисление/фосфорилирование, что способствует подготовке клеток к действию отрицательных температур [Колесниченко и др., 2000; Боровский и др., 2002], а также регуляции образования АФК [Гималов и др., 2004]. Иммунологические свойства некоторых экстрацеллюлярных антифризных белков озимой ржи, а также анализ их аминокислотных последовательностей, выявили сходство этих белков с представителями PR (pathogenesis related) белков, а именно эндохитиназами, эндо-р-1,3-глюканазами и тауматин-подобным белком [Hon et al., 1995].
Постановка опытов
Для оценки стимулирующего действия АЗП на интенсивность деления клеток апикальной меристемы корней проростков пшеницы первоначально проведена работа по отбору наиболее эффективной концентрации лектина пшеницы. Для этого 3-суточные изолированные от эндосперма проростки инкубировали в течение 24 ч на растворах 0.1, 1.0, 10,0 мг/л АЗП, приготовленных на 2%-ной сахарозе. Контролем служили проростки, Ф инкубированные на 2%-ной сахарозе. О росте корней 4-суточных проростков судили по изменению митотического индекса (МИ) клеток меристематической ткани корней относительно контроля, АЗП во всех использованных концентрациях стимулировал МИ: на 40, 60-70 и 80% соответственно. В дальнейшей работе мы использовали АЗП в концентрации 1 мг/л. Такая же концентрация применялась и для других фитолектинов, ФГА и Кон А, а также глиадина, пшеничного белка, который мы использовали в качестве белка не лектина. 2.2.2. Постановка опытов при засолении С целью изучения защитного влияния АЗП на растения пшеницы при засолении использовали два варианта опытов: 1) 3-суточные проростки обрабатывали 1 мг/л раствором АЗП в течение 24 ч, после чего переносили на 7 ч в раствор 2%-ного NaCl в смеси с 2%-ной сахарозой, а затем после отмывки от соли помещали в раствор 2%-ной сахарозы на сутки; 2) 4-суточные проростки подвергали воздействию 2%-ного NaCl в смеси с 2%-ной сахарозой в течение 7 ч, а затем переносили в раствор АЗП (1 мг/л) на 24 ч. Для анализа влияния АЗП на ростовые процессы клеток корней ячменя при засолении 3-суточные проростки подвергали воздействию смеси 2%-ного NaCl и 2%-ной сахарозы в течение 7 ч, после чего проростки переносили на раствор АЗП на 24 ч. В опытах с растениями фасоли брали 6-суточные проростки, которые инкубировали в растворе АЗП в течение 24 ч. Контролем во всех опытах служили проростки, инкубированные на растворе 2%-ной сахарозы. Через определенные промежутки времени интактные проростки или отдельно их корни фиксировали для определения различных параметров.
В связи с тем, что АЗП является экскретируемым белком, нами определялось влияние 7-часового воздействия засоления на уровень АЗП в среде инкубирования проростков в течение суток. Постановка опытов при воздействии гипотермии С целью изучения защитного влияния АЗП на растения пшеницы при воздействии гипотермии также закладывали два варианта опытов: 1) 3-суточные проростки обрабатывали 1 мг/л раствором АЗП в течение 24 ч при температуре 21-23С, после чего 4-суточные растения переносили на 24 ч в раствор 2%-ной сахарозы в холодную камеру с фотопериодом 16 ч при температуре 7/5С. После 24 ч воздействия холодового стресса 5-суточные растения возвращали в нормальный температурный режим и выращивали еще 2-е сут. Контрольные проростки все время находились при температуре 21-23С. В ходе воздействия холода часть корней проростков пшеницы фиксировали в жидком азоте для определения содержания АЗП и АБК. 2) 4-суточные проростки подвергали воздействию гипотермии в течение 24 ч, после чего 5-суточные растения 24 ч выдерживали в растворе 1 мг/л АЗП, а затем 6-суточные проростки переносили в раствор 2%-ной сахарозы на 21-23С и выдерживали еще сутки. На 5-, 6- и 7-е сутки корни опытных и контрольных проростков пшеницы фиксировали для анализа ростовых показателей. Для оценки интенсивности экскреции АЗП в среду инкубирования проростков под влиянием низкой температуры в течение 24 ч от начала действии гипотермии и спустя сутки после стресса (21-23С) проводили отбор аликвот среды для определения АЗП. 2.3. Экстрагирование фитогормонов и лектина из одной растительной навески Количественную оценку свободных фитогормонов и лектина пшеницы в одной растительной навеске проводили с использованием метода иммуноферментного анализа (ИФА) [Хайруллин и др., 1993; Шакирова и др., 1994]. Для этого навеску корней из 10 проростков растирали в жидком азоте и экстрагировали фитогормоны 80%-ным этанолом в течение 16 ч при 4С. После центрифугирования при 15 000 g в течение 10 мин супернатант использовали для определения фитогормонов, а осадок — АЗП. Спиртовый экстракт упаривали в токе воздуха до водного остатка, в аликвоте которого определяли содержание цитокининов [Кудоярова и др., 1990]. Оставшийся водный остаток затем подщелачивали 2%-ным гидрокарбонатом натрия, экстрагируя нейтральные и основные соединения серным эфиром (2 : 1). Процедуру повторяли дважды. Эфирный экстракт отбрасывали, из водного раствора после подкисления 1 н НС1 ИУК и АБК дважды экстрагировали серным эфиром и метилировали диазометаном. После упаривания эфирного экстракта сухой остаток растворяли в 80%-ном этаноле, в аликвоте которого анализировали количество этих фитогормонов методом иммуноанализа [Ямалеев и др., 19Щ. Оставшийся после центрифугирования спиртового экстракта твердый растительный осадок заливали 50 мМ НС1 (1 : 5) и экстрагировали лектин в течение 1 ч при комнатной температуре. После центрифугирования при 15 000 g в течение 15 мин надосадочную жидкость, содержащую этот белок, нейтрализовали 1 М фосфатным буфером (рН 7.2-7.4) в соотношении 1:10 [Хайруллин и др., 1993] и вновь центрифугировали. Полученный супернатант использовали для количественного определения лектина методом ИФА. 2.3.1. Метод ИФА для оценки содержания лектина и фитогормонов Содержание лектина в растительных образцах определяли методом непрямого твердофазного конкурентного иммуноферментного анализа. Полистироловые планшеты ("Costar", США) сенсибилизировали АЗП ("Serva", ФРГ) в концентрации 0.5 мкг/мл в 10 мМ фосфатном буфере (рН7.2) при 37 С в течение 1,5 ч. Для удаления не связавшихся с полистиролом молекул белка, как и на всех последующих этапах, лунки трижды промывали фосфатно-солевым буфером (рН 6.0-7.0), содержащим 0.05% твин-20 (ФТ). В промытые лунки приливали ФТ, содержащий 0.5% желатины (ФТЖ) в качестве балластного белка, аликвоты растительных экстрактов или чистого препарата АЗП (1 мг/мл) в виде десятичных стандартных разведений, и анти-АЗП сыворотку, разведенную в ФТЖ. Смесь инкубировали при 37С в течение 1 ч.
После промывки проводили количественную оценку сорбированных на планшете анти-АЗП антител путем добавления в лунки разведенных в ФТЖ меченых пероксидазой антикроличьих антител (ИЭМ им. Н.Ф, Гамалеи, Москва). Планшеты выдерживали 1 ч при 37С, после промывки в лунки добавляли субстрат для оценки связавшейся со стенками лунок пероксидазной активности, содержащий ортофенилендиамин (ОФД) (0.05%), перекись водорода (0.016%) в 0.06 М фосфатном буфере (рН 5.8). Развитие окраски останавливали добавлением 4 н серной кислоты. Интенсивность хромофорного ответа определяли на приборе "Titertek Uniskan" ("Flow Laboratories", Англия) при 492 нм. Содержание лектина в экстрактах рассчитывали по калибровочной кривой оптической плотности стандартных растворов АЗП с использованием оригинальной компьютерной программы. Иммуноанализ свободных форм АБК, ИУК и суммарных форм цитокининов, иммунореактивных к сыворотке, полученной к зеатин-рибозиду, с использованием коньюгатов каждого из этих гормонов с человеческим сывороточным альбумином для сенсибилизации планшет и специфичных к фитогормонам кроличьих антител включал все этапы, указанные выше для оценки количества АЗП, согласно [Ямалеев и др., 1989; Кудоярова и др., 1990]. 2.4. Акцепторный метод определения генерации супероксид-аниона Генерацию 0{ определяли акцепторным методом по превращению адреналина в адренохром [Minibayeva at al, 2001]. Для этого контрольные и опытные образцы, каждый из которых состоял из 10 проростков, инкубировали в 10 мл раствора 0.025мМ СаС12 (рН 7.0) в качалке в течение 1 ч при 30С. Затем в бюксы вносили по 1 мл 10" М адреналина (рН 7.0), Раствор адреналина готовили следующим образом: 11 мг адреналина растворяли в 150 мкл 0.5 н НС1 и доводили до 10 мл дистиллированной водой, рН раствора доводили до 7.0 насыщенным раствором ЫаНСОз. Через 15-20 мин растворы из бюксов переносили в пробирки. Хромофорную реакцию останавливали внесением 150 мкл 0.05 н НО. Оптическую плотность растворов измеряли при 490 нм на фотоэлектрическом концентрационном колориметре (КФК-2МП, СССР). Холостая проба, которую принимали за ноль, содержала все компоненты реакции за исключением адреналина.
Метод определения митотической активности меристематических клеток и площади клеток в зоне растяжения корней
Митотическая активность — относительное число клеток, находящихся в состоянии митоза. Соотношение делящихся и общего числа клеток ткани можно выразить, используя митотический индекс (МИ), который выражается в процентах числа клеток в состоянии митоза на сто клеток ткани. МИ определяли в апикальной меристеме корней проростков пшеницы. Для этого кончики корня вместе с корневым чехликом длиной до 2 мм [Данилова и др., 1990] фиксировали в уксусной кислоте с этанолом (1 : 3) в течение 4 ч. После фиксации растительный материал отмывали дистиллированной водой и обрабатывали в течение 1 ч смесью 5%-ной пектиназы и 5%-ной целлюлазы при 37С. Временные давленые препараты окрашивали ацетокармином, приготовленным на 45%-ной уксусной кислоте, затем анализировали при 600-кратном (об. 40х, ок. 15х) увеличении и подсчитывали МИ клеток апикальной корневой меристемы согласно [Паушева, 1988]. Фазовые индексы (ФИ) определяли путем подсчета процента делящихся клеток, находящихся на стадиях профазы, метафазы, анафазы и телофазы клеточного цикла. Каждый вариант опыта содержал не менее 40 проростков, все анализы проводили приблизительно с 3000 клеток на Л вариант. Площадь клеток в зоне растяжения корней от 3 до 10 мм от кончика W корня [Данилова и др., 1990] рассчитывали на основании замеров их длины и ширины с помощью окуляр-микрометра МОВ-1х15 не менее чем в 500 клетках. Фиксация, мацерация и приготовление временных давленых препаратов для определения площади клеток в зоне растяжения проводились так же, как и для подсчета МИ. Относительную скорость роста (RGR; relative g rowth г ate) проростков за сутки рассчитывали по сырой массе согласно формуле: RGR = (W2 - W0 і \У,,где W[ - исходная масса, мг, " \г - конечная масса, мг. Каждый вариант опыта содержал не менее 50 растений. Все опыты проводили не менее чем в трех биологических повторах и четырех-пяти аналитических повторностях. В иллюстрациях представлены средние арифметические значения и ошибки средних. Статистическую обработку проводили с использованием компьютерной программы Statistica. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 3.1. Механизмы влияния АЗП на интенсивность ростовых процессов растений пшеницы Ранее в нашей лаборатории было выявлено, что обработка проростков пшеницы АЗП приводит к усилению роста клеток корней делением и растяжением [Безрукова и др., 2000; Авальбаев, 2001], что предполагает участие этого белка в регуляции ростовых процессов клеток. Однако обоснование этой функции лектина пшеницы требует знаний механизмов, лежащих в основе проявления ростстимулирующего действия.
Настоящая работа является логическим продолжением исследований, проводимых в нашей лаборатории к.б.н. М.В. Безруковой и к.б.н. A.M. Авальбаевым, по изучению механизмов влияния АЗП на рост клеток корней делением и растяжением в нормальных условиях произрастания и при воздействии стрессовых факторов. Как известно, интенсивность ростовых процессов растений находится под контролем гормональной системы. Исходя из этого, можно было предположить, что важной составляющей ростстимулирующего эффекта лектина пшеницы является его действие на состояние гормональной системы растений. Проверке этого предположения посвящен данный раздел работы. 3.1.1. Сравнительный анализ влияния разных фитолектинов на рост и гормональный статус проростков пшеницы Ранее были получены данные об участии различных фитогормонов, в том числе и активаторов роста растений, в стимуляции синтеза и накопления лектина пшеницы [Безрукова, Шакирова, 1999; Авальбаев и др., 2001; Shakirova et al., 2001; Шакирова и др., 2002]. Как известно, интенсивность ростовых процессов растений находится под контролем гормональной системы, поэтому важно было оценить влияние стимулирующего рост проростков пшеницы АЗП на количественный уровень разных групп фитогормонов. В связи с этим, мы провели сравнительный анализ влияния лектина пшеницы и других фитолектинов, обладающих четко выраженной митогенной активностью, ФГА и Кон А, на рост клеток и состояние гормональной системы в корнях проростков пшеницы. Из рис. 1 видно, что АЗП характеризуется ярко выраженным ростстимулирующим эффектом, тогда как ФГА и Кон А проявили по сравнению с АЗП слабое влияние на митотическую активность меристематических клеток и рост клеток корней проростков пшеницы растяжением (рис. 1). Так, МИ клеток апикальной меристемы корней через сутки воздействия 1 мг/л АЗП увеличился на 50%, в то время как для ФГА и Кон А, использованных в такой же концентрации, это значение составило чуть менее 15% (рис. 1а). АЗП стимулировал увеличение площади клеток в зоне растяжения клеток корней почти на 40%, главным образом, за счет элонгации, в то время как эффект ФГА и Кон А на рост клеток растяжением в данный период времени не был отмечен (рис. 16). В качестве альтернативного лектинам белка (не лектина) мы использовали запасной белок зерновок пшеницы глиадин в такой же концентрации 1 мг/л. Обработка проростков пшеницы в течение 24 ч не оказала никакого влияния на деление и растяжение клеток корней (рис. 1а и б). Поскольку АЗП проявляет стимулирующий эффект на рост клеток корней проростков пшеницы можно было ожидать его способность активно воздействовать на гормональный баланс в корнях. Действительно, предобработка проростков пшеницы АЗП вызывает существенные транзитные сдвиги в содержании всех трех групп исследуемых фитогормонов в корнях в сторону их накопления (рис. 2). Можно отметить, что более быстрые изменения наблюдаются в уровне АБК (рис. 2а). Уже через 1 ч воздействия АЗП наблюдалось более чем двукратное увеличение содержания АБК в корнях, после чего происходило резкое снижение ее уровня, так что к 4-м ч содержание этого гормона было ниже контрольного значения. АЗП уже через 1 ч вызывал также повышение содержания цитокининов (ЦК) в два раза, однако увеличенный в такой же мере уровень ЦК сохранялся вплоть до 5 ч инкубации проростков на лектине (рис. 26). Максимальное увеличение в уровне ИУК регистрировалось на 2-4 ч обработки АЗП, после чего концентрация этого гормона плавно снижалась до контроля (рис. 2в). Нужно заметить, что контрольные растения на протяжении всего опыта в целом характеризовались стабильностью показателей уровня всех исследуемых фитогормонов. Несмотря на то, что АЗП вызывал накопление АБК, которая в целом рассматривается в качестве ингибитора ростовых процессов, важным в проявлении ростстимулирующего действия АЗП является факт практически одновременного накопления гормонов - активаторов роста растений - ЦК и ИУК, что находит отражение в двукратном увеличении коэффициентов отношения ИУК и ЦК к АБК (рис. 3), наблюдаемом после 3-х ч от момента воздействия лектина, что, по-видимому, связано с резким кратковременным возрастанием концентрации АБК в первый час опыта и неуклонным ее снижением, даже относительно контроля, в последующие часы.
Механизмы защитного действия АЗП на растения пшеницы
Нарушение температурного режима относится к числу наиболее распространенных климатических факторов среды, оказывающих повреждающее действие на растительный организм. Нужно заметить, изменение температурного режима приводит не только к нарушению водного обмена в растениях, но оказывает прямое воздействие на скорость протекания важнейших физиолого-биохимических процессов [Реагсе, 1999]. Ранее в нашей лаборатории было показано участие АЗП в развитии защитных реакций каллус ных клеток пшеницы на гипертермию [Shakirova et al., 1996]. Вместе с тем, сведениями о количественных изменениях в уровне АЗП в растениях пшеницы в ответ на воздействие низкой положительной температуры мы не располагали, хотя следует подчеркнуть, что в литературе имеются данные об активации гемагглютинирующей активности лектина в растениях пшеницы в условиях низких положительных и отрицательных температур [Тимофеева и др., 1999; Комарова и др., 1999], что указывает на принципиальную возможность участия лектинов пшеницы в формировании защитных реакций к холодовому стрессу. Мы исследовали динамику содержания АЗП в проростках пшеницы под влиянием гипотермии. В связи с тем, что к числу характерных реакций растений в ответ на разнообразные стрессовые воздействия относится накопление АБК, мы в этих же проростках провели анализ количественных изменений в уровне этого стрессового гормона. Гипотермия индуцирует быстрое транзитное накопление АБК в проростках пшеницы: через 2 ч действия низкой температуры содержание АБК возрастало более чем в 2 раза (рис. 13 а). В последующем наблюдалось постепенное снижение концентрации АБК в корнях проростков, так что к 7 ч стрессового воздействия ее уровень достигал значения контроля. Так как АЗП является индуцируемым АБК белком [Mansfield, Raikhel, 1990; Skriver, Mundy, 1990], то не удивительно, что вслед за изменениями в уровне АБК мы наблюдали транзитное увеличение содержания АЗП с максимумом, приходящегося на пять часов, что соответствовало почти трехкратному превышению уровня белка по сравнению с контролем (рис. 136). В последующие часы уровень лектина пшеницы в опытных растениях постепенно снижался.
При анализе характера транзитного накопления АЗП в корнях проростков пшеницы, вызванного осмотическим стрессом, было высказано предположение о том, что уменьшение содержания эндогенного лектина в растениях пшеницы после стресс-индуцированного накопления, по крайней мере, частично, вызвано высвобождением АЗП в среду [Cammue et al., 1989]. Кроме того, существуют данные о принципиальной способности АЗП секретироваться из растений пшеницы в окружающую среду в ходе онтогенеза в обычных условиях произрастания [Mishkind et al., 1980]. Это побудило нас к проведению специальных опытов по оценке содержания АЗП в среде инкубации проростков, подвергнутых низкотемпературному стрессу. Результаты этих опытов показали, что холодовой стресс в течение 7 ч приводил к трехкратному увеличению выхода АЗП в среду выдерживания проростков (рис. 14). В последующие часы воздействия стресса выделение лектина в окружающую среду снижалось, и к 24 опыта (последующие 17 ч) содержание лектина в среде составляло уже только 170% от контроля. Дальнейшее наблюдение в течение суток (до 48 ч опыта) за динамикой уровня АЗП в среде выдерживания в нормальных (21-23С) условиях произрастания выявило довольно незначительное дополнительное выделение лектина в среду, которое превышало контрольное значение лишь на 25% (рис. 14), Вместе с тем, это вполне закономерно, поскольку, как видно из рис. 136, максимальное накопление лектина в корнях проростков наблюдалось к 5 ч воздействия гипотермии, после чего происходило постепенное снижение его уровня в растениях, несмотря на продолжающееся действие стресса. Полученные результаты убедительно демонстрируют факт экскреции АЗП из проростков в окружающую среду, что, по-видимому, может играть важную роль для растений пшеницы. Не исключено, что выход лектина в среду при стрессе может иметь значение не только для защиты ослабленных стрессом растений пшеницы от почвенной инфекции, но, возможно, и оказывать защитный эффект на ростовые процессы клеток корней, в частности на митотическую активность клеток апикальной меристемы, поскольку известно, что именно меристематические ткани относятся к числу основных мест синтеза и аккумуляции АЗП [Mishkind et al., 1982; Raikhel et al., 1984; Stinissen et al., 1985; Cammue et al., 1989]. Причем следует заметить, что в случае интенсивной экскреции АЗП из проростков наружу, преимущественно в окружающую меристематические ткани среду, он, по-видимому, становится экзогенным агентом для растения. В литературе имеются данные о подавлении роста растений при снижении температуры [Equiza et al., 1997; Granier et al., 2000], причем в большей мере подавляется рост побегов по сравнению с корнями [Equiza et al., 1997]. В связи с тем, что нами выявлен факт участия АЗП в стимуляции роста клеток корней проростков пшеницы делением и растяжением, встает вопрос, может ли АЗП оказывать защитный эффект на ростовые процессы корней растений в условиях гипотермии. Для ответа на этот вопрос нами были предприняты опыты по оценке влияния обработки проростков 1 мг/л АЗП в течение 24 ч до стресса и в пост-стрессовый период. Воздействие низкой температуры в течение 24 ч приводило к существенному торможению интенсивности ростовых процессов клеток корней. Так, МИ клеток апикальной меристемы корней пшеницы снижался более чем в 1.5 раза по сравнению с контролем, а площадь клеток в зоне растяжения - почти в 1.5 раза (рис. 15 и 16). Анализ ростовых параметров корней спустя 24 ч после стресса выявил улучшение этих показателей, однако они оставались на уровне значительно меньшем, чем в контроле. Предобработка проростков в течение 24 ч АЗП не предотвращала вызванное последующим воздействием холодового стресса торможение ростовых процессов клеток корней, что демонстрирует сравнение этих результатов с данными по росту проростков, обработанных АЗП, но не подвергнутых стрессу. Однако следует подчеркнуть, что предобработка АЗП способствовала поддержанию интенсивности роста клеток корней проростков делением и растяжением при гипотермии на уровне контрольного варианта (рис. 15).
В пользу протекторного действия АЗП на ростовые процессы растений пшеницы при стрессе указывают также результаты опытов по обработке АЗП проростков в пост-стрессовый период. Перенос 5-суточных проростков пшеницы, переживших в течение суток воздействие гипотермии, на 24 ч на раствор АЗП ускорял репарацию ростовых процессов клеток корней (рис. 16). Обработка АЗП способствовала восстановлению митотической активности меристематических клеток корней проростков пшеницы до контрольного уровня уже через сутки, а через двое - МИ этих растений превышал контрольное значение (рис. 16а). Мы проанализировали также площадь клеток в зоне растяжения корней обработанных и не обработанных АЗП проростков, предварительно подвергнутых гипотермии. Как видно (рис. 166), обработка лектином оказывала явный репарирующий эффект и на рост клеток растяжением, хотя и не с такой скоростью, как при росте клеток делением. Полученные нами результаты убедительно демонстрируют защитный эффект АЗП на ростовые процессы клеток корней проростков пшеницы. Обнаруженное ростстимулирующее свойство лектина пшеницы проявляется не только в стимуляции роста клеток делением и растяжением нормальных условиях. Экзогенный АЗП предотвращает резкое стресс-индуцированое ингибирование роста клеток корней и способствует ускорению его репарации в пост-стрессовый период, 3.2.2. Влияние АЗП на рост и гормональный статус растений при засолении Хлоридное засоление сопровождается не только осмотическим эффектом, но и токсическим воздействием избыточного содержания ионов Na+ и СГ на клеточный метаболизм [Кузнецов, Шевякова, 1999; Jia et ah, 2002], а также нарушением баланса Na+/K+. Действительно, при засолении в растениях уменьшается концентрация К+ [Welfare et ah, 1996; Tsugane et ah, 1999; Babourina et ah, 2000], a Na+ и СГ - увеличивается [Удовенко, 1977; Welfare et ah, 1996; Yu, Rengel, 1999; Munns, 2002; Rogers et ah, 2003; Halperin, Lynch, 2003; Cavalcanti et al., 2004]. Особенно сильно ионный дисбаланс проявляется у неустойчивых сортов растений
