Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 7
1.1 Общая характеристика биоэлектрогенеза клеток высшего растения 7
1.1.1 Потенциал покоя 7
1.1.2 Местные биоэлектрические реакции на действие внешних факторов 10
1.1.3 Потенциалы действия 19
1.1.4 Вариабельный потенциал 25
1.2 Рецепторно-эффекторные связи в живых системах 28
1.2.1 Рецепция стимула 31
1.2.2 Сигнальная функция потенциалов действия 36
1.2.3 Эффекторные ответы 37
2. Материалы и методы исследования 40
2.1 Объект исследований 40
2.2 Регистрация биоэлектрических реакций 40
2.3 Нанесение раздражения 42
2.4 Анализ зависимости амплитуды биоэлектрической реакции в зоне раздражения от интенсивности воздействия 43
2.5 Периодическое воздействие охлаждением 44
2.6 Изучение потенциалов действия 45
2.7 Измерение уровня АТФ во флоэмном эксудате после распространения потенциала действия и вариабельного потенциала 46
2.8 Исследование модификации холодо- и термоустойчивости проростков, индуцированной потенциалами действия 48
2.9 Компьютерная и статистическая обработка результатов 51
3. Результаты и их обсуждение 53
3.1 Электрофизиологическое изучение рецепции растений 53
3.1.1 Анализ записей биоэлектрических реакций растения на различные виды воздействий 53
3.1.2 Зависимость амплитуды биоэлектрической реакции в зоне раздражения от интенсивности внешнего воздействия 56
3.1.3 Исследование связи между биоэлектрическими реакциями в зоне раздражения и распространением потенциалов действия 64
3.1.4 Изучение пластичности биоэлектрических реакций в зоне раздражения 69
3.2 Особенности передачи сигнала с помощью импульсных биоэлектрических реакций 84
3.2.1 Электрофизиологический анализ потенциалов действия 84
3.2.2 Уровень АТФ во флоэмном эксудате стебля после генерации потенциала действия и вариабельного потенциала 92
3.3 Индукция функционального ответа распространяющимися импульсными реакциями 99
Заключение 112
- Рецепторно-эффекторные связи в живых системах
- Регистрация биоэлектрических реакций
- Компьютерная и статистическая обработка результатов
- Особенности передачи сигнала с помощью импульсных биоэлектрических реакций
Введение к работе
Существование любого организма в постоянно меняющейся среде невозможно без способности целесообразно отвечать на внешние и внутренние воздействия. Цепь событий, связывающую начальный стимул и конечный ответ на него, можно представить следующим образом: рецепция стимула —> передача сигнала —> физиологический ответ.
В этой универсальной схеме, действующей и на клеточном, и на организменном уровне, могут участвовать различные механизмы и системы. Как известно, у животных на организменном уровне главную управляющую роль осуществляет нервная система. В основе ее функционирования лежат такие электрофизиологические феномены, как формирование под действием внешнего раздражителя рецепторных потенциалов в специализированных сенсорных клетках, возникновение и передача сигналов в виде нервных импульсов (ПД) и конечные ответы клеток (или целых органов) - эффекторов. Рецепторно-эффекторные связи в нервной системе, как правило, не являются статичными -эффективность передачи сигналов может сильно варьироваться благодаря наличию у нейронов такого фундаментального свойства, как пластичность.
У растений не вызывает сомнений существование достаточно медленной химической сигнализации. В литературе описано множество экспериментов, где, воздействуя каким-либо стрессором на одну зону растения, на удалении от нее исследователи наблюдали определенные физиологические ответы. Причем временной интервал от момента воздействия до развития регистрируемых реакций в ряде случаев составлял всего несколько минут, что подразумевает наличие у растений дальнодействующих сигналов, распространяющихся гораздо быстрее химических (Кудоярова и др., 1990; Malone, 1996; Полевой и др., 1997). В то же время известно, что распространяющиеся импульсные БЭР присущи не только животным, но и растениям. Не могут ли они осуществлять электрофизиологическую рецепторно-эффекторную связь и здесь? Положительный ответ можно дать в случае локомоторных растений, способных к ПД-индуцированным быстрым двигательным реакциям. В случае же "обычных" растений до сих пор исследований в данном направлении крайне мало.
В настоящей работе предпринята попытка доказательства наличия у растений рецепторно-эффекторной связи, осуществляемой БЭР, путем сравнения электрофизиологических феноменов животных и растений в основных звеньях сигнальной цепи: рецепции раздражения, распространении импульсной БЭР и конечных ПД-индуцированных эффектах. Работы, опубликованные ранее, дают основания предполагать сходство этих явлений у столь различающихся друг от друга типов живых систем.
Так, Jacobson (1964), изучая электрические ответы рецепторных клеток двигательных растений, показал их сходство с РП животных. Подобного исследования с нелокомоторными высшими растениями до сих пор не проводилось.
Несколько публикаций (Bose, 1964; Стадник, Боберский, 1976; Minorsky, 1989) указывают на возможность явлений пластичности БЭР, по крайней мере, в форме габитуации (привыкания). Однако, габитуация у "обычных" растений вызывалась предъявлением раздражения в период рефрактерности для генерации ПД, и остается невыясненным, возникают ли изменения БЭР при интервалах между раздражением больше этого периода.
Целый ряд работ (Sibaoka, 1953; Бос, 1964; Опритов и др., 1991; Зацепина и др., 1992) свидетельствует об электрическом механизме распространения ПД в симпласте растительных тканей, подобном механизму распространения нервного импульса, хотя, в тоже время, существуют и иные точки зрения на этот счет (Malone, 1996). Необходимо также отметить, что распространяющееся возбуждение у растений представлено не только ПД. В ответ на различные повреждающие воздействия генерируются так называемые вариабельные потенциалы (ВП), природу которых принято связывать с распространением химического или гидравлического сигнала (Malone, 1996).
Что касается конечных реакций, вызванных распространяющимися БЭР у "обычных" растений, то здесь можно сослаться на работы, свидетельствующие об изменении под действием ПД и ВП целого ряда функциональных показателей различных органов (Гунар, Синюхин, 1963; Беликов и др., 1964; Опритов и др., 1972, 1980; Кудоярова и др., 1990; Malone, 1996; Полевой и др., 1997). Однако биологическая целесообразность этих функциональных изменений большей частью не выяс- нена. В работах В.Г. Ретивина с соавторами (1993, 1997) экспериментально было обосновано представление о том, что ПД у высших растений инициируют опережающую адаптационную перестройку (предадаптацию) в тех тканях стебля, которые сами никакого внешнего воздействия не испытали. Невыясненными в данной проблеме представляются вопросы о специфичности или неспецифичности вызываемых ПД изменений, а также не показана возможность осуществления с помощью ПД электрофизиологической связи между разными органами.
Таким образом, имеющиеся данные литературы хотя и демонстрируют сходство биоэлектрических явлений животных и растений, тем не менее носят достаточно фрагментарный характер. Попыток целенаправленного изучения предполагаемой электрофизиологической рецепторно-эффекторной цепи у высших растений до сих пор не предпринималось.
Целью работы является изучение основных звеньев электрофизиологической рецепторно-эффекторной цепи высшего растения: рецепции раздражения; проведения сигнала; индуцируемого этим сигналом эффекторного ответа.
В задачи работы входило:
Определить, обладают ли МБЭР "обычного" высшего растения основными свойствами рецепторных потенциалов.
Проанализировать наличие у возбудимых клеток гипокотилей проростков тыквы свойств, близких к нейрональной пластичности.
Сравнить фактическую скорость распространения ПД по стеблю с теоретической, рассчитанной на основе известной для нервного импульса закономерности.
Провести сравнение между ПД и ВП по электрофизиологическим критериям и по энергетическим затратам клеток, их генерирующих.
Выяснить, может ли ПД представлять собой неспецифический сигнал, способный вызывать эффекторный ответ в виде повышения резистентности клеток удаленного от раздражения органа к повреждающим воздействиям. В частности, может ли ПД, вызванный не охлаждением стебля, а обработкой корней КС1, повлиять на хол од о- и термоустойчивость фотосинтезирующих клеток семядолей.
Рецепторно-эффекторные связи в живых системах
Любая биологическая система в большей или меньшей степени способна воспринимать изменения извне и реагировать на них, оптимизируя свое существование в меняющемся мире. У животных, как известно, на организменном уровне эту функцию в основном выполняет нервная система. В терминах общей сенсорной физиологии каузальную цепь, связывающую внешний стимул и реакцию живого объекта можно представить следующим образом (Bentrup, 1979; Shimmen, 2001): рецепция стимула — передача сигнала — физиологический ответ. В нервной системе первый этап осуществляется в рецепторных (сенсорных) клетках органов чувств. Здесь внешнее воздействие определенной модальности преобразуются в электрический ответ - рецепторный потенциал (РП). Далее сенсорная информация передается посредством нервных импульсов (ПД). В случае простейшей рефлекторной дуги эти сигналы через ряд промежуточных нейронов активируют клетки, осуществляющие эффекторный ответ (Варфоломеев и др., 2000). Необходимо отметить, что термин "рецептор", которым обозначали рецеп-торные клетки органов чувств в 60-70-е годы, постепенно взяли на вооружение специалисты по молекулярной биологии. Ими в настоящее время под этим словом однозначно понимается белковая молекула, реагирующая с сигнальным веществом (Грибакин, 1999). В более широком смысле, рецептор или сенсор - это агент, активируемый химической или физической энергией внешнего воздействия. Активированным сенсором запускается процесс трансдукции, заключающийся в преобразовании внешнего сигнала во внутренний (Bentrup, 1979). В связи с этими замечаниями, рецепторно-эффекторную цепь более развернуто можно представить схемой, изображенной на рис. 2. В случае с нервной системой в качестве эндогенного сигнала (1) можно рассматривать рецепторный потенциал, в качестве эндогенного сигнала (2) - нервные импульсы. Какова роль местных и распространяющихся БЭР у растений? Можно ли их рассматривать как функциональные аналоги рецепторного потенциала и нервного импульса у животных? Может ли у них, как в случае с животными объектами, осуществляться электрофизиологическая рецепторно-эффекторная связь между стимулом, действующем извне и конечным адекватным ответом на этот стимул? Анализ литературных данных позволяет дать утвердительный ответ, по крайней мере, в случае локомоторных растений: мимозы, росянки, венериной мухоловки, альдрованды, кислицы и других. У этих организмов под действием механического, а иногда также температурного, светового и других воздействий можно наблюдать быстрые двигательные реакции. Для мимозы стыдливой и некоторых других видов, произрастающих в тропических условиях, где нередки сильные ливни и ураганные ветры, моторный акт складывания и опускания листьев обеспечивает их защиту от повреждающих механических воздействий (Бос, 1964; Pickard, 1973).
Для насекомоядных растений, таких как венерина мухоловка, росянка, альдрованда, двигательный акт составляет основу процесса ловли насекомого (Дарвин, 1948а; Вайнар, 1987). Причастность биоэлектрической системы связи к указанным быстрым двигательным реакциям хорошо установлена. Прослеживается следующая цепь событий: раздражение - генерация МБЭР в специализированных рецепторных клетках - генерация распространяющихся ПД - изменение в "двигательных" клетках концентраций ионов и, соответственно, тургорного давления - осуществление тургорного движения (Бос, 1964; Pickard, 1973; Bentrup, 1979; Roblin 1979; Sibaoka, 1991; Shimmen, 2001). Остановимся подробнее на анализе трех основных звеньев предполагаемой биоэлектрической сигнальной цепи у растений. Целесообразным для этого представляется рассмотреть следующие вопросы: 1. Насколько сходны или различны основные принципы рецепции у животных объектов, локомоторных и обычных растений? Более конкретно это можно сформулировать так: обладает ли МБЭР растений свойствами рецепторных потенциалов животных? 2. Могут ли распространяющиеся БЭР (ПД и ВП) у растений осуществлять дальнюю связь между внешним стимулом и предполагаемым эф-фекторным ответом? Какого рода информацию могут нести сигналы, передающиеся по электрофизиологическому каналу связи? 3. Какие реакции обычных, не локомоторных растений можно считать эффекторными ответами на внешнее воздействие? Все рецепторные системы животных обладают общими электрофизиологическими свойствами, к числу которых можно отнести следующие. 1. Генерация РП в специализированных рецепторных клетках. РП обладает градуальным характером: его амплитуда и длительность зависит от величины и продолжительности воздействия. 2. При достижении определенного значения РП непосредственно в рецепторных клетках либо в промежуточных нейронах генерируются ПД. 3. Уже на нейрональном уровне наблюдается подчинение закону Вэбера-Фейхнера: частота нервных импульсов в эфферентном волокне связана с силой внешнего воздействия логарифмической зависимостью. При этом сила внешнего воздействия связана с амплитудой РП также логарифмической зависимостью, а амплитуда РП с частотой импульсов -линейной (Кейдель, 1975; Варфоломеев и др., 2000). 4. Для сенсорных систем характерно явление аккомодации - зависимость величины порога возбуждения от скорости нарастания раздражающего воздействия (Латманизова, 1972; Ходоров, 1975). 5. ЦНС в целом и сенсорным системам в частности свойственно явление пластичности, которую можно определить, как способность изменять реактивность к раздражителю в зависимости от его повторяемости или ассоциировании с действием других факторов.
Из неассоциативных форм пластичности выделяют привыкание и сенситизацию. При привыкании происходит постепенное ослабление реакции на монотонно повторяемое раздражение, сенситизация же, напротив, представляет собой усиление реакции на слабые сигналы (Кэндел, 1980; Котляр, Пивоваров, 1989; Роуз, 1995). У некоторых локомоторных растений показано наличие специализированных рецепторных клеток. Например, у венериной мухоловки таковыми служат выемчатые клетки оснований чувствительных волосков (Bentrup, 1979). Их удаление ведет к потере чувствительности растения к механическим раздражи- телям (Benolken, Jacobson, 1970). Местоположение и строение этих клеток определяет их значительную деформацию при отклонении волоска. Им присуща также функциональная асимметрия, хорошо известная для рецепторных клеток животных (Williams, Mozingo, 1971, цит. по Bentrup, 1979). Рецепторными клетками у росянки, по всей видимости, являются клетки шейки щупалец, гомологичные выемчатым клеткам венериной мухоловки (Williams, Pickard, 1972; Bentrup, 1979). У альдрованды сенсорными являются все (а их в данном случае всего четыре) клетки чувствительного волоска, для которых характерна тонкая клеточная стенка (Sibaoka, 1991; Shimmen, 2001). У остальных видов, в том числе у всех "обычных" нелокомоторных растений специализированные рецепторные клетки или отсутствуют вовсе, или не идентифицированы на сегодняшний день. Однако, предполагается, что у всех растений существуют определенные зоны, обладающие повышенной чувствительностью к действию внешних раздражителей (Полевой, 2001). Так, еще Ч. Дарвин экспериментально показал, что верхушка побега и кончик корня способны специфически воспринимать влияния внешней среды (Дарвин, 19486). В публикациях некоторых зарубежных авторов (Benolken, Jacobson, 1970; Williams, Pickard, 1972; Bentrup, 1979; Shimmen, 2001) БЭР, генерируемую в зоне воздействия внешнего раздражителя (в частности механического воздействия), называют рецепторным потенциалом. Обладают ли действительно МБЭР растений свойствами РП животных? Как отмечалось выше, в определенных диапазонах внешнего стимула, МБЭР, также как и РП градуальна
Регистрация биоэлектрических реакций
Регистрация БЭР проводили экстраклеточно на установке, схема которой изображена на рис. 4 и 5. За МБЭР принимали регистрируемое изменение разности электрических потенциалов между измерительным электродом (Ei), установленным в зоне воздействия раздражителя, и электродом сравнения (Е0 ), контактирующим через питательный раствор с корнями. Для регистрации распространяющихся БЭР второй измерительный электрод (Е2) располагали на удалении от зоны воздействия. В ряде экспериментов использовали дополнительную пару электро-дов (Ез-Ео , на рисунке не показано), при этом измерительные электроды (Е2, Ез) устанавливали на различных расстояниях от места раздражения. С растением все измерительные электроды контактировали через хлопчатобумажные фитили, смоченные водопроводной водой. В опытах с раздражением корней раствором КС1 (рис. 5) электрод сравнения (Ео) погружали в жидкость, омывающую край листовой пластинки. Измерительные электроды контактировали с корнем (Ei), верхним участком стебля (Ег) и центральной жилкой листовой пластинки (Е3). программа, позволяющая вести непрерывную регистрацию в течение неограниченного времени. Частота дискретизации была программно уменьшена до 2 Гц. 2.3 Нанесение раздражения. В качестве физиологически умеренных раздражителей использовали: (а) постепенное охлаждение участка стебля, (б) импульсное охлаждение участка стебля, (в) дозируемый механический удар по стеблю, (г) воздействие на корни раствором 1МКС1. Постепенное охлаждение осуществляли с помощью полупроводникового термостолика, с поверхностью которого через небольшой объем воды, ограниченный кюветой, контактировал участок стебля длиной 1,5 см. Измерительный электрод в данном случае погружали непосредственно в кювету с охлаждаемой жидкостью. Ее температуру снижали с 20-22 до 8-10С со скоростью около 2 С/мин. Последующее восстановление температуры осуществляли путем изменения полярности питания термостолика, причем скорость нагревания также составляла около 2С/мин. В опытах с импульсным охлаждением (рис. 46) в качестве раздражителя использовали охлаждение участка стебля водой, температура которой варьировалась от 16-17С (порог воздействия) до 11—12С (генерация местных ПД). Для получения необходимой температуры водопроводную воду комнатной температуры (20-23С) разбавляли определенным количеством ледяной воды, температура которой была близка к 0С. Воду наносили медицинской пипеткой на область стебля длиной примерно в 1 см. С этой же областью через фитиль контактировал измерительный электрод. В качестве механического воздействия применяли дозированный удар стеклянной палочкой (рис. 4в).
При этом использовали палочки массой 0,29 г и 1,62 г, удар которыми производили с различной высоты через стеклянную трубку. Такой способ воздействия, описанный, в частности, Shimmen (2001), позволял плавно регулировать энергию удара. Измерительный электрод контактировал с растением через электропроводный гель, нанесенный под ударяемый участок стебля. Приступая к данному этапу работы, мы столкнулись с тем, что в литературе нет общепринятой меры "интенсивности стимула" при механическом воздействии. В разных публикациях авторы указывали массу предмета, способного вызвать раздражение (Дарвин, 1948а); энергию и площадь сечения ударяющего предмета (Квасов, 1949, цит. по Опритов и др., 1991); высоту, с которой падает предмет определенной массы (Shimmen, 2001); величину продольного сдвига, осуществляемого механическим стимулятором (Jacobson, 1965). Чтобы не указывать каждый раз набор таких величин, как массу ударяющей палочки, высоту ее падения, площадь ее поперечного сечения, мы воспользовались удельной энергией удара, выражаемой в Дж/см и вычисляемой по формуле: удельная энергия удара - mgh/S, где т - масса палочки, h - высота ее падения, g - ускорение свободного падения, S=7 мм2 - площадь сечения палочки. 2.4 Анализ зависимости амплитуды биоэлектрической реакции в зоне раздражения от интенсивности воздействия. В опытах с воздействиями различной силы определяли амплитуду МБЭР -разницу между исходной величиной разности потенциалов и максимальным отклонением этой величины в ходе генерации МБЭР. Раздражение наносили многократно, начиная от его порогового значения и заканчивая значением, при котором генерировались местные ПД (то есть уже не наблюдалось увеличения амплитуды ответа), или значением, при котором наблюдались визуальные признаки повреждения стебля (при ударе). Для предотвращения влияния предыдущего раздражения на амплитуду последующего ответа, интервал между воздействиями составлял не менее 40 минут. Серии опытов проводились с 10-кратной повторностью. При построении усредненных зависимостей "сила воздействия - амплитуда ответа" ввиду большой вариабельности ответов разных растений проводилось следующее нормирование: для механического воздействия за 100 единиц в каждом опыте принималась такая удельная энергия удара, при которой амплитуда В качестве измерительных электродов и электродов сравнения применяли неполяризующие хлорсеребряные макроэлектроды ЭВЛ-1М. Электроды подключали к высокоомным милливольтметрам рН-121. В опытах с охлаждением также регистрировали изменения температуры в объеме охлаждаемой жидкости термистором, подключенным через уравновешенный мост Витстона к милливольтметру (рис. 4а). В экспериментах использовали компьютерную цифровую регистрацию с помощью платы аналого-цифрового преобразователя (АЦП) L-205 фирмы "L-card". Максимальная частота дискретизации данного АЦП - 16 Гц, входное сопротивление - 1 Мом, число каналов - 16. В наших исследованиях было задействовано до четырех каналов. Для работы с платой АЦП автором (с использованием стандартных функций "L-card") была специально разработана компьютерная ответа была близка к 50 мВ; для опытов с импульсным охлаждением за 100 % принималась амплитуда ответов местных ПД, то есть таких ответов, амплитуда которых уже не возрастала при увеличении степени воздействия.
Периодическое воздействие охлаждением. В качестве периодического раздражителя для изучения возможной сенсорной адаптации использовалось постепенное охлаждение участка стебля с 20-22 до 8-10С со скоростью примерно 2С/мин с последующим нагреванием до исходной температуры с такой же скоростью. В разных сериях опытов раздражитель наносился с интервалами в 15, 30, 60, 120 мин. При этом минимальный интервал (15 минут) был выбран ввиду того, что он находится на границе рефрактерное для местных ПД. Максимальный интервал (120 минут), при котором параметры периодически вызываемых МБЭР оказались примерно одинаковыми, был получен в ходе предварительных экспериментов. В каждом опыте периодическое охлаждение наносилось 5 раз. В каждой серии использовали не менее 12 растений. Для оценки биоэлектрических ответов применяли следующие параметры БЭР: температурный порог импульсной компоненты БЭР - разница между исходной температурой и температурой, при которой начиналась импульсная деполяризация; скорость деполяризации - отношение величины деполяризации (мВ) к ее длительности (мин); скорость реполяризации - определялась так же, как и скорость деполяризации; число импульсов - число местных ПД в рамках одной БЭР. Для графического представления результатов данных экспериментов значения всех параметров выражали в процентах от таковых в ответе на первый стимул, усредняли процентные значения. Для статистической обработки применяли "истинные" (не процентные) значения параметров. 2.6 Изучение потенциалов действия. Регистрировали одновременно МБЭР, вызванные постепенным охлаждением, и ПД на различном удалении от охлаждаемой зоны. ПД при таком типе воз- действия распространяются не всегда, и для достаточно полного анализа было проделано 50 опытов. Из них в 20 случаях были получены ПД на расстоянии от зоны раздражения. "Экспериментальная" скорость их распространения находилась по формуле V = I/1, где / - расстояние от места регистрации МБЭР до места регистрации ПД, t - время. Для вычисления "теоретической" скорости были взяты данные 5 опытов, в которых, кроме распространяющихся ПД, регистрировали БЭР в пределах кабельной связи от места генерации МБЭР - на расстоянии 5 мм от зоны охлаждения.
Компьютерная и статистическая обработка результатов
Все компьютерные записи электрофизиологических экспериментов (файлы в текстовом формате) для обсчета параметров импортировали в программу Mi-crocal Origin 5.0. В качестве иллюстраций использовали типичные для каждого вида опытов записи. При этом данные переносили в Microsoft Excel 97, где строились соответствующие кривые. Для компоновки этих записей и создания рисунков использовали программное обеспечение Corel Draw 8 и Corel Poto-Paint 8. При компоновке нескольких записей в один рисунок их масштаб всегда соблюдался одинаковым. Компьютерное моделирование на основе модифицированной модели Ходжкина-Хаксли осуществлялось в системе MATLAB 5.2 программой, разработанной автором. Результаты экспериментов статистически обрабатывали с использованием программы Microsoft Excel 97. На графиках и таблицах представлены средние арифметические и их стандартные квадратичные ошибки. Для анализа характера зависимости "интенсивность воздействия - амплитуда ответа" брали усредненные по всем опытам в серии значения амплитуд. Линии тренда и соответствующие им коэффициенты аппроксимации R вычислялись встроенными в Microsoft Excel 97 модулями. В опытах с периодическим воздействием применялся "анализ повторных измерений", подробно описанный в работе С. Гланц (1999). Под "контролем" подразумевали значения параметров МБЭР, генерируемой на первое воздействие. Значения параметров повторно вызываемых МБЭР, которые подчинялись нормальному распределению, подвергали "дисперсионному анализу повторных измерений". При неподтверждении нулевой гипотезы, оценку достоверности различий с "контролем" производили с помощью критерия Стьюдента для парных измерений с поправкой Бонферони. Кроме того, если нормального распределения у анализируемых параметров МБЭР не наблюдалось (например, в случае "количества импульсов"), использовали непараметрический критерий Фридмана с последующим анализом оценки достоверности различий с "контролем" с помощью критерия Данета. Для оценки степени согласованности "экспериментальной" и "теоретической" скоростей распространения ПД применялся метод Бленда-Альтмана (Гланц, 1999). При выявлении корреляции между параметрами БЭР в зоне раздражения и распространением ПД применялся анализ с помощью коэффициента ранговой корреляции Спирмена. В опытах с модифицирующим влиянием ПД на устойчивость к действию повреждающих воздействий оценку достоверности различий с контролем производили с помощью критерия Стьюдента для парных измерений. Известно, что рецепторные потенциалы животных в значительной степени зависят от природы наносимого раздражителя и его длительности. Характерна ли такая картина для МБЭР клеток гипокотелей тыквы? На рис.8 представлены примеры записей БЭР, возникающих в месте воздействия (а) постепенного охлаждения с последующим восстановлением температуры, (б) импульсного охлаждения и (в) механического удара. Из рисунка видно, что БЭР, соответствующие трем различным типам воздействия явным образом отличались друг от друга.
Отличия имели такие параметры, как длительность ответов, амплитуда, характер де- и реполяризации, наличие ПД. БЭР, возникающие на импульсное воздействия (быстрое охлаждение, удар) всегда имели компактную форму, сходную с ПД. Тем не менее «истинные» ПД, для которых характерны максимальная амплитуда в месте воздействия и способность к распространению, нами не были получены при механическом воздействии, а в случае с импульсным охлаждением генерировались при температурных перепадах более 9С. Достаточно медленная деполяризация наблюдалась только при постепенном охлаждении. Как правило (но не всегда) на ее фоне генерировался один или несколько ПД (в данном случае, на рис.8а - два). Длительность ответа в случае достаточно долговременного постепенного охлаждения значительно превышала таковую в случае импульсного охлаждения и механического удара. В среднем, для полного восстановления разности потенциалов до исходного уровня при холодовом воздействии, длящимся 10-12 минут, требовалось до 40 минут. При импульсном охлаждении длительностью 2-3 секунды это время сокращалось до 1-15 минут. Восстановление разности потенциалов при механическом ударе происходило в пределах 1-10 минут. Динамика реполяризации во всех случаях также имела свои характерные особенности. Так, при постепенном охлаждении с последующим восстановле- ниєм температуры на всех записях четко выделялись две компоненты реполя- ризации: быстрая (15-40 мВ/мин) и медленная (1-2 мВ/мин) После процесса "быстрой" реполяризации потенциал сначала немного смещался в сторону не-гативации, формируя своего рода "следовую волну", а затем, почти с постоянной скоростью, возрастал, в течении 20-30 мин достигая первоначального стационарного значения. Что касается импульсного охлаждения, то и здесь в ответе растения мы могли наблюдать сходную с предыдущей картину восстановления потенциала, с той лишь разницей, что амплитуда и длительность следовой волны, имеющей место после генерации импульсного ответа, были значительно меньше. Подобные следовые изменения потенциала наблюдалась нами примерно в 70% случаев при данном характере воздействия. Интересно отметить, что достаточно часто при импульсном охлаждении в биоэлектрическом ответе на пике "быстрой" реполяризации потенциал имел более положительное значение, чем в стационарном состоянии. Наличие положительного следового потенциала наблюдалось нами также и у распространяющихся ПД. Более подробно этот вопрос обсуждается далее, в разделе 3.2.1. Динамика восстановления потенциала после механического воздействия во всех случаях имела довольно "простой" характер, что видно из представленной на рис.8в типичной записи БЭР.
Однообразный выпуклый характер кривой позволяет предположить однокомпонентный механизм (в отличие от ситуации с охлаждением), обеспечивающий реполяризацию мембраны. Таким образом, несложный анализ записей БЭР, генерируемых в зоне внешнего воздействия, показывает их зависимость от природы раздражителя и его длительности. При охлаждении характерны многокомпонентые БЭР, включающие в себя ПД и следовые потенциалы. При механическом воздействии реакции более просты и не включают в себя ПД. Биоэлектрические ответы на импульсное воздействие в общем случае короче (но, видимо, не могут быть столь же короткими, как сами стимулы) ответов на длительное воздействие. Как обсуждалось в обзоре литературы, некоторыми авторами отмечался тот факт, что амплитуды биоэлектрических ответов в определенном диапазоне зависят от интенсивности стимула. Нам удалось достаточно хорошо выявить характер такого рода зависимостей при охлаждении и механическом воздействии. В опытах с постепенным охлаждением мы исходили из следующих предпосылок, полученных в ходе предварительных экспериментов. а) При подпороговых для генерации местных ПД значениях температуры потенциал в области охлаждения изменялся в сторону негативации только до тех пора, пока понижалась температура. При остановке охлаждения потенциал более отрицательным не становился. б) Небольшое количество проростков демонстрировали БЭР на охлажде ние без генерации местных ПД, что, по всей видимости, объясняется их инди видуальными свойствами. Мембранный потенциал при реакциях такого рода изменялся только до тех пор, пока длилось охлаждение. При восстановлении температуры восстанавливался и потенциал. Данное обстоятельство делало та кие проростки очень удобным объектом для исследования зависимости ампли туды ответа от степени охлаждения. в) При постепенном охлаждении в определенный момент времени точно регистрируется и температура жидкости в экспериментальной ячейке, и значе ние разности потенциалов. Исходя из этого, для получения зависимостей "интенсивность стимула -амплитуда ответа" для данного типа воздействия мы в каждом конкретном эксперименте вели непрерывное охлаждение. Точки кривых получались путем дискретизации записей ответов (вернее только зоны деполяризации), и температуры. На рис. 9(a) представлены данные эксперимента с постепенным охлаждением в случае генерации БЭР без ПД. Зависимость "степень охлаждения - амплитуда ответа" имела S-образный характер. Строго говоря, по оси ординат от-
Особенности передачи сигнала с помощью импульсных биоэлектрических реакций
Отличается ли механизм распространения ПД по симпласту растений от такового в нервных волокнах животных? В данном исследовании сделана попытка ответа на этот вопрос с помощью сравнения экспериментально измеренного значения скорости распространения ПД со значением, рассчитанным на основе известной для нервного импульса закономерности. Для определения "экспериментальной" и "теоретической" скорости регистрировали БЭР в зоне воздействия (МБЭР), БЭР на расстоянии кабельной связи (до 0,7 см) от этой зоны и ПД (5-10 см от места воздействия). Рассмотрим способ нахождения интересующих нас величин на типичном примере (рис. 17), опубликованном нами в работе (Ретивин и др., 2001). Значение скорости ПД, полученное экспериментально. Из записей, представленных на рис. 17а можно достаточно точно определить скорость распространения ПД. Она равна: Ужсп = L 11 = 5 см / 16,2 с » 0,3 см/с, где t - время прохождения переднего фронта ПД между электродами, L - расстояние. Это большая часть гипокотиля, поэтому можно быть уверенным, что найденная величина Ужсп соответствует средней скорости распространения ПД на всем его пути по гипокотилю. Аналогичным образом "экспериментальная" скорость определялась еще в девятнадцати экспериментах. Средняя скорость по всем 20 опытам оказалась равной: V3KC„ = 0,8 ± 0,2 см/с (п=20). Через 2,5 часа после представленного на рис. 17а эксперимента, на том же растении осуществили такое же, как и первое, второе раздражение охлаждением, изменив расстояние между измерительными электродами с 5 см до 5 мм (рис. 176). Так как общий рефрактерный период для генерации и распространения ПД в случае проростков тыквы составляет около 40 мин (Ретивин и др., 1988), то, следовательно, второй ПД, как в зоне охлаждения, так и на расстоянии от него должен быть аналогичен первому. Рассчитаем скорость распространения ПД в этом эксперименте (рис. 176), полагая, что она соответствует начальному участку пути распространения импульса: Ужсп = 0,5 см / 3,2 с = 0,16 см/с. Это несколько меньше средней скорости распространения ПД вдоль всего гипокотиля, что, вероятно, связано с существованием резкого температурного градиента на границе с зоной охлаждения или с другими особенностями превращения местного ПД в распространяющийся, в частности - латентным периодом, характерным для его генерации в ответ на различные раздражения (Опритов и др., 1991). На основании данного эксперимента (рис. 17) можно сказать, что на границе с зоной раздражения ПД распространяется более медленно (5 мм за 3,2 с), а затем более быстро (50 - 5 = 45 [мм] за 16,2 - 3,2 = 13 [с]).
Следовательно, скорость распространения ПД на удалении от зоны раздражения несколько выше средней для всего пути пробега (5 см) и равна: V3KJ = 4,5 см / 13,0 с = 0,35 см/с. Расчетное значение скорости ПД. Кроме экспериментального определения скорости распространения ПД по возбудимым клеткам проводящих пучков гипокотиля ее можно рассчитать и теоретически, используя формальный подход, применяемый в теории возбудимых сред (Цаплев, Зацепина, 1980; Маркин и др., 1981): V= I dU dt (5) ]JAUth-Cm(Ri+R0) где dU/dt - крутизна фронта импульса в момент достижения порога возбуждения, AUth - порог возбуждения, Ст - емкость мембраны, Rt + R0 - сумма внутреннего и наружного сопротивлений. Заменив в этом выражении неизвестную сумму Rj + R0 на Rm / А2 в соответствии с уравнением, известным для кабельной постоянной (характеристической длинной) Л (Маркин и др., 1981): A2-Rm/(Ri + R0) (6), олучим: V = A dU/d (7). -2 Cm= 1 мкФсм" , принято считать константой (Маркин и др., 1981). Сопротивление плазматических мембран Rm = 100-103 Омсм2 для любых растительных клеток с допущением можно также считать одинаковым (Юрин и др., 1977). Таким образом, получаем уравнение, содержащее величины, достаточно легко получаемые в эксперименте: v =х к\ (8)- Для правильного определения величин AU,h и dU/dt сначала необходимо установить истинную амплитуду распространяющегося ПД. Фронт местного ПД, зарегистрированного внеклеточно (рис. 17а, 176), имеет амплитуду 138-146 мВ. Как было показано ранее (Ретивин, 1988), она совпадает с истинной амплитудой ПД, т. к. в зоне охлаждения ПД генерируют как пучковые, так и поверхностно расположенные внепучковые клетки. Распространяющийся ПД на рис. 17а и 176 имеет амплитуду 92-107 мВ, то есть в 1,5 раза меньше амплитуды местного ПД. Причина этого заключается в том, что ПД распространяется вдоль стебля внутри проводящих тканей и электрически затухает при его радиальном распространении по основной паренхиме к поверхности стебля (Ретивин, Опритов, 1987). Таким образом, найденное отношение амплитуд местного и распространяющегося ПД (1,5) соответствует коэффициенту радиального затухания сигнала. Учитывая данный коэффициент, можно весьма точно определить порог возбуждения для ПД. Подпороговое изменение потенциала на рис. 176 (кривая "БЭР (L=0,5CM)") составляет 10 мВ. Если учесть, что эта кривая регистрируется с коэффициентом затухания 1,5 по отношению к реальному изменению мембранного потенциала, то можно считать, что порог возбуждения для распространяющегося ПД AUth составляет 10-1,5 = 15 мВ.
Для местного ПД можно однозначно утверждать, что порог возбуждения выше, чем для распространяющегося ПД. В данном случае порог возбуждения ПД AUth в зоне охлаждения равен 70 мВ. Координаты точки перехода подпороговой деполяризации в надпороговую кривых "МБЭР", "БЭР (L=0,5CM)" использовались и для расчета кабельной постоянной Я симпласта возбудимых клеток проводящих тканей гипокотиля в соответствии с принципами ее вычисления, изложенными в работах Г. Н. Зацепи-ной с соавторами (1992) и В.Г. Ретивина, В.А. Опритова (1987): = AL 1 (9), Щи2 где L - расстояние между электродами, регистрирующими БЭР в пределах ка-бельной связи (в данном случае 0,5 см), AUth , AUth - пороговые значения деполяризации в зоне охлаждения и на расстоянии в пределах кабельной связи. В данном случае X, вычисленная таким образом, равна 0,31 см, что соответствует средней X этих клеток, определенной иным способом (Ретивин, Опритов, 1987). Крутизна фронта ПД dU/dt на рис. 17а и 176 составляет 5,6 мВс" , как в зоне охлаждения, так и для распространяющегося ПД. Таким образом, все составляющие уравнения (8) известны. Два значения AUth позволяют получить два значения теоретической скорости распространения ПД Vmeop. Очевидно, что одно из них должно в определенной степени соответствовать экспериментальным данным для Уэксп - скорости ПД в пределах кабельной связи, т. е. 5 мм от зоны раздражения, а другое - Уэксп2 - скорости ПД на удалении от зоны раздражения. Итак, теоретическая скорость распространения ПД на удалении от зоны охлаждения: Vmeop = 0,62 см/с (уэксп2 = 0,35 см/с). Теоретическая скорость распространения ПД в пределах 0-5 мм от зоны охлаждения: Vmeop = 0,27 см/с (V3KJ = 0,16 см/с). Подобным образом были рассчитаны скорости распространения ПД еще в 4 опытах. Полученные данные представлены в таблице 4. Кроме того, здесь же приведены результаты расчетов средних значений для Я (n=5), AUth (п=20), dU/dt (п=20) и найденная с использованием этих значений "средняя" теоретическая скорость.
