Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Современная концепция взаимоотношений в системе «растение – патоген» (обзор литературы)
1.1. Молекулярные основы формирования устойчивости растений к патогенам
1.2. Роль активных форм кислорода и окислительных ферментов в развитии совместимых/несовместимых взаимоотношений растения-хозяина и патогена
1.3. Реакция сверхчувствительности и ее значение 24
1.4. Системная устойчивость растений 26
1.5. Особенности роста и развития фитопатогенных грибов в растениях 28
ГЛАВА 2. Материалы и методы 36
2.1. Объекты исследований 36
2.2. Выращивание растений 36
2.3. Выделение патогенных грибов, инфицирование и учет пораженности растений
2.4. Способы применения защитных соединений 38
2.5. Микроскопические исследования 40
2.6. Биохимические методы исследований 42
2.6.1. Выделение белковых фракций и оценка активности ферментов 42
2.6.2. Измерение концентрации Н2О2 43
2.6.3. Определение содержания белка 43
2.7. Молекулярные методы исследований 44
2.7.1.Выделение ДНК и РНК 44
2.7.2. ОТ-ПЦР на основе матричной РНК 45
2.7.3. Проведение полимеразной цепной реакции 45
2.7.4. Использование олигонуклеотидных праймеров 46
2.7.5. Электрофоретическое фракционирование ДНК 46
2.7.6. Компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей 47
2.8. Статистическая обработка результатов 47
ГЛАВА 3. Рузультаты и обсуждение 48
3.1. Взаимоотношения в патосистеме «Triticum aestivum - Тilletia 48
caries»
3.1.1. Анализ морфологических и физиологических свойств возбудителя твердой головни пшеницы Т. caries из различных агробиоценозов
3.1.2. Влияние СК и ЖК на развитие T. caries и формирование защитного ответа у пшеницы
3.1.3. Защитное действие биопрепаратов на развитие возбудителя твердой головни пшеницы в зависимости от инфекционной нагрузки
3.2. Взаимоотношения в патосистеме «Triticum aestivum – Bipolaris sorokiniana»
3.2.1. Влияние условий культивирования на рост и развитие B. sorokiniana
3.2.2. Влияние генотипа растения-хозяина на морфофизиологические параметры B. sorokiniana
3.2.3. Сравнительное изучение влияния СК и ЖК на устойчивость пшеницы к B. sorokiniana
3.3. Взаимоотношения в патосистеме «Solanum tuberosum Phytophthora infestans»
3.3.1. Анализ агрессивных свойств изолятов Ph. infestans 84
3.3.2. Влияние СК и ЖК на устойчивость каллусов и клубней картофеля к Ph. infestans
3.4. Влияние биопрепаратов на защитный потенциал и устойчивость 95
растений картофеля к фитофторозу
Заключение 100
Выводы 102
Список литературы 104
- Роль активных форм кислорода и окислительных ферментов в развитии совместимых/несовместимых взаимоотношений растения-хозяина и патогена
- Выделение патогенных грибов, инфицирование и учет пораженности растений
- Анализ морфологических и физиологических свойств возбудителя твердой головни пшеницы Т. caries из различных агробиоценозов
- Взаимоотношения в патосистеме «Solanum tuberosum Phytophthora infestans»
Роль активных форм кислорода и окислительных ферментов в развитии совместимых/несовместимых взаимоотношений растения-хозяина и патогена
Одной из наиболее ранних ответных реакций растений на воздействие патогенов является генерация АФК (Brosch et al., 2010; Suzuki et al., 2012). К АФК относятся супероксидный (О2) и гидрооксильный (ОН) радикалы, оксид азота (NO), перекись водорода (Н2О2) (Neill, et al., 2003; Зоров и др., 2005; Красиленко и др., 2010). Следуют учитывать, что АФК образуются в растениях и при нормальных условиях, однако, на низком уровне, главным образом, в хлоропластах, митохондриях и пероксисомах. Они регулируют процессы полярного роста, активность закрывания устьиц, светоиндуцированное движение хлоропластов (Mullineaux et al., 2006; Колупаев и др., 2010; Swanson, Gilroy, 2010).
Внимание к изученинию роли АФК в регуляции клеточных процессов значительно возросло в связи с установлением их участия в передаче стрессовых сигналов в растительных клетках (Suzuki, Mittler, 2006; Креславский и др., 2012). Так, например, активация редокс-системы плазмалеммы и образование АФК в апопласте является одной из универсальных реакций растительных клеток на инфицирование патогенами (Минибаева, Гордон, 2003; Minibayeva et al., 2009; Li et al., 2010). АФК можно рассматривать в качестве важнейших молекул, вовлеченных в передачу внутриклеточных сигналов, регулирующих экспрессию генов и активность защитных систем (Desikan et al., 2001; Apel, Hirt, 2004; Galvez-Valdivieso et al., 2010).
Участие АФК в формировании защитного ответа растений к патогенам многогранно. Они оказывают прямое антимикробное действие (Bolwell et al., 2002), укрепляют барьерные свойства клеточных стенок посредством полимеризации фенольных соединений (Gara et al., 2003; Miguel, 2010), являются вторичными мессенджерами в супероксидсинтазной сигнальной системе и запуске СВЧ-реакции (Максимов, Черепанова, 2006; Колупаев, 2007). Кроме того, АФК выступают в роли сигнальных интермедиатов при формировании приобретенной системной устойчивости к патогенам, участвуют в активации генов ферментов, причастных к синтезу фитоалексинов (Дмитриев, Кравчук, 2005).
Повышение уровня Н2О2 вызывает увеличение концентрации в цитозоле ионов кальция, выполняющего важную роль в процессах передачи сигнальной информации в геном растений (Pei et al., 2000; Galvez-Valdivieso et al., 2010). Показано, что Н2О2 принимает участие в активации экспрессии генов стрессовых белков (Wahid et al., 2007, Pfannschmidt et al., 2009), индуцировании антиоксидантных ферментов (Gadjev et al., 2006; Hu et al., 2007), усилении накопления пролина (Колупаев, Вайнер, 2013).
Показано, что обработка растений экзогенной Н2О2 индуцирует экспрессию хлоропластных и ядерных генов, связанных с защитными реакциями растений на стрессовые воздействия (Bechtold et al., 2008; Foyer, Noctor, 2009; Galvez-Valdivieso, Mullineaux, 2010). Также обнаружена способность Н2О2 активировать работу генов, кодирующих аскорбатпероксидазу, глутатионпероксидазу, каталазу, МАП-киназы и фосфатазы (Mullineaux et al., 2000; Потехина, Надеждина, 2002; Herbette et al., 2003; Bailey, Mittler, 2006; Swanson, Gilroy, 2010).
Таким образом, окислительная взрыв и генерация АФК при контакте растения и патогена является отправной точкой в цепи передачи сигналов, которая запускает работу других механизмов защиты (Vranova et al., 2002 Zurbriggen et al., 2010). Однако, несмотря на огромное количество публикаций, посвященных участию АФК в регуляции защитных реакций растений при инфицировании, характер ответа в отдельных патосистемах, с учетом трофности патогенов, исследован не достаточно.
Основными источниками АФК в ходе окислительного взрыва в растительных клетках являются ферментативные системы, локализованные в плазмалемме и клеточной стенке: НАДФН-оксидаза (Дмитриев, 2003), ксантиноксидаза (Аверьянов, Лапикова, 2007), оксалатоксидаза (Vuletich, Sukalovich, 2000), пероксидаза (Minibayeva et al., 2003; Bolwell et al., 2009). Поддержание концентрации уже образовавшихся в клетке АФК на достаточном уровне возможно также за счет снижения активности антиоксидантных ферментов (Скулачев, 1998; Bolwell et al., 1999). Первой реакцией в патоген-индуцированной оксидативной вспышке является появление O2-, основным источником образования которого является окисление молекулярного кислорода НАДФН-оксидазой (Тарчевский, 2002).
НАДФН-оксидаза плазмалеммы представляет собой гетеродимерный цитохром, состоящий из двух субъединиц массой 22 кДа и 91 кДа. У субъединицы 91 кДа имеется двa Са2+-связывающих участка. Для активации фермента требуется участие еще двух цитоплазматических белков (47 кДа и 67 кДа.). При действии патогенов или элиситоров, первый из этих двух белков фосфорилируется, затем они мигрируют к плазмалемме и образуют активный комплекс с ферментом. В активации НАДФН-оксидазы участвуют тaкже G-белки, активирующие, в свою очередь, фосфолипазу C. Таким образом, активность НАДФН-оксидаз регулируется взаимодействием с кaльциевой сигнaльной системой (Mittler, 2002).
Супероксидный радикал образуется при взаимодействии молекул кислорода c НАДФН-оксидазной системой, а также при восстановлении флавинов, хинонов, тиолов, например, в процессах, катализируемой флавин-содержащим ферментом ксантиноксидазой. Радикал O2-выполняет роль пускового механизма в каскаде реакций образования АФК. При высоких концентрациях O2- спонтанной дисмутации с образованием перекиси водорода и молекулярного кислорода. Эта реакция катализируется ферментом супероксиддисмутазой, локализованной в цитозоле, хлоропластах и митохондриях (Swanson, Gilroy, 2010).
Супероксиддисмутаза – широко распространенный в природе фермент. Он обязательно присутствует у всех аэробных организмов, а также найден у некоторых анаэробных бактерий. В нормальных условиях произрастания растений, поддерживается баланс между продукцией радикалов O2– и их своевременным удалением. При действии неблагоприятных факторов увеличивается образование АФК, в том числе и O2– (Kaminska-Roїek, Pukacki, 2004). Активность СОД при этом изменяется разнонаправленно; в одних случаях она увеличивается, в других – снижается, что зависит от интенсивности и длительности воздействия стрессового фактора (Rizhsky et al., 2003; Бараненко, 2006). Причем, устойчивые формы растений по сравнению с восприимчивыми характеризуются более высокими активностями СОД и менее выраженными окислительными повреждениями. Однако при достижении определенного уровня окислительного стресса происходит снижение активности СОД. Это объясняется тем, что образующаяся при дисмутации супероксидного радикала перекись водорода оказывает ингибирующее действие на фермент. Снижение активности фермента при неблагоприятных воздействиях способствует дальнейшему увеличению продукции АФК и развитию окислительных повреждений клеток и тканей растений (Jiang, Huang, 2001). Поэтому эффективное функционирование СОД в значительной степени определяется функционированием других компонентов системы защиты, в частности тех, которые утилизируют перекись водорода (каталаз, пероксидаз, ферментов аскорбат-глютатионного цикла).
Выделение патогенных грибов, инфицирование и учет пораженности растений
Важнейшим биологическим значением СВЧ-реакции является индукция защитного ответа в местах, удаленных от места внедрения патогена, путем распространения сигнальных молекул через плазмодесмы, апопласт, ксилему по всему растению и даже за его пределы, посредством летучих сигнальных молекул, таких как метилжасмонат (Kazan Manners, 2008). В результате трансдукции сигналов происходит развитие системной устойчивости растений.
Выделяют две формы индуцированной устойчивости растений: системная приобретенная устойчивость (systemic acquired resistance – SAR) и индуцированная системная устойчивость (induced systemic resistance – ISR) (Vallad, Goodman, 2004; Chanda et al., 2011; Luna et al., 2012). Считается, что развитие SAR происходит при контакте растения с биотрофным патогеном, приводящей в экспрессии защитных генов с участием салициловой кислоты и ее производных (Тарчевский и др., 2002; Glazebrook, 2005). Действие же некротрофных патогенов, организмов-фитофагов приводит к усиленному биосинтезу жасмоновой кислоты и этилена, которые также регулируют экспрессию защитных генов и развитие ISR (Durrant, Dong, 2004). Однако это разделение весьма условно, поскольку биохимические механизмы индукции различных типов системной устойчивости до конца не изучены. За последние годы получен экспериментальный материал, свидетельствуюший о сложном взаимодействии индукторов салицилатного и жасмонатного сигналинга, а также других возможных путях трансдукции стрессовых сигналов. Например, показано, что в индукции системной устойчивости могут участвовать глицеролипиды (Chaturvedi et al., 2008), азелаиновая кислота (Jung et al., 2009) и глицерол-3-фосфат (Chanda et al., 2011).
Салициловая кислота синтезируется в растительной клетке
несколькими путями. Основной путь синтеза СК – фенилпропаноидный, однако, существует альтернативный путь ее синтеза в хлоропластах из шикимовой кислоты (Rastogi, Dwivedi, 2008). Транспортной формой СК по растению является метилсалицилат (Park et al., 2007). Салициловая кислота, накапливаясь в большом количестве в месте инфицирования, связывается с рецептором NPR3 (non expressor of pr genes 3) с низкой аффинностью и запускает деградацию супрессора клеточной смерти NPR1 (Fu et al., 2012), приводя к развитию СВЧ– реакции. В растительных клетках, окружающих место инфицирования, СК накапливается в низких концентрациях и связывается с высоко-аффинным рецептором NPR4, что предотвращает деградацию NPR1. Данный белок при транслокации в ядро действует в качестве транскрипционного коактиватора большого набора защитных генов, в частности гена PR-1, который используют в качестве маркера СК-индуцируемых генов (Шакирова, 2001; Moore et al., 2011).
Жасмоновая кислота (ЖК) и ее производные являются соединениями липидного происхождения. Биосинтез ЖАК начинается с выхода -линоленовой кислоты из мембранных липидов. После синтеза ЖК превращается в метилжасмонат с помощью карбоксилметилтрансферазы жасмоновой кислоты или конъюгирует с аминокислотами, что приводит к образованию жасмонил-изолейцина (Fonseca et al., 2009). Считается, что жасмонатный сигналинг связан с развитием устойчивости растений к некротрофным патогенам, поранению и защитой против насекомых (Pieterse et al., 2012).
Долгое время считалось, что СК- и ЖК-опосредованные пути сигналинга, оказывают антагонистический эффект друг на друга. Так, например, показано, что СК супрессирует ЖК-зависимые реакции на поранение растений томата (Koorneef et al., 2008). Антагонизм между СК и ЖК выявлен и на других видов растений (Mur et al., 2006). Однако, имеются данные о том, что обработка низкими концентрациями ЖАК и СК Arabidopsis приводит к синергичному эффекту на экспрессию ЖАК- и СК-зависимых генов, а при более высоких концентрациях эффекты становятся антагонистичными (Mur et al., 2006; Fu et al., 2012).
В природе растения одновременно атакуются множеством патогенов с разными типами питания, поэтому взаимосвязи различных сигнальных путей позволяют растительному организму в полной мере реализовать свой защитный потенциал.
По типу питания микроорганизмы, как известно, разделяют на сапрофитов, некротрофов и биотрофов. Первые извлекают питательные вещества из мертвых тканей, вторые и третьи – из живых (Дьяков и др., 2012). Однако некротрофы, прежде чем оккупировать участок какой-либо ткани растения, убивают клетки своими токсичными выделениями (Пороховинова, Лутова, 2000), а биотрофы извлекают питательные вещества непосредственно из живых клеток. Существуют переходные формы между некротрофами и биотрофами – гемибиотрофы, которые имеют смешанное питание (Glazebrook, 2005).
Возбудитель твердой головни гриб Tilletia caries (DC) Tul. (синоним - Tilletia tritici (Bjerk) Wint.) относится к типичным патогенам с биотрофным типом питания (Кривченко, 1984; Степановских, 1990). Жизненный цикл биотрофов устроен так, что гибель инфицированного растения, до формирования репродуктивных структур патогена "нежелательна", гриб используют хозяина для своего жизнеобеспечения (Аксенова и др., 1989). Головневые грибы имеют различные пути внедрения в растительный организм: через почки, зародыш, лист, побеги и генеративные органы (Каратыгин, 1981). T. caries проникает в растение главным образом через колеоптиле. Проростки наиболее восприимчивы в течение 1 - 8 сут после прорастания зерновок, в дальнейшем, на 10-12 сут, они приобретают устойчивость к инфекции (Borgen, 2003). Поражение растений головней наносит значительный урон урожайности и качеству зерна. Споровая масса гриба заполняет содержимое зерна и имеет общую с ним форму. При разрушении оболочки обнажается черно-коричневая масса телиоспор с характерным селедочным запахом триметиламина (Азбукина, Каратыгин, 1996). Благоприятным фактором для инфицирования возбудителем твердой головни пшеницы является низкая температура. Оптимальной для заражения Tilletia caries является температура 5-8 (Баталова, 1989).
Инфицирование пшеницы возбудителем твердой головни происходит во время обмолота зерна, когда головневые мешочки разрушаются и телиоспоры попадают на поверхность семян. Примерно 1,5 – 2 месяца гриб развивается вместе с побегом под апикальной меристемой и к концу этого периода мицелий достигает точки роста побега. Этот период развития гриба (до начала налива зерна) проходит без симптомов заражения, выявить патоген можно только при цитологическом анализе срезов растений.
Во время дифференциации колоса мицелий возбудителя твердой головни проникает во все части цветков, разрушает зародыши и продуцирует хламидоспоры. В конце фазы молочной спелости в пораженном колосе вместо зерен образуются сорусы гриба – так называемые «головневые мешочки», то есть в зернах вместо зародыша и эндосперма развивается темная масса спор. Споровая масса имеет специфический «селедочный» запах триметиламина (Каратыгин, 1981).
Анализ морфологических и физиологических свойств возбудителя твердой головни пшеницы Т. caries из различных агробиоценозов
В обработанных СК и ЖК неинфицированных и инфицированных проростках активность каталазы определялась ниже контрольного варианта на всем протяжении опыта. Причем, ингибирующее действие СК на активность каталазы было выше, чем у ЖК, особенно в инфицированных проростках пшеницы. Вероятно, что СК, ингибируя каталазу, способствует накоплению Н2О2. (Kawano et al., 2003).
Число факторов патогена, приводящих к нейтрализации защитных реакций растения-хозяина, огромно и на сегодняшний момент мы знаем о них, к сожалению, не так много. В частности обнаружено, что каталазы, быстро инактивирующие Н2О2, активно вырабатываются патогеном в инфекционный период (Zhang et al., 2004; Белозерская, Гесслер, 2007; Максимов и др., 2009; Mhamdi et al., 2010). Благодаря этому грибы способны успешно преодолевать высокие концентрации Н2О2, генерируемые растительными клетками для защиты, и успешно развиваться в растениях. Причем, низкая концентрация Н2О2 в зоне инфицирования индуцирует каталазы патогенных грибов (Goodwin et al., 2001; Гесслер и др., 2007). Можно предположить, что в негативную регуляцию уровня H2O2 вовлекаются молекулярные компоненты гриба.
Таким образом, результаты наших наблюдений показали, что СК и ЖК повышают устойчивость пшеницы к T. caries через регуляцию активности ферментов про-/антиоксидантной системы, таких как оксалатоксидаза, пероксидаза, каталаза, и накопление Н2О2. При всех примененных способах обработки растений испытываемыми соединениями наблюдалось их влияние на эктофитное развитие возбудителя болезни опосредованно через растение. Оно выразилось в нарушении проникающей способности патогена. Известно, что применение средств защиты растений на ранних стадиях развития фитопатогенов имеет ряд преимуществ. Прежде всего, вредоносность болезни предотвращается уже на самой ранней стадии поражения, то есть до того, как мицелий начнет разрушать растительные клетки.
.Защитное действие биопрепаратов на развитие возбудителя твердой головни пшеницы в зависимости от инфекционной нагрузки
Степень устойчивости/восприимчивости сельскохозяйственных растений к возбудителям грибных болезней и, в конечном счете, продуктивность культур, определяется не только генотипическими и фенотипическими параметрами самого растительного организма, но, и в значительной степени, зависит от условий возделывания культурных растений, в т.ч. от воздействия комплекса биотических и абиотических факторов.
Как известно, в современных агротехнологиях широко используются химические средства защиты растений, подавляющие рост и развитие патогенных микроорганизмов. Однако интенсивное применение пестицидов приводит, с одной стороны, к химическому загрязнению экосистем и, соответственно, ухудшению качества продукции растениеводства, и с другой - к обеднению видового состава сообществ микроорганизмов, и появлению новых, более агрессивных и устойчивых к пестицидам форм патогенов. В связи с этим, возможность использования биологических препаратов для защиты растений приобретают особую актуальность.
Одним из направлений экологически безопасной защиты растений является использование в качестве основы биопрепаратов эндофитных штаммов бактерий, например, вида Bacillus subtilis (Bakker et al., 2007; Van der Lelie et al., 2009). Так препарат Фитоспорин-М, содержит споры и клетки бактерией B. subtilis 26Д, а также гуматы и микроэлементы, обладает фунгицидным и иммунизирующим действиями.
Весьма важные в практическом отношении сведения можно получить при изучении зависимости параметров продуктивности растений от интенсивности факторов патогенности (инфекционной нагрузки) и от использования средств защиты растений.
Было изучено защитное действие биопрепаратов против возбудителя твердой головни пшеницы в зависимости от инфекционной нагрузки на семена. В качестве контроля были взяты посевы пшеницы без искусственной инокуляции семян спорами возбудителя (естественный фон).
Как видно из таблицы 6, степень пораженности растений в контроле составляла от 0 до 76 %, а в условиях опытов она варьировала от 0 до 71 %, в зависимости от начальной инфекционной нагрузки на семена и используемого препарата. Причем, в условиях низкой инфекционной нагрузки (0,01 г/кг) различий в степени пораженности между контролем и опытными растениями не наблюдается. Достоверные различия появляются только при повышении инфекционной нагрузки на семена до 0,2 г/кг.
Взаимоотношения в патосистеме «Solanum tuberosum Phytophthora infestans»
Известно, что медиаторы сигнальных систем – стрессовые фитогормоны салициловая и жасмоновая кислоты играют ключевую роль в индуцировании НАДФН-оксидазной и липоксигеназной сигнальных систем растений, причем в процессе функционирования этих сигнальных систем образуются очень активные антипатогенные кислородсодержащие соединения – оксилипины, перекись водорода, пероксинитрид, способные подавлять развитие патогенов (Halim et al., 2007; Hardham, Shan, 2009; Makandar et al., 2010). Повышение устойчивости к биотическим стрессорам под влиянием СК и ЖК определяется также укреплением клеточной стенки: их лигнификацией, синтезом каллозы, образованием сшивок между белками (Robert-Seilaniantz et al., 2011). Эти вещества сами, не обладая антимикробной активностью, стимулируют защитные реакции клеток растений посредством активации синтеза ряда связанных с патогенезом белков, в том числе ингибиторов протеолитических ферментов (Mandal et al., 2006). Поскольку и СК и ЖК положительно влияют на устойчивость растений к возбудителям заболеваний и способствуют повышению их продуктивности, эти соединения находят достаточно широкое применение в сельскохозяйственной практике (Исаев и др., 2004; Mihir et al., 2006). В то же время, механизмы формирования защитного ответа под воздействием СК и ЖК в различных патосистемах зависят от характеристик обоих партнеров. Подобные исследования являются важными и для патосистемы картофель – возбудитель фитофтороза, учитывая широкое распространение этого заболевания в России.
Удобными моделями для изучения механизмов развития защитного ответа Solanum tuberosum к Ph. infestans под воздействием сигнальных молекул являются каллусы картофеля, на которых можно наблюдать развитие гриба на экто- и эндофитных стадиях развития, а также диски, вырезанные из клубней картофеля (Озерецковская и др., 2009).
Наблюдения за ростом возбудителя фитофтороза на каллусах картофеля восприимчивого сорта Луговской позволили установить, что через 24 ч после инокуляции гифы Ph. infestans представляли собой тонкие, ветвящиеся, умеренно окрашенные метиленовым синим нити. Некоторые гифы были утолщены и интенсивно окрашены (рисунок 17).
В вышеуказанный срок опыта глубина проникновения гриба в каллусы составляла около трети их диаметра (таблица 15). Через 48 ч глубина проникновения гриба в каллусы составляла уже половину от их диаметра . Гифы патогена обильно росли на каллусной ткани, при этом большинство из них были утолщены и интенсивно окрашены в сравнении с предыдущим сроком фиксации (рисунок 17). Таблица 15. Влияние СК и ЖК на рост Ph. infestans в каллусах картофеля сорта Луговской
Культивирование каллусов на средах, содержащих СК и ЖК, через 24 ч после инокуляции тормозило рост грибов (рисунок 17, таблица 15) . Однако через 48 ч различий в скорости роста патогена между контрольным и опытными вариантами не наблюдалось (рисунок 17, таблица 15).
На каллусах устойчивого сорта картофеля гриб развивался медленнее, чем на каллусах восприимчивого сорта (рисунок 18). Внесение СК и ЖК в среду культивирования каллусов тормозило рост Ph. infestans. Различия в скорости роста патогена между контролем и опытными вариантами сохранялись на протяжении 72 ч (рисунок 18).
Микроскопические наблюдения показали, что инфицирование клубней картофеля возбудителем фитофтороза приводило к появлению в клубнях погибших в результате инфицирования некротических клеток (рисунок 19).
Рисунок 19. Разитие некротической реакции на клубнях картофеля различной устойчивости, обработке СК и ЖК и последующего инфицирования возбудителем фитофтороза Ph. infestans. 48 ч после инокуляции. а- сорт Луговской, б – сорт Невский; в – обработка СК; г – обработка ЖК. Результаты подсчета показали, что через 48 ч после инокуляции в клубнях восприимчивого сорта Луговской их было 24.6+1.1%, в клубнях устойчивого сорта Невский – 9.8+0.9 %, а в клубнях восприимчивого сорта, предобработанных СК и ЖК, только 17.2+0.7 и 16.3+0.8 %, соответственно. Таким образом, СК и ЖК оказывали защитное действие на каллусы и клубни картофеля против Ph infestans, снижая степень некротизации растительных тканей.
Основным орудием нападения патогенов являются продуцируемые ими гидролитические ферменты, разрушающие клеточные стенки растений и обеспечиваяющие внедрение гриба в ткани (Schluter et al., 2010). Ответная защитная реакция растений сопровождается синтезом ингибиторов этих ферментов (Валуева, Мосолов, 2002; Ma et al., 2011).
Исследования показали, что уровень транскрипционной активности гена ингибитора протеиназы в клубнях картофеля достоверно возрастал по сравнению с контролем через 48 ч после инфицирования (рисунок 20).
Транскрипционная активность гена ингибитора протеиназы в клубнях картофеля сорта Луговской при обработке СК и ЖК и инфицировании Ph infestans.
Образование ингибиторов протеаз происходит в растении в ответ на инфицирование некротрофными патогенами и насекомыми - вредителями. Ключевую роль в инициации защитной реакции играет мембранный рецептор системин, белок с молекулярной массой около 160 кДа. Реагируя на поранение, он вызывает деполяризацию мембраны, что приводит к открытию ионных каналов и резкому повышению уровня внутриклеточного содержания ионов кальция. В результате активируются МАР-киназы и фосфолипазы, и в ходе ряда реакций образуется жасмоновая кислота, которая, вероятно, и служит активатором транскрипции генов защитных белков (Ryan, 2000).
Таким образом, проведенные исследования на каллусах и клубнях картофеля свидетельствуют о том, что при всех примененных способах обработки, СК и ЖК оказывают влияние на развитие Ph infestans на эктофитной и эндофитной стадиях развития. Оно выражалось в изменении морфологии мицелия патогенного гриба и снижении его проникающей способности в ткани картофеля. Защитное действие было ЖК обусловлено высоким стимулирующим действием на транскрипционную активность гена ингибитора протеиназы картофеля.
