Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 10
1.1. Рецепторный потенциал у животных и растений 10
1.2. Механизмы импульсной биоэлектрической активности у высших растений 16
1.3. Биоэлектрогенез и адаптация 30
Глава 2. Объект и методы исследования 39
2.1. Объект исследования 39
2.2. Методы исследования 39
2.2.1. Внеклеточная регистрация биоэлектрических реакций 39
2.2.2. Внутриклеточная регистрация биоэлектрических реакций 42
2.2.3. Дозированное охлаждение и регистрация изменения температуры 43
2.2.4. Изучение местных биоэлектрических реакций на периодическое охлаждение 44
2.2.5. Изучение способности корней генерировать потенциал действия в ответ на охлаждение 44
2.2.6. Изучение аккомодационных свойств поверхностных клеток стебля... 45
2.3. Статистическая обработка результатов 46
Глава 3. Рецепция охлаждения клетками высшего растения 47
3.1. Характер электрофизиологического ответа клеток стебля проростка тыквы на постепенное охлаждение 47
3.2. Сравнительный анализ чувствительности клеток стебля и корня при охлаждении 53
Глава 4. Сенсорная адаптация клеток стебля проростка тыквы к периодическому охлаждению 60
4.1. Сенсорная адаптация клеток стебля при периодическом охлаждении с различными интервалами времени между стимулами 60
4.2. Зависимость характера сенсорной адаптации клеток стебля от интенсивности периодического охлаждения 82
Глава 5. Аккомодационные свойства клеток стебля высшего растения 90
5.1. Изучение аккомодационных свойств клеток стебля проростков тыквы 90
5.2. Изучение электрофизиологического ответа на охлаждение с различными скоростями после распространения по стеблю потенциала действия 94
Заключение 97
Выводы 100
Список литературы 102
- Механизмы импульсной биоэлектрической активности у высших растений
- Внеклеточная регистрация биоэлектрических реакций
- Характер электрофизиологического ответа клеток стебля проростка тыквы на постепенное охлаждение
- Сенсорная адаптация клеток стебля при периодическом охлаждении с различными интервалами времени между стимулами
Введение к работе
Актуальность проблемы. В настоящее время у высших растений установлены и достаточно хорошо изучены разные виды электрической активности. Однако, вопрос о том, какую роль играют биоэлектрические потенциалы в растительном организме, остается во многом дискуссионным.
Очень важным представляется возможное участие биоэлектрических реакций (БЭР) в рецепции раздражения клетками высших растений. Этот вопрос исследован крайне слабо, хотя у так называемых двигательных растений электрофизиологическим способом точно установлен этап рецепции механического стимула и возникновение рецепторного потенциала (РП), приводящего затем к генерации потенциала действия (ПД) (Jackobson, 1965; Williams, Pickard, 1972). У высших нелокомоторных растений отсутствуют такие высокоспециализированные рецепторные образования, какие имеются у животных (например, механорецепторы, световые рецепторы). Восприятие внешнего раздражения у них осуществляется, по-видимому, при участии клеточных мембран, в первую очередь, плазматических мембран эпидер-мальных клеток. Молекулярные механизмы такого восприятия пока неясны, но можно полагать, что они связаны с изменением состояния как липидного матрикса мембраны, так и включенных в нее белковых систем (Opritov, Pyatygin, 1989).
В электрофизиологии растений термин "рецепторний потенциал" применяют, как правило, при изучении механорецепции у высших растений и харовых водорослей. В этом случае РП — небольшая, временная деполяризация, возникающая в ответ на механический стимул. РП носит градуальный характер, то есть его амплитуда зависит от силы стимула. Когда РП достигает порогового значения, возникает ПД (Shimmen, 2001). Рецепция других стимулов (химических и температурных) практически не изучена. В ряде ра бот отмечается тот факт, что достижение порога возбуждения при охлаждении клеток высшего растения связано с инактивацией протонного насоса (Опритов и др., 1984; Pyatygin et al., 1992). Это приводит к входу ионов Са в клетку, затем к активации Са -зависимых СГ-каналов, при участии которых формируется фаза деполяризации ПД. Таким образом, у высших растений механизмы подпороговых изменений Ет отличаются от механизмов генерации ПД. Для животных объектов показано, что механизмы генерации РП и ПД различны.
У животных объектов установлено, что РП обладают следующими свойствами:
1) Градуальный характер РП: его амплитуда зависит от величины стимула;
2) При достижении порогового значения РП генерируется ПД. Если РП вызывает генерацию ПД непосредственно в рецепторной клетке, его иногда называют генераторным.
Рецепторные клетки также обладают рядом свойств:
1) Высокая чувствительность к определенному раздражителю;
2) Способность к значительному усилению сигнала. Энергия электрического сигнала, возникающего в результате трансдукции, намного больше энергии внешнего стимула;
3) Высокая избирательность по отношению к стимулам определенной модальности, то есть рецепторные клетки определенного типа реагируют только на адекватные стимулы;
4) Возбудимые структуры рецепторных клеток обладают способностью к аккомодации, то есть достижение порога возбуждения зависит от скорости нарастания стимула;
5) Способность к сенсорной адаптации, то есть изменение реакции в результате повторной стимуляции.
Могут ли клетки (в первую очередь эпидермальные) высших растений, не обладающих локомоторными функциями, иметь свойства рецепторных клеток и генерировать в ответ на внешний стимул местные БЭР с признаками РП, остается неясным. Рассмотрение этого вопроса представляется важным для раскрытия механизмов взаимодействия растения со средой и доказательства универсальности процессов рецепции на клеточном уровне у высших растений и животных.
Цель и основные задачи исследования. Целью настоящей работы было комплексное электрофизиологическое исследование роли биоэлектрических потенциалов в рецепции охлаждения клетками проростков тыквы.
Были поставлены следующие задачи: 1) изучение способности генерировать ПД в ответ на охлаждение различных органов растения, 2) изучение аккомодационных свойств порога возбуждения при охлаждении с различными градиентами, 3) изучение сенсорной адаптации, при действии периодического охлаждения, 4) влияние распространяющихся ПД на параметры БЭР возбудимых клеток в связи с процессом рецепции.
Научная новизна. Получены новые данные, свидетельствующие о том, что эпидермальные клетки стебля генерируют ПД в ответ на охлаждение и могут передавать возбуждение электротонически, в радиальном направлении электровозбудимым пучковым клеткам в глубине стебля. Холодочувстви-тельность клеток стебля может быть очень высокой. ПД возникает при перепаде температур всего 1,3 °С.
Показано, что пороговый перепад температур, необходимый для генерации ПД корнями, намного больше, чем для клеток стебля и равен 15 С. Возникающий ПД распространяется акропетально в стебель и регистрируется на расстоянии 5 см от корневой шейки.
Порог возбуждения поверхностных клеток стебля в зоне постепенного охлаждения обладает способностью к аккомодации. При увеличении скорости охлаждения пороговый перепад температур, необходимый для генерации ПД (ЛТ„ор) уменьшается, что связано со снижением порога возбуждения.
Возбудимые структуры клеток стебля проявляют способность к сенсорной адаптации, как по типу привыкания, так и сенситизации уже при 15-минутном интервале между стимулами. Увеличение интенсивности воздействия (глубины охлаждения) приводит к преобладанию эффекта сенситизации.
Научно-практическое значение. Полученные данные важны для выяснения роли БЭР в рецепции охлаждения у высших растений. Было показано, что возбудимые клетки высших растений обладают рядом свойств, присущих рецепторным клеткам животных объектов; высокая чувствительность к определенному раздражителю (охлаждению), способность к значительному усилению сигнала, способность к аккомодации порога возбуждения и сенсорной адаптации. Это говорит о сходстве процессов рецепции внепших факторов у животных и растительных объектов, что способствует развитию представлений об эволюции процессов рецепции у различных типов возбудимых систем. Основные положения диссертации, выносимые на защиту.
1. Клетки корня проростков тыквы (Cucurbita реро L.) могут генерировать ПД в ответ на охлаждение. Этот ПД способен распространяться акропетально вдоль стебля.
2. Эпидермальные клетки стебля генерируют ПД при действии локального постепенного охлаждения и передают возбуждение электротониче-ски электровозбудимым пучковым клеткам вглубь стебля.
3. Возбудимые структуры клеток стебля способны к аккомодации при рецепции в зоне охлаждения, то есть достижение порога возбуждения зависит от скорости нарастания стимула.
4. Характер сенсорной адаптации (габитуация и сенситизация) клеток стебля зависит не только от интервала между стимулами, но от физиологического состояния растительного организма и интенсивности воздействия. При увеличении силы воздействия (глубины охлаждения) проявляется сенсорная адаптация по типу сенситизации, то есть происходит первоначальное увеличение максимальной скорости реполяриза-ции и уменьшение длительности местной БЭР, что можно связать с активацией ІҐ-АТФазьі, так как данные параметры косвенно характеризуют активность протонного насоса. Апробация работы. Основные результаты работы были представлены на V Пущинской конференции молодых ученых. (Пущино, 2001), International symposium "Signaling Systems of Plants Cells" (Moscow, 2001), Годичном собрании Всероссийского общества физиологов растений "Экспериментальная биология растений" (Уфа, 2001); Международной конференции "Актуальные вопросы экологической физиологии растений в 21 веке" (Сыктывкар, 2001); IV и V Международных симпозиумах "Новые и нетрадиционные растения и перспективы их использования" (Москва, 2001, 2003); Международной конференции "Регуляция роста, развития и продуктивности растений" (Минск, 2001); Всероссийской научно-практической конференции "Физиология растений и экология на рубеже веков" (Ярославль, 2003); V съезде Общества физиологов растений России (Пенза, 2003).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано и направлено в печать 13 работ.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, 5 глав (включая обзор литературы), заключения, выводов и списка литературы. Изложена на 120 страницах, содержит 23 рисунка и 3 таблицы. Список цитируемой литературы включает 185 работ, из них 109 на иностранных языках.
Механизмы импульсной биоэлектрической активности у высших растений
В биофизике возбудимых систем общепринятым является представление об ионных каналах в мембране, образованных макромолекулами специальных белков. При возбуждении происходит изменение проводимости мембраны для некоторых ионов в результате скачкообразных конформационных переходов отдельных каналов между открытым и закрытым состоянием (Schauf, 1987). Для аксолеммы считается доказанным, что эти «воротные» процессы могут управляться непосредственно электрическим полем на мембране (Хилле, 1981).
Интерпретация механизмов электрогенеза в возбудимых растительных клетках харовых водорослей, доступных для изучения методом фиксации напряжения, также проводится на основе существующих представлений о по-тенциалзависимых (управляемых электрическим полем) и хемоактивируемых (открываемых какими-либо молекулами) ионных каналах (Берестовский и ДР., 1979).
Основу мембранной теории возбуждения составляет электрохимическая модель Ходжкина-Хаксли, доказавшая, что кинетика изменения мембранного потенциала аксона кальмара при ПД может быть объяснена сравнительно простыми изменениями ионной проницаемости мембран (Hodgkin, Huxley, 1952). Впоследствии теория Ходжкина-Хаксли при незначительных дополнениях была успешно перенесена и на клетки харовых водорослей (Bieby, Coster, 1980).
Большинство экспериментальных данных, характеризующих процесс возбуждения в клетках харовых водорослей, укладывается в схему, предложенную Берестовским с соавторами (1979). При деполяризации мембран ни-же порогового уровня происходит активация электрическим полем Са -каналов. Ионы Са , входя в клетку, возбуждают хлорные каналы плазма-леммы и тонопласта. В итоге формируется суммарный фронт ПД. Таким образом, согласно этой схеме, фазу деполяризации ПД обеспечивают возбудимые потенциалзависимые Са2+-каналы и возбудимые Са2+-активируемые СГ-каналы (Жерелова и др., 1987; Kourie, 1994; Johannes et al., 1998; Drinyaev et al., 2001; Raven, 2001; Tazawa, Shimmen, 2001; Tazawa, Kikuyama, 2003).
Что касается фазы реполяризации ПД у харофитов, то она, очевидно, обеспечивается нетто-потоком ионов К+ через калиевые каналы, которые функционируют и в покое, но, вероятно, активируются при возбуждении (Соколик, 1982; Pottosin, Andjus, 1994; Thiel et al, 1997).
Необходимо отметить, что существенно отличается от описанного выше ионный механизм «метаболического» ПД у водоросли Acetabularia. Фаза деполяризации у нее формируется при выключении С1-помпы и, наоборот, фаза реполяризации ПД происходит при включении этого насоса (Рогатых и др., 1976; Gradman et al., 1973; Gradmann, 1976; Trebacz, 1989).
Что касается ионных механизмов генерации ПД у высших растений, то они изучены значительно меньше. Это объясняется сложностью организации возбудимых тканей, малыми размерами возбудимых клеток и рядом других особенностей.
Необходимо отметить, что электрическая стимуляция - стандартный раздражитель в электрофизиологии животных, очень редко используется в исследованиях на высших растениях, так как сопротивление покровных тканей многих растений очень велико благодаря сильно развитой кутикуле (Ку-релла, 1986).
Генерация ПД в возбудимых клетках высших растений осуществляется, можно полагать, в основном, как и у харофитов, пассивными нетто-потоками трех ионов: входящего в клетки нетто-потока Са (деполяризующего входящего тока), выходящего нетто-потока СГ (деполяризующего входящего тока) и выходящего нетто-потока К+ (реполяризующего выходящего тока) (Опри-тов и др., 1991; Trebacz et al., 1989,1994).
Однако, существующее превышение величины потока К+ над потоками Са и О позволяет предполагать участие других ионов в компенсации заряда переносимого при генерации ПД ионами К+ (Опритов, Ретивин, 1982). Hope, Findlay установили, что вместе с ионами СГ во время ПД у водоросли Chara australis также выходят из клетки ионы Ж)з (Hope, Findlay, 1964; Ii-jima, Sibaoka, 1985). На основании косвенных данных по ионному балансу в растительных клетках (замыкающих клетках устьиц) можно предположить участие в генерации ПД органических анионов малата.
На сегодняшний день полная картина процесса генерации ПД у высших растений такова. Например, под влиянием постепенного охлаждения (это, очевидно, наиболее удачный способ адекватного раздражения клеток высших растений) происходят структурные изменения в липидах мембран (Pyatygin et al., 1992; Murata, Los, 1997). Это, в свою очередь, приводит к уменьшению активности электрогенной помпы (Н -АТФазы), что обеспечивает изменение Ещ до порогового уровня возбуждения (Pyatygin et al., 1992).
При пороговой деполяризации происходит открывание возбудимых по-тенциалзависимых кальциевых каналов (Thuleau et al., 1994; Ward et al., 1995; White, Ridout, 1999; White, 2000). Ионы Ca2+ входят в клетку и активируют возбудимые Са -зависимые хлорные каналы (Huang et al., 1994; Trebacz et al., 1994; Lewis et al., 1997; Elzenga et al., 1997). Так же показано наличие в ПМ высших растений потенциал зависимых анионных каналов, проницаемых и для других анионов. Предполагается, что они участвуют в распространении ПД (Zimmerman et al., 1994; Thomine et al., 1995, 1997; Frachisse et al., 1999). -активация вызывает резкое увеличение (примерно в 300 раз) хлорной проницаемости клеточных мембран и приводит к возникновению нетто-потока СГ из клеток (Ретивин, 1988). Этот поток (если он превышает однонаправленный поток катионов) формирует фазу деполяризации ПД. Поскольку направление градиента электрохимического потенциала для ионов К+ внутрь клеток определяется их высоким Ет, то снижение Ет должно приводить к пассивному увеличению выходящего потока ионов К+ (Опритов и др., 1983). Результаты последних лет свидетельствуют, что потенциал зависимые К -каналы активируются при деполяризации мембраны (Thiel et al., 1992; Ketchum, Slayman, 1996; Maathuis et al, 1997;Wegner, De Boer, 1997; Rodriguez-Navarro, 2000; Suh et al., 2000; Majore et al., 2002).
Внеклеточная регистрация биоэлектрических реакций
Такая опережающая адаптивная перестройка получила название «преда-даптация» (Ретивин и др., 1997). Следует указать, что различия между состоянием стресса у клеток растения, непосредственно испытавших внешнее воздействие, и состоянием с повышенной неспецифической устойчивостью, вызванным ПД и названным предадаптацией, нельзя считать существенными. В стрессе клетка может пребывать от нескольких часов до нескольких дней, в состоянии предадаптации — десятки минут, но механизмы этих феноменов во многом должны быть сходны (Ретивин и др., 19996).
Показано, что ПД у растений могут временно повышать устойчивость их клеток к неблагоприятным внешним факторам, то есть являться одним из наиболее ранних (экстренных) механизмов, участвующих в формировании генерализованного адаптационного синдрома. При этом благодаря способности ПД распространяться по растению, устойчивость могут приобретать не только те части стебля растения, которые подверглись внешнему воздействию и где произошла начальная генерация ПД, но и те ткани и органы, которые этому воздействию не подвергались, но по которым прошел ПД (Рети-вин, Опритов, 1993; Ретивин и др., 1997).
Ретивин и др. (19996) показали, что ПД стебля играет роль первичного дистанционного сигнала, запускающего функциональные изменения в фото-синтезирующих клетках мезофилла семядолей, приводящие к повышению их холодо- и теплоустойчивости.
В настоящее время на основании известных в литературе фактов можно выделить несколько механизмов защитного эффекта, вызываемого ПД. Выход К+ из растительной клетки при стрессах - ключевое звено ее неспецифической защитной реакции, направленной, главным образом, на торможение процесса повреждения (Мелехов, Анев, 1992). Ионы К+, как показано в главе 1, выходят из клетки и при генерации ПД.
Важной представляется роль сдвигов в содержании Ca , поскольку он является фактором, способным непосредственно влиять на устойчивость клеток, и может эффективно транспортироваться через ПМ и по симпласту растительных тканей (Ретивин и др., 19996; Reddy, 2001).
Известно, что ионы Са , транспортируя» в клетку, а также высвобождаясь из внутриклеточных компартментов, выполняют роль внутриклеточного мессенджера, активируя протеинкиназы, оказывая влияние на ионные каналы, усиливая секреторную активность (Шишова и др., 1999; Trewavas, 1999). Minorsky (1989) отметил, что холодовой шок вызывает активацию Са2+-кальмодулин-чувствительных фосфолипаз в Tetrahymena. Активация этих липаз может быть вовлечена в быструю перестройку мембраны, сделав ее приспособленной для новой окружающей среды.
Однако еще более длительные метаболические изменения (уровень АТФ в клетке, АТФазная активность, включая ІҐ-АТФазу ПМ, сдвиги рН), составляющие «метаболический шлейф» ПД в проводящих тканях стебля, несомненно, также могут оказывать прямое и косвенное влияние на устойчивость к действию различных стресс-факторов не только клеток проводящих тканей стебля и других осевых органов (например, листового черешка), где ПД распространяются, но и клеток тех тканей и органов, которых ПД достигает или приближаются к ним достаточно близко (лист, корень) (Ретивин и др., 19996).
Особенностью предадаптации является то, что она, как это можно заранее предположить, носит неспецифический характер. Эта неспецифичность проявляется двояко. Во-первых, повышение устойчивости ткани происходит под влиянием ПД, вызванным не только охлаждением, но и другими факторами, например, действием на корневую систему проростков тыквы 1М раствором КО. ПД при этом распространяется акропетально, достигает семядольных листьев и вызывает повышение их устойчивости, которое можно зарегистрировать по характеру изменения замедленной люминесценции. Во-вторых, ПД, вызванные одним и тем же раздражителем, могут индуцировать повышение устойчивости тканей к действию разных стресс-факторов. Например было показано, что ПД вызывает повышение устойчивости семядольных листьев проростков тыквы, как к охлаждению, так и нагреванию (Ретивин и др., 1997; Опритов, 1998).
Одной из форм повышения устойчивости животных объектов к действию внешних факторов является аккомодация, то есть зависимость величины порога возбуждения от скорости нарастающего воздействия. Рядом авторов была установлена способность к аккомодации возбудимых структур высших растений при действии таких раздражителей как постепенное охлаждение и электрический стимул. Определены константы аккомодации для тыквы - 0,2-2,1 мин. и люпина - 1,0-1,2 мин. (Zawadzki, Dziubinska, 1979; Пятыгин, Опритов, 1982). Вследствие «ухода» от ответа на медленно нарастающий во времени природный фактор возбудимые структуры растений, вероятно, сохраняют возможность реагирования на действие других раздражителей, биологическое значение которых велико. Тем самым осуществляется одна из форм приспособления растительного организма к изменению условий внешней среды (Пятыгин, Опритов, 1982).
Итак, для локомоторных растений и водорослей было показано, что местные БЭР, обладающие признаками РП носят градуальный характер, то есть зависят от силы стимула. При достижении определенного порогового потенциала происходит генерация ПД. Механизмы генерации РП и ПД отличаются, что было продемонстрировано при помощи ингибиторного анализа. Генерация ПД является необходимым звеном в рецепции раздражения высшими растениями. ПД выполняет сигнальную роль, которая заключается в передаче информации о внешнем воздействии от одной части растения к другой. Достигнув определенного органа, ПД переводит его в кратковременное состояние повышенной устойчивости, названное предадаптацией. Таким образом, при участии ПД происходит процесс адаптации растения к неблагоприятным факторам среды.
До сих пор остается неясным, какие клетки стебля высших растений, не обладающих локомоторными функциями, можно считать рецепторными по отношению к охлаждению и могут ли местные БЭР клеток высшего растения в ответ на внешний стимул исполнять роль РП. Нет данных о способности к аккомодации порога возбуждения клеток стебля в зоне воздействия при их постепенном охлаждении.
Характер электрофизиологического ответа клеток стебля проростка тыквы на постепенное охлаждение
Введение микроэлектрода осуществляли с помощью механического микроманипулятора комплекта КМ-2 под углом 30 к плоскости объекта, при визуальном контроле через микроскоп типа Биолам. Для освещения объекта использовали стандартный осветитель от микроскопа МБС-9. В качестве усилителя использовали иономер универсальный ЭВ-74. Регистрацию вели при помощи персонального компьютера, на который поступал сигнал с платы АЦП. Применяемая компьютерная программа позволяла регистрировать быстрые изменения Ещ при генерации ПД.
Осуществляли одновременную запись изменений мембранного потенциала одной эпидермальной клетки стебля при внутриклеточном отведении и изменений разности потенциалов между участком стебля и корнями внеклеточным отведением при постепенном охлаждении поверхностных клеток стебля.
В качестве физиологически умеренного раздражителя, вызывающего генерацию ПД, применяли постепенное охлаждение участка стебля помещенного в кювету, от 20-23 до 8-10 С со скоростью 1,5-3,5 С/мин. Охлаждение производили при помощи термоохлаждающего столика. Скорость охлаждения задавали, изменяя напряжение, подаваемое через трансформатор на термостолик. Восстановление исходной температуры осуществляли при смене полярности тока, подаваемого на термостолик. Изменение температуры в микрообъеме кюветы регистрировали миниатюрным термистором из комплекта медицинского термометра ТПЭМ-60М, который подключали через уравновешенный мост Витстона к иономеру универсальному ЭВ-74 и самопишущему потенциометру КСП-4. Шкалу потенциометра и сигнал с АЦП предварительно калибровали в градусах Цельсия.
При изучении местных БЭР в ответ на периодическое охлаждение клеток стебля раздражитель наносился с интервалами 15, 30 мин и 1 час. В зоне охлаждения регистрировали местные ответы, для характеристики которых использовали следующие параметры: температурный порог местного ответа, который определялся как разница между исходной температурой и температурой, при которой начиналась генерация ПД; длительность местного ответа, выраженная в секундах и максимальная скорость реполяризации, измеренная в мВ/с. Температурный порог характеризует холодочувствительность систем биоэлектрогенеза, а длительность местного биоэлектрического ответа и максимальная скорость реполяризации определяют время восстановления этих систем.
Для исследования зависимости характера сенсорной адаптации от интенсивности раздражителя, охлаждали клетки стебля проростков тыквы с глубиной 6 и 12 С, изменяя таким образом силу воздействия. Интервалы между стимулами были 30 мин.
Корни помещали в кювету, расположенную на поверхности термостолика, где находился первый измерительный электрод, второй измерительный электрод помещали на стебель на расстоянии 5 см от корневой шейки. Электроды сравнения контактировали с листом на значительном удалении от корневой системы (5см). Корневая шейка находилась вне зоны охлаждения. Применяли глубокое охлаждение клеток корня от 15-18 С до 0-2 С. Чтобы вызвать генерацию ПД в конце охлаждения в кювету приливали ледяную воду.
Биоэлектрическую реакцию регистрировали при помощи неполяризую-щихся хлорсеребряных макроэлектродов на двухканальной электрофизиологической установке. Электроды контактировали с эпидермальной тканью стебля. В качестве физиологически умеренного раздражителя использовали постепенное охлаждение участка стебля в кювете в диапазоне от 27 С до 17 С со скоростями от 1,9 до 3,3 С/мин. Охлаждение прекращали после формирования ПД. Интервалы между стимулами были более одного часа, что превышает период рефрактерности как для генерации ПД, так и для его проведения (Ретивин и др., 1988). Измеряли пороговый перепад температур (АТпор), необходимый для генерации местного ПД, то есть разность между исходной (Тисх) и пороговой (Тпор) температурами.
Проводили изучение электрофизиологического ответа на охлаждение с различными скоростями после распространения по стеблю ПД. Эксперимент вели одновременно на двух растениях на двухканальной электрофизиологической установке. У одного из них вызывали акропетально распространяющийся по гипокотилю ПД путем воздействия струей холодной воды (5-9 С) в течении 5-10 с на участок стебля (1см) возле корневой шейки. Сразу после прохождения ПД производили глубокое охлаждение участка стебля (2 см) возле семядольных листьев опытного (после распространения ПД) и контрольного растений от исходной температуры (19 С) до 0 С.
Опыты проводили не менее чем в 5-кратных повторностях. Экспериментальные данные обрабатывали при помощи методов вариационной статистики (Лакин, 1973; Тейлор, 1985). В работе производили определение средних значений (М) измеряемых величин и стандартных отклонений среднего (или стандартных ошибок) (т) и оценку достоверности разницы между средними арифметическими двух выборочных совокупностей по t - критерию Стью-дента.
Помимо статистически обработанных данных в работе представлены типичные кривые изменения биоэлектрической активности клеток при внутри- и внеклеточной регистрации.
Сенсорная адаптация клеток стебля при периодическом охлаждении с различными интервалами времени между стимулами
Амплитуда внутриклеточно зарегистрированного ПД эпидермальной клетки (122 мв) не меньше таковой у электровозбудимых клеток проводящих пучков. Эпидермальные клетки, кабельная постоянная которых очень мала, не проводят активно ПД в радиальном направлении, а непосредственно генерируют его в ответ на прямое холодовое раздражение и передают только в одном направлении вглубь стебля к пучковым клеткам.
Микроэлектродные исследования показали, что по отношению к охлаждению именно эпидермальные клетки стебля могут играть роль рецепторных. Они проявляют такие сенсорные свойства как (1) высокая чувствительность к охлаждению, (2) способность к значительному усилению холодового сигнала, причем не только в форме рецепторного электрического ответа, но и путем его преобразования в ПД, и, наконец, (3) способность к однонаправленной передаче сигнала из зоны рецепции в зону проведения.
Для сравнительной оценки рецепторных свойств клеток стебля важно определить температурный порог возникновения ПД на охлаждение в клетках других органов исследуемого растения, в частности, в корнях. В литературе данные о способности клеток корней генерировать ПД в огвег на охлаждение фактически отсутствуют. Более того, некоторые авторы полагают, что покровные клетки корня, отделенные от возбудимых пучковых клеток изолирующим слоем эндодермы, скорее всего, не обладают способностью генерировать ПД (Мамулашвили и др., 1972).
Известную высокую эффективность раздражения корней раствором 1 М KCl, вызывающего распространяющийся в стебле ПД, можно объяснить его повреждающим- действием как плазмолитика, распространяющимся по ксилеме гидравлическим ударом или рецепцией раздражения не клетками корпя, а корневой шейки, то есть уже стебля. Таким образом, рецепторные и генераторные свойства клеток корня важно исследовать с помощью уже апробированного на других тканях холодового-раздражения.
На рис. 4 и 5 представлены биоэлектрические ответы клеток корня на охлаждение корневой системы. Регистрировали местные БЭР с амплитудой AUo=40 мВ (рис. 4). Удалось зарегистрировать импульсную реакцию по типу ПД в корне и распространяющийся ПД в стебле на расстоянии 5 см от корневой шейки (рис. 5). Пороговый перепад температур, необходимый для генерации распространяющегося ПД, для клеток корня был равен примерно 15 С.
Распространение волны возбуждения можно было зарегистрировать только после пребывания проростка тыквы на термостолике в течение длительного времени в неподвижном состоянии. Очевидно, что при извлечении проростков тыквы из субстрата мы оказываем значительное повреждающее действие на корневую систему. Трудности в инициации распространяющейся БЭР локальным охлаждением клеток корня, по-видимому, связаны с его анатомическим строением. Проводящие пучки расположены в толще коровой паренхимы, поэтому их возбудимые клетки, по мнению Мамулашвили и др. (1972); адаптируются к медленно меняющимся условиям. Тем не менее, как видно из рис. 4 и 5, охлаждение с большим градиентом или охлаждение до низких температур позволяют зарегистрировать местные ответы, а шюгда распространяющиеся ПД .
Гунар и Паничкин (1969) вызывали раздражение корней подсолнечника быстрой (5 с) сменой питательного раствора при температуре 20 С раствором, нагретым до 30, 40, 60 и 70 еС. Деполяризация участка стебля, находившегося в 4 см от корня, наступала через 1 мин после возвращения шегося в 4 см от корня, наступала через 1 мин после возвращения корней в исходные условия (20 С). Был сделан вывод, что появление распространяющейся ЮР в стебле подсолнечника связано не с действием нагретого раствора, а с возвращением корней в исходный раствор.
Эти результаты косвенно подтверждают полученные нами данные. Можно предположить, что возвращение корней в условия температуры 20 С действует как быстрое охлаждение и вызывает генерацию БЭР в стебле.
Спорным остается вопрос, имеет ли генерация ПД при охлаждении клеток корня значение в природе. В природных условиях воздействию пониженных температур в первую очередь подвергается надземная часть растения. Все приспособительные изменения, которые могли быть вызваны ПД, пришедшим из корней, уже наступили при прямом действии температурного фактора на стебель. Корневая система располагается в почве в условиях относительно постоянной температуры и для нее большее значение имеет химическое раздражение.
Холодочувствительность клеток стебля значительно выше. Нам удалось зарегистрировать генерацию ПД в стебле при перепаде температур всего на 1,3 С (рис. 6). Ранее была показана возможность генерации ПД у высших растений, не обладающих специализированной локомоторной активностью, под влиянием очень незначительного внешнего воздействия - локального охлаждения стебля на 1-2 С от исходной температуры (Опритов и др., 1982).
Таким образом, наши результаты позволяют предположить, что эпидер-мальные клетки стебля высшего нелокомоторного растения могут выполнять роль рецепторных в отношении постепенного охлаждения- Они обладают рядом свойств, характерных для рецепторных клеток животных. Местная БЭР, которую эти клетки генерируют в ответ на охлаждение, может быть охарактеризована как РП.
