Содержание к диссертации
Введение
I. Обзор литературы 10
1. Активные формы кислорода (ЛФК) 10
1.2. Химическая природа АФК 10
1.2. Цитотоксические эффекты АФК . 13
1.3. Биологические источники АФК.. 15
1.4. Метаболизм АФК в клетках 17
2. Супероксиддисмутазы: различные типы, эволюция структуры и функции ферментов 23
2.1. Железо-содержащиеСОД 24
2.2. Марганец-содержащие СОД 25
2.3. Камбиалистические СОД , 26
2.4. Медь/цинк-содержащие СОД ...28
2.5. Никель-содержащие СОД 30
3. Исследования клеточных функций супероксиддисмутаз 30
3.1. Мутационный и комплсментационный анализ 31
3.2. Исследования биологической роли СОД с использованием трансгенных моделей и миметиков 33
4. Характеристика генных семейств СОД растений 41
4.1. Структура генных семейств СОД растений 42
4.2. Регуляция экспрессии генов СОД растений 44
4.3. Представления об эволюции структуры и функции генов СОД растений 47
5. Состояние исследований генов СОД у хвойных растении 48
6. Итоги обзора литературы 50
II. Материалы и методы 51
1. Объект исследования 51
2. Использованные методы 52
2.1. Выделение ДНК 52
2.2. Выделение РНК 52
2.3. Подбор праймеров для ПЦР и ОТ-ПЦР 53
2.4. Условия ПЦР на геномной ДНК 55
2.5. Синтез первой цепи кДНК 55
2.6. Условия ОТ-ПЦР 55
2.7. Условия 3'RACE 55
2.8. Условия 5'RACE 56
2.9. Электрофоретическое разделение продуктов синтеза первой цепи кДНК в денатурирующих условиях 57
2.10. Электрофоретическое разделение и очистка продуктов ПЦР, ОТ-ПЦР, 3 RACE и 5'RACE 57
2.11. Клонирование фрагментов кДНК 58
2.12. Выделение плазмидпой ДНК 59
2.13. Условия секвенирования ДНК 59
2.14. Саузерн-гибридизация 59
2.15. Нозерн-гибридизация 60
2.16. Контекстный анализ нуклеотидных и аминокислотных последовательностей...61
III. Результаты и обсуждение 62
1. Получение ОТ-ПЦР-продуктов, соответствующих высококонсервативным участкам генов СОД растений 62
1.1. Анализ последовательностей генов СОД растений и подбор праймеров 62
1.2. ОТ-ПІДР на мРНК растений различных систематических групп 64
2. Секвенирование фрагмента кДНКгена FeCOMZea mays, доказательства широкого распространения генов ГеСОДу растений и контекстный анализ аминокислотных последовательностей ГеСОД. 67
2.1. Секвенирование и сравнение кДНК ИеСОД кукурузы с высокогомологичными последовательностями других растений 67
2.2. Контекстный анализ аминокислотных последовательностей Fe-, Мп- и камбиалистических СОД прокариот и эукариот 69
2.3. Стрсссоиндуцируемая экспрессия гена РеСОД Zea mays 72
3. Исследование структуры гена хлороиластной СиМпСОД кукурузы 73
3.1. Секвенирование и анализ кДНК гена хлоропластной Си/гпСОД Z mays 73
3.2. Сравнительный анализ структурных особеностей генов хлоропластных Cu/ZnCOflZ mays 76
4. Исследование особенностей структуры генов Си/ЕпСОД лиственницы 78
4, 1. Секвенирование и анализ кДНК генов Cu/ZnCOfl Larix sibirica и L. gmelinii 78
4.2. Получение, секвенирование и контекстный анализ З'-концевых последовательностей кДНК генов СиЙпСОД лиственницы ...79
4.3. Анализ З'-концевых участков кДНК двух видов Larix 83
4.4. Определение количества копий генов СийпСОД Larix sibirica и L. gmelinii с помощью методов Саузерн-гибридизации и ПЦР 84
5. Исследование особенностей структуры генов МпСОД Larix sibirica и L. gmelinii.%1
5 1. Секвенирование и анализ кДНК гена МпСОД Larix sibirica и L. gmelinii 87
5.2. Получение, секвенирование и контекстный анализ З'-концсвых последовательностей кДНК гена МпСОД Larix sibirica и L. gmelinii., 87
5.3. Определение копийпости генов МпСОД L. gmelinii и L. sibirica с использованием методов ОТ-ПЦР и ПЦР на геномной ДНК 92
5.4. Роль альтернативного полиаденилирования траискриптов генов МпСОД в регуляции экспрессии данных генов 93
Заключение 98
Выводы 101
Список литературы 102
- Исследования биологической роли СОД с использованием трансгенных моделей и миметиков
- Состояние исследований генов СОД у хвойных растении
- Секвенирование и сравнение кДНК ИеСОД кукурузы с высокогомологичными последовательностями других растений
- Получение, секвенирование и контекстный анализ З'-концевых последовательностей кДНК генов СиЙпСОД лиственницы
Введение к работе
Супер оксид-радикал, образующийся в клетке в нормальных и стрессовых условиях как побочный продукт метаболических процессов, способен оказывать токсическое воздействие на клетку как напрямую, так и выступая в роли предшественника более цитотоксичной АФК -гидрокс ильного радикала. Неудивительно, что ферменты, осуществляющие элиминацию супероксидного радикала в живых системах — супероксиддисмутазы (СОД) - привлекают пристальное внимание исследователей, изучающих механизмы клеточных систем защиты от действия стрессовых факторов. У животных и человека интерес к изучению функции и роли данных ферментов связан с тем фактом, что мутагенный эффект АФК может служить причиной ряда заболеваний и являться одним из факторов старения. Что касается растений, то исследование антиоксидантной системы клетки было в большей степени связано с изучением возможности модификации устойчивости растений к неблагоприятным внешним воздействиям. В последнее время интерес к изучению СОД, как ферментов, участвующих в метаболизме АФК, снова возрос в связи с открытием сигнальной функции АФК.
В то же время, несмотря на интенсивное изучение генов семейства СОД растений, многие аспекты эволюции структуры и функции данных генов у растений остаются пока недостаточно исследованными. Так, например, с учетом завершения проекта по секвенированию генома модельного растения Arabidopsis thaliana более-менее становится ясной структура генных семейств СОД и функциональное разделение генов данного семейства в клетке двудольных растений. Аналогичные данные по генам СОД растений других таксономических групп, таких как однодольные и голосеменные растения, очевидно, являются недостаточными для формирования адекватных представлений о структуре генных семейств СОД у растений этих систематических групп. Без этих данных, в свою очередь, невозможно
7 внести большую ясность в представления о структуре, функции, регуляции и эволюции генов семейства СОД растений в целом.
Цели и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось исследование структуры и экспрессии отдельных генов семейства СОД у таксономически удаленных видов растений для выяснения возможных механизмов регуляции их экспрессии.
Для достижения этой цели были сформулированы следующие задачи: изучение организации кодирующих областей отдельных представителей генного семейства СОД хвойных растений Larix sibirica и Larix gmelinii путем секвенирования продуктов ПЦР и ОТ-ПЦР; изучение особенностей экзон-интронной организации генов СОД у Larix sibirica и Larix gmelinii; контекстный анализ полученных данных по структурной организации генов и аминокислотных последовательностей СОД двух видов лиственниц методами in silico; - секвенирование и контекстный анализ потенциальных регуляторных нетранслируемых областей мРНК генов СОД L. sibirica и L. gmelinii; - поиск и анализ генов, кодирующих хлоропластные СОД (РеСОД и Cu/ZnCO/J) кукурузы (Zea mays).
Научная новизна и практическая ценность работы. Впервые получены молекулярно-биологические доказательства экспрессии гена РеСОД кукурузы и определена частичная последовательность кДНК данного гена. Эти данные наряду с обнаружением в электронных базах данных EST высокогомологичных последовательностей кДНК РеСОД пшеницы {Triticum aestivum) и сорго {Sorghum bicolor) позволили опровергнуть существовавшую ранее гипотезу об эволюционном замещении функции генов РеСОД у растений генами, кодирующими Си/2пС0Д.
Впервые были определены последовательности кДНК и участков геномной ДНК генов, кодирующих хлоропластные CulZnCOJX у двух видов лиственницы. Результаты контекстного анализа этих последовательностей
8 предполагают существование различий в регуляции экспрессии на посттранскрипционном уровне одного из обнаруженных генов у лиственниц двух видов.
Впервые секвенированы последовательности кДНК и геномной ДНК генов МпСОД двух видов хвойных растений. Анализ З'НТП мРНК данных генов показал наличие в их структуре альтернативных сигналов полиаденилирования, что по-видимому, послужило причиной обнаруженного в данной работе полиморфизма длины трансриптов гена МпСОД лиственницы сибирской и Гмелина. Обнаруженная эволюционная консервативность альтернативного полиаденилирования, выражающаяся в представленности потенциальных сигналов полиаденилирования в З'НТП мРНК генов МпСОД растений разных систематических групп и животных, свидетельствует о вероятной высокой значимости альтернативного полиаденилирования как механизма посттранскрипционной регуляции экспрессии данных генов.
Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на V съезде ВОФР и международной научной конференции «Физиология растений - основа фитобиотехнологии» (Пенза, 2003 г), на всероссийской конференции «Стрессовые белки растений» (Иркутск, 2004), на международном симпозиуме "Физиология трасгенного растения и биобезопасность" (Москва, 2004), на международной конференции «Moscow Conference on Computational Molecular Biology» (MCCMB, Москва, 2005).
Публикации. Основные результаты диссертации изложены в 8 печатных работах. Одна работа находится в печати (Молекулярная биология. -2006.-2.)
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, результатов исследования и их обсуждения, выводов и списка цитированной литературы, включающего 207 работ зарубежных и отечественных авторов. Работа изложена на 124 страницах, содержит 20 рисунков и 4 таблицы.
9 Автор выражает благодарность научному руководителю, доктору биологических наук Ю. М. Константинову за хорошее идейное руководство, полезные советы и ценные критические замечания. Автор выражает благодарность коллективу лаборатории генетической инженерии растений СИФИБР СО РАН за моральную поддержку, методическую и экспериментальную помощь. Также автор выражает благодарность сотруднику ИЦиГ СО РАН Кобзеву Виктору Федоровичу за синтез олигонуклеотидов и сотруднику Межинститутского центра секвенирования Ренату Владимировичу Адельшшіу, осуществлявшему автоматическое секвенирование.
Исследования биологической роли СОД с использованием трансгенных моделей и миметиков
Помимо вышеперечисленных ферментов немаловажную роль в нейтрализации АФК играют также ферменты биосинтеза низкомолекулярных антиоксидантов, например глутатионситетаза и у-глутамилцистеинсинтетаза [Zhu et al., 1998]. Именно работа последнего фермента регулируется по механизму обратной связи глутатионом и зависит от концентраций доступного субстрата — L-цистеина [May et al., 1998].
Ключевыми ферментами энзиматической составляющей антиоксидантно й системы клетки считаются супероксиддисмутаза (СОД), аскорбатпероксидаза (АЛО), каталаза, глутатионпероксидаза (ГПО) и пероксиредоксии [Mittler et al., 2004]. Схема координированной работы данных ферментов в различных компартментах растительной клетки представлена на рис. 1 (из [Shigeoka et al., 2002]).
Супероксиддисмутаза (супероксид хупероксид-оксидоредуктаза, КФ 1.15.1.1, СОД) составляет первую линию ферментативной защиты клетки от токсических воздействий АФК, поскольку именно данный фермент осуществляет двустадийное окисление-восстановление супероксид-анионов:
Значимость данных ферментов, осуществляющих детоксикацию супер оксид-радикала, подтверждается их всеобщей распространенностью и представленностью множественными изоформами, различающимися по субклеточной локализации и используемым в качестве кофакторов ионам металлов: железо-содержащие (РеСОД), марганец-содержащие (МпСОД), медь/цинк-содержащие СОД (Сіи%іСОД) и никель-содержащие СОД [Hassan, Scandalios, 1990; Grene, 2002; , Alscher et al., 2002; Kliebenstein et al., 1998; Van Camp et al., 1997; Fink, Scandalios, 2002].
Аскорбатпероксидаза (Ь-аскорбат:Н202 оксидоредуктаза, КФ 1.11.1.11, АПО) относится к пероксидазам класса I и осуществляет восстановление молекул перекиси водорода до воды с использованием в качестве специфического донора электронов аскорбата, который в результате данной реакции окисляется до монодегидроаскорбата, в свою очередь, диспропорционирующего с образованием аскорбиновой кислоты и дегидроаскорбата [Shigeoka et al., 2002]. Так же, как и в случае СОД, значимость данного фермента в элиминации АФК подтверждается представленностью данного фермента в клетках прокариот и эукариот многочисленными формами, различающимися клеточной локализацией у эукариот [Yamaguchi et al., 1995; Bunkelmann, Trelease, 1996; Ishikawa et al., 1996; Ishikawa et al., 1997; Jespersen et al., 1997; Leonards et al., 2000].
Каталаза (Н202:Н202-оксидоредуктаза; КФ1.11.1.6) является гомотетрамерным железопорфириновым ферментом, осуществляющим каталитическое диспропорционирование перекиси водорода до молекул кислорода и воды [Taub, Rothblatt, 1995]. В отличие от аскорбатпероксидазы для каталитической активности фермента не нужен восстановитель 21 аскорбат, Км данного фермента ниже, чем у АПО, но в тоже время сродство каталазы к субстрату — перекиси водорода существенно ниже. Ферменты этого типа представлены как у эукариот, так и у прокариот. У животных каталаза обычно представлена единственной изоформой, реже - двумя [Taub, Rothblatt, 1995], в то время как для клеток растений характерно большее количество изоформ данного фермента с различной субклеточной локализацией [Wiilekens et al., 1994; McClung, 1997; Polidoros, Scandalios, 1997]. Каталаза в глиоксисомах участвует в элиминации образующейся в результате Р-окисления жирных кислот перекиси водорода. В пероксисомах каталаза восстанавливает перекись, образующуюся в результате фотодыхательного окисления гликолата гликолатоксидазой. Функция митохондриальной каталазы cat3 кукурузы до сих пор однозначно не определена [Polidoros, Scandalios, 1997]. У ряда прокариот были обнаружены каталазы другого типа, обладающие рядом особенностей как каталаз, так и пероксидаз [Brown-Peterson, Salin, 1995].
Селеноцистеиновые ферменты глутатионпероксидазы (глутатион:Н202-оксидоредуктаза, КФ 1.11.1.9, ГПО), осуществляющие восстановление пероксида водорода, органических гидропероксидов и пероксидов липидов с использованием глутатиона в качестве донора протонов широко представлены несколькими изоформами в клетках прокариот [Shigeoka et al., 2002] и эукариот [Xiang, Oliver, 1998]. Семейство генов ГПО резуховидки Таля представлено семью генами, кодирующими отдельные изоформы, которые функционируют в различных клеточных компартментах - цитозоле, хлоропластах, митохондриях и ЭПР [Xiang, Oliver, 1998].
Представители семейства глутатион-8-трансфераз (ЮОглутатион R-трансфераза, КФ 2.5.1.18) участвуют в детоксикации продуктов перекисного окисления липидов и ксенобиотиков электрофильной природы у растений [Dean et al., 1995; Kreuz et al., 1996] и животных, катализируя конъюгацию электрофильных токсикантов с восстановленным глутатионом. Конъюгаты далее удаляются из цитозоля с участием глутатионовых помп [Dean et al., 1995].
Пероксиредоксины (Prx) [Dietz et al., 2002; Konig et al., 2002; Pak et al., 2002; Konig et al., 2003; Horling et al., 2003; Yoshida et al., 2003] составляют еще одно большое, широко представленное у бактерий и эукариот, семейство пероксидаз, участвующих в детоксикации перекиси водорода, пероксинитрита, алкильных гидропероксидов [Konig et al., 2003]. Восстановление пероксидов осуществляется данными ферментами за счет обратимого окисления остатков Cys активного центра; восстановление активности ферментов осуществляется с участием биотиолов, таких как глутатион, тиоредоксин, глутаредоксин [Konig et al., 2003]. Выделяют четыре класса пероксиредоксинов: a) 2-Cys Prx; б) Prx Q; в) Prx И; г) 1-Cys Prx [Dietz et al., 2002]. В отличие от остальных пероксиредоксинов, 1-Cys ферменты содержат единственный каталитический остаток цистеина [Pak et al., 2002]. У эукариот гены пероксиредоксинов представлены относительно большим числом генов, например у резуховидки Таля общее их число составляет девять: по одному гену 1-Cys Prx и Prx Q, два гена 2-Cys Prx [Konig et al., 2002] и четыре гена Prx II [Dietz et al., 2002], экспрессия которых по-разному меняется в ответ на стрессовые воздействия [Horling et al., 2003].
Элиминация перекиси водорода в клетках растений может осуществляться также и при участии пероксидаз III класса (донор:Н202 оксидоредуктаза, КФ 1.11.1.7), кодируемых несколькими десятками генов у одного и того же вида растения [Yoshida et al., 2003]. Например, у Л. thaliana на сегодняшний день идентифицировано 73 таких гена, продукты экспрессии которых функционируют в различных компартментах клетки [Mittler et al., 2004].
Состояние исследований генов СОД у хвойных растении
Сравнительный анализ аминокислотных последовательностей и интрон-экзонной организации генов СОД растений, животных, грибов, водорослей и бактерий свидетельствует о том, что гены различных типов СОД (Fe, Мп, и СийпСОД) у растений имеют различное происхождение. Так, гены РеСОД были перенесены в ядерный геном растений из генома эндосимбиотических бактерий - предков хлоропластов; гены МпСОД были перенесены в ядро из генома предшественников митохондрий. Эволюционное происхождение генов CuJZnCOJl менее понятно, хотя в целом существует ряд данных, которые свидетельствуют об общем происхождении генов Си пСОД эукариот [Fridovich, 1997; Alsher et al., 2002; Fink, Scandalios, 2002].
Высокая функциональная значимость генов СОД подтверждается высокой консервативностью структурно-функциональной организации данных генов на уровне иитрон-экзонной организации, а также первичной, вторичной, третичной и четвертичной структур ферментов [Fink, Scandalios, 2002]. Наблюдаемая эволюция структуры и функции отдельных генов СОД растений затрагивает в первую очередь регуляторные последовательности данных генов, что выражается в отсутствии очевидных закономерностей регуляции экспрессии членов генного семейства СОД растений даже у эволюционно близких систематических групп [Van Camp et al., 1997; Alsher et al., 2002]. Другим направлением эволюции генных семейств СОД растений является, по-видимому, увеличение копийности генов СОД с последующим разделением функций отдельных генов, выражающимся в различной субклеточной локализации кодируемых ими белков и дифференциальной регуляции экспрессии [Van Camp et al., 1997; Kliebenstein et al., 1998; Alsher et al., 2002]. Такой путь эволюции генов СОД определяется более высоким уровнем компартментализации растительной клетки по сравнению с таковым в клетках прокариот. Результатом подобной дивергенции является различная представленность отдельных изоформ СОД в таких органеллах как перокснсомы, апопласт и цитозоль [Alsher et al., 2002].
В то же время, как уже было отмечено выше, функции генов СОД различных групп у растений в целом отражают их вероятное происхождение: МпСОД обычно функционируют в митохондриях, БеСОД — в хлоропластах и, как было показано в работе Ogawa с соавторами [Ogawa et al., 1996], «цитозольные» СиЙпСОД могут быть ассоциированы с ядром. Неясной остается эволюция генов, кодирующих митохондриальные МпСОД. В отличие от хлоропластов, цитозоля или пероксисом, где могут быть обнаружены различные изоформы СОД (Fe- и СиЙпСОД в хлоропластах и цитозоле, Мп- и Си/7пС0Д в пероксисомах), нет достоверных данных о существовании Fe- или Си/2пСОД в митохондриях. Данный факт является косвенным указанием на уникальные структурно-функциональные особенности ферментов МпСОД, связанные с их специфической функцией, обнаруженной впервые у прокариот — защита ДНК от мутагенного действия АФК [Hopkin et al., 1992]. Сохранение данной функции продуктов генов МпСОД у растений было показано, например в работе Дещене и Ньютона [Descheneau, Newton, 2005]. Авторы данной работы обнаружили, что продукт гена sod3.4 кукурузы может быть тесно ассоциирован с митохондриальной ДНК. Необходимость функционирования в митохондриях способной к ДНК-связыванию МпСОД может также определяться и экспериментально доказанной более высокой, по сравнению с ядерной ДНК, чувствительностью митохондриальной ДНК к мутагенному действию АФК [Wiseman, Halliwell, 1996].
5. Состояние исследований генов СОД у хвойных растений Изучение структурно-функциональной организации генов семейства СОД у представителей слабо изученных в этом отношении отдела Голосеменные (Gymnospermae) имеет важное значение с точки зрения выяснения путей эволюции структуры и функции этих генов у высших растений. В последнее время возрос интерес исследователей к изучению генов СОД у растений семейства хвойных Р тасеае, самой большой группы голосеменных, доминирующих в бореальных зонах северного полушария. Важно подчеркнуть, что для представителей хвойных характерно наследование митохондриального генома по материнской линии и наследование по отцовской линии хлоропластного генома [Palmer, 1992]. Подобный тип раздельного наследования цитоплазматических геномов мог иметь эволюционное влияние на структурную организацию отдельных генов семейства СОД у хвойных растений.
Результаты, полученные при исследовании генов СОД хвойных, демонстрируют перспективность продолжения работ на данных объектах. Так, именно сосна обыкновенная (Pinus sylvestris) стала первым растением, у которого помимо цитозольных и хлоропластиых ферментов СиЙпСОД был обнаружен и охарактеризован внеклеточный фермент с уникальными биохимическими особенностями [Streller, Wingsle, 1994]. Изучение генных семейств СОД хвойных до сегодняшнего дня было ограничено изучением генов СиМпСОД; данные по структуре и функции генов, кодирующих Fe- и МпСОД, получены не были. Помимо последовательностей кДНК данных генов, сейчас в электронных базах данных представлена только одна последовательность кДНК гена РеСОД сосны ладанной (Pinus taedd) [GenBank accession number AY536055], а данные по изучению генов МпСОД ограничены представленными в двух работах результатами биохимичекого анализа ферментов МпСОД сосны обыкновенной [Streller et al., 1994] и ели (Picea abies) [Kroniger et al., 1995]. Эти биохимические данные сами по себе не позволяют адекватно определить структуру генного семейства СОД хвойных. Данные по регуляции экспрессии и функции генов семейства СОД хвойных растений также мало представлены в научной литературе. 6. Итоги обзора литературы
Приведенные в обзоре литературы данные демонстрируют высокую функциональную значимость генов, кодирующих супероксиддисмутазы в клетках прокариот и эукариот. Биологическая роль генов СОД, согласно современным представлениям, не ограничивается исключительно функцией детоксикации одной из активных форм кислорода — супероксид-радикала. Гены СОД входят в большую генную сеть, работа которой определяет поддержание редокс-гомеостаза в клетке и участвует в регуляции ключевых клеточных процессов. Несмотря на все более возрастающий интерес исследователей к изучению генов СОД растений, можно утверждать, что эволюция, регуляция и функции их изучены недостаточно. Недостаток этих данных определяется в первую очередь неполной охарактеризованностью структуры и работы генных семейств СОД растений, в том числе активно изучаемых видов — резуховидки и кукурузы.
Основные данные по изучению структурно-функциональной организации генов семейства СОД были получены на растениях из отдела Покрытосеменные, в то время как другие систематические группы высших растений практически не были охвачены. Изучение генов СОД растений таких таксономических групп, как, например, хвойные голосеменные растения, позволит внести большую ясность в общую картину эволюции структуры и функции генов семейства СОД растений.
Секвенирование и сравнение кДНК ИеСОД кукурузы с высокогомологичными последовательностями других растений
Анализ транслированной аминокислотной последовательности и исходной нуклеотидной последовательности подтвердил соответствие секвенированного фрагмента кДНК гену РеСОД. Поиск в электронных базах данных позволил обнаружить ряд высоко гомологичных нуклеотидных последовательностей кДНК РеСОД других видов. Наиболее высокий уровень гомологии (85%) с секвенированной нами последовательностью демонстрировали кДНК гена РеСОД риса (Oryza saliva, GenBank accession numbers: XM_550626, XM_493744, AK071301, AK062073, AB014056). В результате поиска также была обнаружена последовательность EST кукурузы (GenBank accession number AY112450) с еще более высокой гомологией, составлявшей 95%. Эти данные позволили нам сделать заключение, что секвениро ванная нами последовательность является частью кДНК гена РеСОД кукурузы, и поместить ее с соответствующей аннотацией в электронные базы данных EMBL/GenBank (accession number AJ854254). Позднее правомочность сделанного нами вывода была подтверждена группой ученых из Японии, которые секвенировали и поместили в базу данных GenBank последовательность полноразмерной кДНК гена РеСОД кукурузы сорта Hony Bantam (accession number АВ201543).
Как уже говорилось в обзоре литературы [глава 4], ранее высказывалось предположение о том, что эволюционно более древние гены РеСОД у большинства видов растений могли быть функционально замещены генами СийпСОД. Эта гипотеза была основана на том, что изначально именно гены, кодирующие Си/7пСОД хлоропластной локализации, были обнаружены у многих растений, в то время как гены хлоропластных РеСОД у ряда активно изучаемых видов долгое время не удавалось идентифицировать. Со временем данное предположение неоднократно ставилось под сомнение по мере расширения числа видов растений, у которых были выявлены гены РеСОД. Тем не менее, гипотеза о возможности замещения функции генов РеСОД генами СиЙпСОД не могла быть окончательно отвергнута, поскольку до сегодняшнего дня не было получено данных по структуре генов РеСОД у таких интенсивно изучаемых культурных злаковых растений, как Zea mays и Triticum aestivum.
Помимо полученных экспериментальных данных, позволивших доказать существование гена РеСОД у Zea mays, нами была предпринята попытка доказать наличие соответствующего гена и у Triticum aestivum. С этой целью был проведен поиск в электронных базах данных EST растений последовательностей кДНК, гомологичных кДНК Zea mays. В результате поиска нам удалось идентифицировать 42 последовательности EST, соответствующих, по всей видимости, кДНК гена РеСОД Triticum aestivum. На основе анализа множественного выравнивания последовательностей EST Triticum aestivum и кДНК гена РеСОД Zea mays удалось воссоздать неполную в 5 -области консенсусную последовательность кДНК соответствующего гена Triticum aestivum, которая далее была транслирована в аминокислотную последовательность.
Аналогичным образом была получена частичная последовательность кДНК гена РеСОД еще одного представителя злаковых растений — сорго {Sorghum bicolor).
Обнаружение данных последовательностей кДНК РеСОД Zea mays, Triticum aestivum и Sorghum bicolor позволяет нам опровергнуть предположение о полном функциональном замещении генов РеСОД генами СиЙпСОД и предложить два возможных объяснения того факта, что данные гены и кодируемых ими ферменты долгое время не удавалось выявить у ряда растений.
Первое объяснение связано с возможной камбиалистической природой ферментов FeCOfl растений. Основанием для данного предположения служит как неоднородность этой группы ферментов бактерий, которые могут быть более близкими по первичной структуре и Fe- и Мп-содержащим белкам, так и первые представленные в литературе данные о камбиалистичности фермента МпСОД эукариотического организма — камфорного дерева {Cinnamomum camphord) [Chen et al., 2002]. Эти факты предполагают, что камбиалистические ферменты могут быть не только эволюционно переходной формой между Fe- и МпСОД, но и могут случайным образом появляться в разных ветвях эволюционного древа в результате структурных изменений Fe- или МпСОД.
Второе объяснение связано с особенностями экспрессии генов РеСОД растений, т.е. возможной ткане-, стадие- и/или стрес соспецифичностью экспрессии данных генов на фоне конститутивной экспрессии генов, кодирующих хлоропластные Си/гпСОД.
С целью оценки возможной камбиалистической природы Fe- и МпСОД растений было проведено множественное выравнивание представленных в электронных базах данных 190 аминокислотных последовательностей Fe- и МпСОД прокариот и эукариот, из которых 10 соответствовали ферментам, камбиалистическая природа которых была установлена с помощью биохимических методов. На основе сравнительного анализа данных последовательностей удалось выявить ряд высококонсервативных аминокислотных остатков, различающихся у Fe- и МпСОД. Для большей части этих аминокислот ранее была уже определена их роль в формировании четвертичной структуры белка и реализации ферментативной функции (табл. 3).
Получение, секвенирование и контекстный анализ З'-концевых последовательностей кДНК генов СиЙпСОД лиственницы
Оли гону клеотидные праймеры chcscl/chcspr2 были использованы для получения соответствующих фрагментов кДНК генов СиЙпСОД L. sibirica и L. gmelinii, которые после очистки элюцией из геля были секвенированы на автоматическом секвенаторе. Контекстный анализ нуклеотидных и транслированных по ним аминокислотных последовательностей секвенированных ОТ-ПЦР продуктов показал, что они соответствуют генам Си/гпСОД.
Как уже говорилось выше, согласно данным по анализу изоферментного спектра Larix sibirica и L. gmelinii, гены Си/2пСОД у растений рода Larix должны быть представлены более чем одной копией. В пользу данного предположения также свидетельствует и тот факт, что у другого вида хвойных - сосны обыкновенной - было идентифицировано три гена Cu/ZnCOfl, кодирующих хлоропластную, цитозольную и внеклеточную изоформы фермента [Streller, Wingsle, 1994; Schinkel et al., 2001; Karpinski et al., 1992]. «Универсальность» использованных в наших экспериментах олигонуклеотидов (рис.4) предполагает, что образующийся в ОТ-ПЦР фрагмент кДНК (рис. 6) может быть полиморфным, т.е. содержать близкие по размеру фрагменты кДНК разных генов Сш%іСОД Larix sibirica и L. gmelinii, а секвенированные последовательности соответствуют «консенсусным» последовательностям кДНК генов СиЙпСОД лиственницы. В связи с этим в дальнейшем для выявления транскриптов отдельных генов Си/%іСОД двух видов Larix было использовано два основных подхода получение и секвенирование 3 -концевых последовательностей генов СиЙпСОД с помощью методов 3 RACE и 5 RACE, а также анализ участков геномной ДНК, содержащей вариабельные некодирующие последовательности интронов. Получение, секвенирование и контекстный анализ З -концевых последовательностей кДНК генов Cu/ZnCOfl лиственницы На основе секвенированных последовательностей фрагментов кДНК генов Си/2пСОД двух видов Larix были подобраны специфичные праймеры для использования в экспериментах, направленных на получение и клонирование З -концевых фрагментов кДНК интересующих нас генов СиЙпСОД L, sibirica и L. gmelinii с использованием З -RACE метода. В результате этих экспериментов были получены различающиеся по размеру ( 500 и -600 п.н.) 3 -концевые фрагменты кДНК СиЙпСОД генов для двух видов Larix.
Для доказательства соответствия данных фрагментов искомым кДНК генов Сп пСОД было осуществлено определение их 5 -концевой последовательности путем секвенирования. Анализ секвенированных последовательностей показал, что все продукты З -RACE соответствовали кДНК генов Си/2пСОД. Для определения полноразмерных последовательностей З НТП продукты 3 RACE после электрофоретического разделения в агарозном геле были элюированы и клонированы в составе плазмиды pBlueScriptKS(+) по сайту рестрикции EcoRV.
По результатам трансформации было отобрано 11 белых колоний, которые далее были проанализированы на наличие встройки и ее ориентацию в составе плазмиды с помощью ПЦР с комбинациями специфичных и универсальных праймеров. В итоге такой оценки было отобрано четыре клона со встройкой кДНК гена Си/ пСОД (рис. 10). Выделенная из клонов плазмидная ДНК после очистки использовалась в экспериментах по секвенированию.
Анализ с помощью выравнивания секвенированных З -концевых последовательностей кДНК CulZnCOJ\ двух видов лиственницы показал, что из четырех клонированных последовательностей три существенно различаются по структуре З НТП. Поиск высокогомологичных последовательностей в электронных базах данных позволил выявить ряд близких по структуре последовательностей EST другого вида хвойных -сосны ладанной {Pinus taeda) и кДНК генов Си пСОД сосны обыкновенной {Pinus sylvestris). На рис. 11 приведено множественное выравнивание секвенированных последовательностей кДНК Си/7пС0Д Larix sibirica, L. gmelinii и соответствующих областей кДНК Си/ТлСОД P. taeda и P. sylvestris. Согласно результатам поиска гомологичных последовательностей и приведенного на рис. 11 выравнивания только одной из трех различных последовательностей 3 -концов кДНК генов CuiZnCOJX Larix sibirica, L. gmelinii соответствуют близкие по структуре З НТП к ДНК Р, sylvestris и Р. taeda.
Соответствующая кДНК P. sylvestris, как было показано в работе [Karpinski et al., 1992], кодирует хлоропластный фермент, что позволяет предположить возможную хлоропластную локализацию также и для ферментов Си/2пСОД лиственницы, кодируемых полученными нами кДНК. В целом, группа хлоропластных Си пСОД может быть выделена из общей группы Cu/ZnCOJl растений, основываясь на различиях аминокислотных последовательностей данных ферментов и ферментов цитозольной или внеклеточной локализации [Fink, Scandalios, 2002]. Для подтверждения этого предположения был проведен сравнительный анализ небольших транслированных аминокислотных последовательностей всех четырех кДНК Си/7пСОД двух видов Larix и соответствующих последовательностей ферментов различной субклеточной локализации других растений. На рис.12 приведено выравнивание аминокислотных последовательностей данных фрагментов, согласно которому транслированные аминокислотные последовательности секвепированных кДНК Cu/ZnCOfl лиственницы близки по структуре соответствующим последовательностям хлоропластных ферментов и существенно отличаются от последовательностей ферментов другой локализации. Таким образом, анализ нуклеотидных и соответствующих им аминокислотных последовательностей кДНК генов Си/7пСОД двух видов лиственницы показал, что кДНК генов Си пСОД L. gmelinii и L. sibirica, по всей вероятности, кодируют различающиеся несколькими аминокислотами в С-концевой части ферменты хлоропластной локализации.
