Введение к работе
Актуальность проблемы. Исследование регуляции метаболических оцессов организма является одним из приоритетных направлений разви-я физиологии и биохимии растений. Известно, что в сопряжении важ-йішх метаболических путей растительной клетки центральную роль иг-ют малат и цитрат, которые неравномерно распределяются в ее ксм-ртментах (Lance,Rustin,1984; Hiedziela et al.,1993), что обусловле-возможной раздельной регуляцией двух половин цикла трикарбоновкх слот и различием их интенсивностей. Каждая половина цикла связана своим депо и колебания между ними могут быть обусловлены балансом оростей двух его ветвей: реакций ЦТК от сукцинил КоА до оксалоаце-га и от цитрата до 2 оксоглутарата. Главнее депо цикла Кребса обыч-представлено малатом, но во многих растениях второй по интенсивен накопления кислотой является цитрат. Между этими пулами зозмоя-колебания, причем при интенсификации биосинтетических процессов гут усиливаться накопление цитрата и расход малата (Игамберди-,1995).
Изменения концентрации названных интермедиатов обусловливаются гивностью, каталитическими характеристиками, изоферментным составом зубклеточной локализацией ферментов, осуществляющих их биокаталити-:кое превращение. Доминирующую роль в метаболизме малата играет ма-гдегидрогеказная система, включающая две оксидоредуктазы: НАД-зази-лую малатдегидрогеназу (К.Ф. 1.1.1.37, МДГ), и НАДФ-зависимую ма-гдегидрогеназу (К.Ф. 1.1.1.82, НАДФ-МДГ) и две декарбоксилирующих натдегидрогеназы - НАД- (К.Ф. 1.1.1.39, НАД-МЭ) и НАДФ-зависимую Ф. 1.1.1.40, НАДФ-МЭ). Основная роль в утилизации и регуляции на-іления цитрата принадлежит аконитатгидратазе, или аконитазе (К.Ф. 2.1.3, АГ).
В последнее время МДГ и АГ являлись объектами значительного ко-гества исследований. Однако основное внимание было уделено изучению гих ферментов из животных и микроорганизмов, что обусловлено большей ітупностью и меньшими методическими трудностями при выделении и їсткє. Исследования езойств МДГ и АГ из растений малочисленны. Это ;зано, в частности, с тем, что при гомогенизации растительного нажала происходит освобождение и выход из вакуолей клеточного сока с жим значением рН, таннинов, полифенолоксидаз, протеаз, понижающих логическую активность фермента.
В растительной клетке число ферментов и их молекулярных форі, обладающих малатдегидрогеназной и аконитазной активностью, значитель но больше, чем у животных и микроорганизмов. Сложная компартментаці растительной клетки и наличие множества альтернативных метаболически путей приводит к появлению динамического равновесия между различныь изоформами этих ферментов. До сих пор отсутствует полная карти? субклеточной локализации множественных молекулярных форм МДГ и АГ, і каталитических свойств, регуляции генезиса и роли в сопрякении основ ных физиологических процессов в растениях, а имеющиеся сведения требуют дальнейшей систематизации и осмысления.
Для решения данных проблем необходимо развитие исследований г изучению каталитических и физико-химических характеристик отдельш молекулярных форм МДГ и АГ, что позволит приблизиться к понимании регуляции связанных с этими изоформами метаболических путей, протекг ющих в различных компартментах клетки. Вместе с тем,-это дает возмоя ность понять механизмы раздельной регуляции двух половин цикла Кребс и физиолого-биохимическую роль малатдегидрогеназной и аконитатгидра-тазной систем, в адаптации растительного организма к изменению факте ров внешней среды.
Цель и задачи исследования. Целью диссертационной работы являет ся исследование физиолого-биохимических характеристик малатдегидроге назной и аконитазной систем высших растений: выяснение их распространения, особенностей тканевой и субклеточкой локализации, изофер-ментного спектра, механизмов регуляции и каталитических свойств отдельных изоферментов, их роли в различных процессах растительной клетки и в адаптации к изменениям факторов внешней среды.
Исходя из цели были поставлены следующие задачи:
изучить распространение, генезис активности, видовую и тканев^ специфичность субклеточной локализации МДГ и АГ;
исследовать влияние факторов внешней среды (свет, газовый состав, засоление, температура) на функционирование малатдегидрогеназной аконитазной ферментных систем и выяснить их роль в адаптивной реаі ции растительного организма ;
провести исследование механизмов биосинтеза митохондриальной МДГ
разработать эффективные методы получения и стабилизации гомогенны) препаратов изоферментов МДГ и АГ из различных растений и способы і длительного хранения;
изучить возможность индуцированного синтеза МДГ и АГ под действие
экзогенных органических кислот;
изучить и сравнить физико-химические свойства, аминокислотный состав отдельных изоферментов;
исследовать каталитические свойства и метаболитную регуляцию активности МДГ и АГ;
разработать на основании свойств различных изоферментов МДГ и АГ модель регуляции метаболических процессов в клетке на уровне ферментных систем, обусловливающей адаптивные возможности растений к изменению фактора внешней среды.
Научная новизна работы. В результате проведенных исследований зучено распространение, генезис активности изоферментов малатдегид-)геназы и аконитатгидратазы в онтогенезе высших растений. Показана ідовая и тканевая внутриклеточная специфичность активности и изофер-штногс состава, обусловленная интенсивностью протекания метаболи-гских процессов и типом обмена на разных этапах развития. Установде-), что малатдегидрогеназная система большинства растений обладает ільшей вариабельностью активности и спектра множественных молекуляр-.IX форм, чем аконитатгидратазная.
Впервые показана адаптивная реакция изучаемых ферментных систем экстремальным условиям внешней среды, которая проявлялась в изкене-ш активности и увеличении количества изоферментов МДГ. С помощью щиоактивных предшественников и применения специфических ингибиторов юсинтеза белка установлено, что образование новых изоформ связано с : синтезом de novo. Показано, что одним из возможных путей адаптации юших растений к стрессовым условиям является интенсификация мобили-щии пула малата через оксидоредуктазные и декарбоксилирующие малат-ігидрогеназьі.
Впервые обнаружена возможность индуцированного синтеза изучаемых фментов в высших растениях. Для малатдегидрогеназы установлена гбстраткая индукция новых дополнительных изоформ. С помощью радиои-ітопного анализа ферментативных фракций, полученных в ходе очистки [Г и АГ, выращенных в присутствии индуктора, показано, что имеет :сто синтез фермента de novo.
Разработаны эффективные способы выделения и получены электрофо-ітичєски гомогенные препараты изоэнзимов малатдегидрогеназы и акони-.тгидратазы из митохондрий, глиоксисом, цитоплазмы и этиопластов задающих органов кукурузы, клещевины и гороха. Кроме того, впервые їла очищена индуцированная цитоплазматическая изоформа МДГ из щитка
кукурузы. Анализ аминокислотного состава и физико-химических свойсті показал, что выделенные молекулярные формы МДГ представляют собой ш тинные изоферменты.
Проведены исследования свойств и дана сравнительная характерні тика различно компартментализованных форм МДГ и АГ. Показано, что д. разных кзоферментов, наряду со сходньми чертами, характерны существ; ные отличия (рН-оптшум, сродство к субстратам, температурный опті мум, чувствительность к различным интермедиатам метаболизма). Вперві установлено, что индуцированная форма МДГ из кукурузы обладает бол! высоким сродством к малату и более низким - к оксалоацетату.
Показано участие хондриома в синтезе гетерологического митохон; риального изофермента МДГ. Полученные результаты указывают на биосш тез "тяжелой" субъединицы энзима в этих органеллах под контролем м; тохондриальной ДНК.
На основе проведенных экспериментальных исследований механизмо; функционирования и регуляции биосинтеза различных изоферментов Mj предлагается модель участия ферментативной системы в адаптивной -реакции к изменению условий окружающей среды.
Практическая значимость. Разработанные способы выделения и пол; чения электрофоретически гомогенных изоферментов МДГ и АГ из расті тельных источников могут быть широко использованы для получения прг паратов ферментов в производственных и лабораторных условиях. Высок( очищенные препараты, получаемые данным способом, имеют удельную акті ность и чистоту, соответствующие характеристикам МДГ и АК выпускаемым, фирмой "Sigma". Найдены оптимальные условия хранения МДГ в прі сутствии эффективных стабилизаторов, позволяющих сохранять активное: фермента в течение года без значительных потерь. Разработанные схеї выделения и хранения характеризуются целым рядом преимуществ (дешевизна, простота, эффективность хранения) по сравнению с другими методами.
Полученные ферментные препараты могут быть использованы в нау< но-исследовательских лабораториях для регенерации НАД или НАДН, д. изучения других энзиматических систем или для моделирования in vlti надмолекулярных систем клетки. Кроме того МДГ может использоваться медицине для биохимических анализов и в пищевой промышленности д: изучения качества продуктов.
На основе полученных данных по тканевой, сортовой и видовой сш цифичнести, а также по характеру ответной реакции малатдегидрогена:
ой системы на стрессовые воздействия возможна разработка биотестов ля индикации экологических нарушений в растительных сообществах и ^пользование изоферментов как маркеров в селекционных исследованиях систематической классификации растений.
Практическая значимость работы состоит в расширении и углублении редставлений о роли изоферментов в адаптационных реакциях растений, изменению факторов внешней среды. Кроме того, полученные данные пособствуют пониманию организации и регуляции клеточного метаболиз-а, что монет способствовать разработке путей повышения продуктизнсс-л высших растений и их устойчивости к стрессовым воздействиям.
Результаты исследований вошли в курсы лекций по физиологии рас-эний и биохимии, а также спецкурсы по фотосинтезу, дыханию растений, нзимологии, читаемых в ряде ВУЗов. Оки используются при проведении зактикумов и выполнении дипломных работ.
Апробация работы. Основные результаты исследований, выполненных зторсм з период 1Э77-1995ГГ., докладывались и обсуждались на между-ародных, всесоюзных, республиканских и региональных конференциях, ни были представлены на 19-м (Рим,Италия.1989) 20-м (Будапешт,Венг-;ія,1990) и 23-м (Базель, Швейцария) Конгрессах Федерации Европейских лохимических обществ; на 7-м (Умео,Швеция,1990), 8-м (Антвер-зн,Бельгия,1992) и 9-м (Брно,Чехия,1994) Конгрессах Федерации Евро-эйских обществ физиологов растений; на 4-м Международном Конгрессе о молекулярной биологии растений, Амстердам, Голландия,1994;на 10-м эждународном фотосинтетическом конгрессе (Монпелье, Франция, 1995), і 6-м объединенном симпозиуме биохимических обществ СССР и ГДР (Таллин, Эстония,1981); на 2-м (Минск,1990) и 3-м (Санкт-Петербург,1993) зесоюзкых съездах физиологов растений;.на 8-м Всесоюзном биохимичес-эм съезде (Киев,1986), на 8-м делегатском съезде Всесоюзного ботани-еского общества (Алма-Ата, 1988). на 4-ой (Алма-Ата,1978). 6-й и 7-ой чьвов,1980,1984) Всесоюзной конференции го фотоэнергетике растений; а Всесоюзной конференции "Проблемы физиологии и биохимии древесных астений" (Красноярск,1982), на 4-ой и 5-ой Всесоюзной конференции по -юлогии клетки (Тбилиси.1985,1987), на 6-ой и 7-ой Всесоюзной кокфе-энции "Иониты" (Воронеж,1986,1991); на 4-ой Всесоюзной конференции Физиология растительной клетки" (Минск,1990); на Международней науч-ул конференции "Регуляторы роста и развития растений" (Москва,1993); а Международной научней конференции "Промышленная ботаника: состоите и перспективы развития" (Донецк,1993); на межреспубликанской на-
учно-технической конференции "Проблемы азотистого метаболизма" (Во гоград, 1990); на 13-16-й конференциях молодых ученых МГУ (Мое ва, 1982-1985); на 2-й Всесоюзной конференции молодых ученых по физи логии растительной клетки (Москва.1986); на заседаниях Воронежско отделения Всесоюзного общества физиологов растений и Всесоюзного би химического, общества (1985,1988) и на ежегодных научных конференци Воронежского госуниверситета.
Публикации. Основные результаты настоящей диссертационной рабо изложены в двух монографиях и в более 60 публикациях.
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 457 страница машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, экс риментальной части к обсуждения результатов, заключения, выводо списка литературы (351 источник) к приложения. Иллюстрационный материал включает 117 рисунок, 58 таблиц.
