Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы
1.1 Окислительный стресс, причины его возникновения и роль в жизнедеятельности растительной клетки 11
1.2 Влияние неблагоприятных факторов среды на перекисный го меостаз растений 37
2. Объект и методы исследования
2.1 Объект исследований и постановка опытов 50
2.2 Анализ продукции активных форм кислорода и накопления продуктов липопероксидации 51
2.3 Анализ активность антиоксидантных ферментов и уровня низкомолекулярных антиоксидантов 53
2.4 Анализ состава полярных липидов хлоропластов 56
2.5 Статистическая обработка полученных результатов 58
3. Результаты и их обсуждение
3.1 Продукция активных форм кислорода и процесс липоперок сидации в хлоропластах гороха при действии факторов различной природы 59
3.2 Влияние абиотических стрессоров на антиоксидантный статус изолированных хлоропластов 91
3.3 Состав полярных липидов хлоропластов гороха в условиях окислительного стресса 124
Заключение 144
Выводы 146
- Влияние неблагоприятных факторов среды на перекисный го меостаз растений
- Анализ продукции активных форм кислорода и накопления продуктов липопероксидации
- Статистическая обработка полученных результатов
- Влияние абиотических стрессоров на антиоксидантный статус изолированных хлоропластов
Введение к работе
Актуальность проблемы. Исследование молекулярных механизмов развития стресс-реакции растений и формирования адаптации к изменяющимся условиям окружающей среды приобретает особую актуальность в связи с непрерывно ухудшающейся экологической обстановкой. Установление закономерностей ответа растительного организма на экстремальные воздействия, выявление общих и специфических черт действия различных стрессоров необходимо для создания теоретической основы последующих практических разработок в области повышения устойчивости растений к неблагоприятным условиям.
Наличие значительной качественной аналогии в многообразии физиологических реакций растений на различные типы воздействий позволяет предположить существование единого звена, общих принципов и механизмов в формировании стрессового ответа (Пахомова, 1995; Тарчевский, 2000; Шакирова, 2001). В качестве такого универсального компонента может рассматриваться окислительный стресс, развитие которого к настоящему времени показано при действии на растения самых разнообразных факторов: засухи, засоления, гипо- и гипертермии, вирусной и бактериальной инфекции (Gogorcena et al., 1995; Курганова и др., 1997, 1999; Blumwald, Aharon, Lam, 1998; Chen, Li, 2001; Hernandez et al., 2001). В фототрофных тканях окислительный стресс, характеризующийся усилением продукции активных форм кислорода (АФК), в первую очередь связан с хлоропластами, а именно, с функционированием фотосинтетической электрон-транспортной цепи, ответственной за генерацию значительной части АФК в растительной клетке (Мерзляк, 1989; Foyer et al., 1997). Увеличение продукции АФК в стрессовых условиях приводит к активации окислительных процессов, в том числе пере-кисного окисления липидов (ПОЛ), протекающего в норме на определенном стационарном уровне (Владимиров, Арчаков, 1972; Барабой и др. 1992; Becana, Moran, Iturbe-Ormaetxe, 1998). Интенсификация ПОЛ способна привести к изменению свойств липидного матрикса мембран и модификации метаболизма всей клетки, однако его воздействие существенно ограничивается за счет работы антиоксидантнои (АО) системы, включающей ферменты и низкомолекулярные соединения (Меньшикова, Зенков, 1993; Alscher, Donahue, Cramer, 1997; Noctor, Foyer, 1998). С другой стороны, одним из важнейших факторов, определяющих скорость развития неферментативных радикальных реакций переокисления, является липидный состав мембран, в связи с чем его важная роль при различных экологических условиях не вызывает сомнения (Бурлакова, Храпова, 1985; Corbineau et al., 2002).
Всё вышесказанное обуславливает несомненную значимость исследования взаимосвязи изменений продукции АФК, перекисного окисления ли-пидов, работы АО-системы и липидного состава мембран хлоропластов при действии тех или иных стрессоров. В последние годы появились публикации, в которых проведено сопоставление ответных реакций растений на различные экстремальные факторы окружающей среды (Dat et al., 1998; Iturbe-Ormaetxe et al., 1998; Iannelli et al., 1999; Clarke et al., 2002). Однако, несмотря на постоянно увеличивающееся количество работ, посвященных данной проблеме, вопрос о механизмах, лежащих в основе ответа на действие стрессоров, а также о степени неспецифичности реакции растительного организма и возможных специфических чертах, зависящих от природы и интенсивности воздействия, остается открытым, что обуславливает актуальность проведенного исследования.
Цель и задачи исследования. Цель работы состояла в определении общих и специфических черт ответа прооксидантно-антиоксидантного баланса хлоропластов на действие различных по своей природе стрессирующих абиотических факторов среды.
Для достижения сформулированной цели были поставлены следующие задачи: 1. Провести сравнительный анализ продукции АФК, как показателя окислительного стресса, и накопления продуктов ПОЛ в хлоропластах при действии стрессоров различной природы - высокой температуры, экзогенного пероксида водорода, фотодинамического гербицида параквата и низкоинтенсивного ионизирующего излучения.
2. Оценить активность пластидных антиоксидантных ферментов в условиях действия данных абиотических факторов.
3. Исследовать динамику основных низкомолекулярных антиоксидан-тов хлоропластов при экстремальных воздействиях для выявления их роли в системе АО-защиты.
4. Определить влияние неблагоприятных факторов среды на состав полярных липидов как один из важнейших аспектов поддержания структурно-функциональной целостности хлоропластов.
5. Провести сопоставление ответа прооксидантно-антиоксидантого статуса хлоропластов на действие отдельных стрессоров для выявления универсальных и специфических черт стрессовой реакции.
Основные положения, выносимые на защиту:
Индукция ПОЛ и относительное накопление тех или иных продуктов липопероксидации зависят не только от усиления генерации активных форм кислорода как такового, но и от соотношения различных типов продуцируемых АФК.
Изолированные хлоропласта гороха способны к дополнительному адаптивному усилению активности ряда АО-ферментов (супероксиддисмута-зы, глутатионтрансферазы).
Существует по меньшей мере две стратегии поддержания пластидного пула восстановленного глутатиона (GSH): за счет работы системы рециклирования, а также за счет "экстренного" увеличения общего содержания глутатиона в хлоропластах при снижении концентрации GSH ниже "критического" уровня. Окислительный стресс, развивающийся в хлоропластах при действии различных неблагоприятных факторов среды, вызывает быстрые однотипные сдвиги в относительном содержании фракций полярных липидов, направленные на стабилизацию мембранных структур и защиту фотосинтетического аппарата.
Ответ прооксидантно-антиоксидантного равновесия хлоропластов на экстремальные абиотические воздействия обладает определённой степенью неспецифичности, однако, тем не менее, существенно зависит от природы и интенсивности стрессора.
Научная новизна.
В работе впервые установлена роль соотношения различных активных форм кислорода (Ог и Н202) в индукции окислительных процессов в мембранах хлоропластов.
Выявлены особенности воздействия на хлоропласты гороха гипертермии, обработки экзогенным пероксидом водорода и фотодинамическим гербицидом паракватом, а также впервые продемонстрировано влияние малых доз ионизирующей радиации в дозах 75-300 мкГр на супероксид-продуцирующую способность, липопероксидацию, активность антиокси-дантных ферментов и липидный состав хлоропластов.
Впервые показана возможность активации в изолированных хлоропластах супероксиддисмутазы и глутатионтрансферазы, в условиях, исключающих возможность дополнительного синтеза этих ферментов.
Продемонстрирована способность хлоропластов к увеличению пула глутатиона за счет собственных пластидных ресурсов.
Исследована динамика состава полярных липидов хлоропластов при кратковременных экспозициях различных воздействий (гипертермии, экзогенного пероксида водорода, параквата и малых доз радиации) и показана взаимосвязь окислительного стресса и липидного состава мембран хлоропластов. Теоретическая и практическая значимость. Полученные результаты вносят вклад в развитие современных представлений о биохимических механизмах формирования стрессового ответа растительного организма на экстремальные воздействия окружающей среды. Исследование функциональной взаимосвязи продукции АФК, процесса ПОЛ, работы АО-системы и липид-ного состава мембран, а также выявление специфических и универсальных черт ответа хлоропластов на действие абиотических стрессоров открывают перспективы дальнейшего изучения роли окислительного стресса в жизнедеятельности клетки, а кроме того, важны для разработки новых подходов к повышению устойчивости растений к неблагоприятным условиям.
Основные выводы и результаты работы могут быть использованы в учебном процессе на биологических факультетах университетов, сельскохозяйственных и педагогических вузов.
Апробация работы. Основные результаты работы доложены на Международной конференции по фундаментальным наукам среди студентов и аспирантов "Ломоносов-2000" (Москва, 2000), Международном симпозиуме "Plants under Environmental stress" (Москва, 2001), Международной конференции "Актуальные вопросы экологической физиологии растений" (Сыктывкар, 2001), III съезде биохимического общества (Санкт-Петербург, 2002), XIV зимней международной молодежной научной школе "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии" (Москва, 2002), 3-ей Международной конференции молодых ученых и студентов "Актуальные проблемы современной науки" (Самара, 2002), Всероссийской научно-практической конференции "Физиология растений и экология на рубеже веков" (Ярославль, 2003), конференции "Экологическая и промышленная безопасность" (Саров, 2003), II научной городской межвузовской конференции (Нижний Новгород, 2003), Международной конференции "Актуальные вопросы ботаники и физиологии растений" (Саранск, 2004), Международной научной конференции "Проблемы физиологии растений Севера" (Петрозаводск, 2004), 6-ой, 7-ой и 8-ой Пущинской школе-конференции молодых ученых "Биология - наука 21-го века" (Пущино, 2002, 2003, 2004), 6-ой, 7-ой, 8-оЙ и 9-ой Нижегородских сессиях молодых ученых (Нижний Новгород, 2001, 2002, 2003, 2004) и 3-ей Всероссийской молодежной научной конференции по фундаментальным проблемам радиохимии и атомной энергетики (Нижний Новгород, 2004).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано и направлено в печать 26 работ.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, методов исследований, результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы (427 работ, в том числе 308 иностранных). Работа изложена на 192 страницах, содержит 36 рисунков и 8 таблиц.
Влияние неблагоприятных факторов среды на перекисный го меостаз растений
Растения, как и все другие живые организмы, постоянно испытывают различные воздействия со стороны окружающей среды, как благоприятные, так и зачастую неблагоприятные, координируя свой метаболизм в соответствии со множеством действующих в каждый данный момент факторов, всё многообразие которых можно разделить на биотические и абиотические. При этом к первым относятся взаимодействия растения с патогенными и симбио-тическими микроорганизмами, в том числе вирусами, бактериями, грибами, а также их повреждение растительноядными видами животных всех размеров, от насекомых и клещей, до крупных млекопитающих. Среди абиотических факторов наибольшее значение для растений приобретает воздействие различных видов излучений (солнечная, УФ, ионизирующая радиация, электромагнитное излучение), широкий ряд факторов, действие которых связано с водным статусом растительных клеток (засуха, гипо- и гипертермия, засоление), снабжение клеток и органов растений кислородом (гипо- и аноксия), токсическое действие тяжелых металлов, гербицидов и поллютантов воздуха, роль которых в существовании растительных видов в последнее время непрерывно возрастает в связи со всё увеличивающейся антропогенной нагрузкой на природные как наземные, так и водные экосистемы (Лархер, 1978; Викторов, Ремезова, 1988; Ибрагимов и др., 1998; Охапкин, Старцева, 2003). Абиотические и биотические стрессоры вызывают сдвиги в нормальных физиологических процессах и в то же время активируют системы адаптации к изменившимся условиям существования. Среди строго контролируемых растением процессов можно назвать прооксидантно-антиоксидантый баланс, важность поддержания которого для существования и функционирования растительного организма была рассмотрена ранее. Данное равновесие обладает значительной лабильностью, и его временное смещение может на- блюдаться в ответ на самые различные внешние воздействия (Alexieva et al., 2003; Mahalingam, Fedoroff, 2003; Wang, Vinocur, Altaian, 2003). Как отмечалось в предыдущей главе, перекисный, или прооксидантно-антиоксидантный, гомеостаз обуславливается существующим в организме балансом между продукцией активных молекулярных форм и их утилизацией при работе антиоксидантов ферментативной и неферментативной природы.
При этом смещение баланса может осуществляться как за счет увеличения образования АФК в тех или иных реакциях, так и вследствие ингибиро-вания защитной системы (Alscher, Donahue, Cramer, 1997). В индукции окислительного стресса в ответ на различные абиотические и биотические факторы окружающей среды можно выделить два основных принципа, в значительной степени отражающих сложность системы регуляции перекисного гомеостаза растений. Во-первых, один фактор может затрагивать несколько различных механизмов, ответственных за сдвиги в проок-сидантно-антиоксидантном равновесии. Такая картина наблюдается, в частности, при инфицировании растения патогенами, в случае которого происходит активация самых различных по своей природе ферментов, продуцирующих АФК, а кроме того, синтезируется салициловая кислота, ингибирующая работу некоторых изо форм катал азы и аскорбатпероксидазы (Wojtaszek, 1997; Лапикова, Гайворонская, Аверьянов, 2000). Во-вторых, несколько различных по своей природе факторов могут влиять на баланс про- и антиоксидантов по одному и тому же механизму, обуславливая значительную степень универсальности регистрируемого ответа растения на действие стрессоров (Iturbe-Ormaetxe et al., 1998; Wang, Vinocur, Altman, 2003). Быстрая индукция генерации супероксида и аккумуляция пероксида водорода являются характерными чертами раннего гиперчувствительного ответа на инфицирование растений бактериями и грибами. Множество работ свидетельствует, что окислительный взрыв при инфекции развивается вследствие активации мембраносвязанной НАДФН-оксидазы (Mithofer et al., 1997; Wojtaszek, 1997; Тарчевский, 2001; Sagi, Fluhr, 2001). Альтернативные механизмы развития окислительного взрыва связаны с рН-зависимыми перокси-дазами клеточной стенки, липоксигеназами, гермин/оксалат оксидазой и рядом других ферментов (Wojtaszek, 1997; Kauss et al., 1999; Papadakis, Roubelakis-Angelakis, 1999). При этом кинетика накопления Н202 носит двухфазный характер в случае авирулентного патогена и однофазный - в случае вирулентного (Lamb, Dixon, 1997). АФК не только непосредственно играют роль токсических для микроорганизмов агентов, но и служат субстратами в реакциях сшивки молекул клеточной стенки, выполняют функцию триггера гиперчувствительной клеточной смерти, а также являются способными к диффузии сигнальными молекулами, индуцирующими защитные гены окружающих клеток (Levine et al., 1994; Lamb, Dixon, 1997; Thordal-Christensen et al., 1997; Alvarez et al., 1998; Лапикова, Гайворонская, Аверьянов, 2000), Относительно их прямого антимикробного действия, к настоящему времени показано ингибирование прорастания спор грибов при действии окислителей, а также антимикробное действие глюкозоксидазы, продуцирующей Н2О2 при окислении глюкозы (Lamb, Dixon, 1997).
Пероксид водорода предположительно участвует в запуске синтеза фитоалексинов, фенила-ланин-аммониалиазы, хальконсинтазы (Thordal-Christensen et al., 1997). Кроме того, накоплены данные относительно активации генов глутатионтранс-феразы и глутатионпероксидазы, а также полиубиквитина (Lamb, Dixon, 1997). Активация окислительного взрыва в ответ на действие грибных и бактериальных элиситоров рассматривается как центральный компонент сложной интегрированной сигнальной системы, также включающей салициловую кислоту и модуляции концентрации цитозольного Са +, лежащие в основе запуска механизмов устойчивости к болезням (Camp, Montagu, Inze, 1996; Bol-well et al., 2002). Существенное накопление АФК при вирусной, бактериальной и грибной инфекции может вызвать развитие гиперчувствительной клеточной смерти, о чем упоминалось в предыдущей главе (п. 1.1), а также при- вести к формированию системной приобретенной устойчивости (английское "systemic acquired resistance", или SAR). В индукции последней важнейшую роль играет салициловая кислота (СК), концентрация которой увеличивается как локально в месте проникновения инфекции, так и в меньшей степени системно в целом растении (Бурханова, Федина, Кулаева, 1999; Pasqualini et al., 2002). Для СК показано ингибирование каталазы, аскорбатпероксидазы и некоторых других гемовых ферментов, что приводит к генерации салицилат-радикала и может служить сигналом для запуска защитных генов (Chen, Silva, Klessig, 1993; Wendehenne et al., 1998; Тарчевский, 2001). Миметиком СК может выступать сукцинат (Тарчевский и др., 1999). В некоторых случаях предполагается, что сигнальным посредником может служить производное СК - метилсалицилат (Anderson, Chen, Klessig, 1997). Тем не менее, точный механизм действия СК не установлен, существует значительное количество доказательств как в подтверждение, так и в опровержение предложенной точки зрения. Наконец, в недавнее время показано, что СК активирует про-теинкиназу (SIPK), относящуюся к семейству МАПКиназ (Nurnberger, Scheel, 2001).
Анализ продукции активных форм кислорода и накопления продуктов липопероксидации
Выделение хлоропластов. Навеска листьев растиралась в двукратном объеме среды выделения: 0,35 М NaCl в 0,05 М трис-HCl буфере, рН 7,8 (Arnon et al., 1956). Гомогенат отжимался через марлевый фильтр и центрифугировался 5 мин при 100 g для осаждения крупных фрагментов клетки. Супернатант для осаждения хлоропластов центрифугировался повторно 5-7 минут при 700 g. Осадок хлоропластов ресуспендировался в 0,035 М NaCl и использовался для дальнейших опытов. Оценка продукции Of. Скорость образования 02 оценивалась по реакции накопления продукта его взаимодействия с эпинефрином - адрено-хрома, согласно модифицированной методике А.В. Часова и др. (2002). Среда инкубации (3 мл) содержала 1 мМ эпинефрин и 300-400 мг хлоропласт-ного белка в среде ресуспендирования, рН 7,0. Через 15 минут экспозиции на свету реакция останавливалась внесением 50 мкл 0,05 М НС1. Продукция 02 рассчитывалась по накоплению адренохрома. М = Е480/(с-є 1), где с - концентрация белка в пробе, є - коэффициент молярной экстинкции (є = 4020 М"1" см"1), 1 - толщина кюветы (1 =1 см). Определение содержания пероксидов. Содержание пероксидных группировок определялось согласно методике Л.А. Романовой и И.Д. Стальной (1977) по реакции с роданистым аммонием. Для этого 2 мл суспензии помещалось в центрифужные пробирки, белок осаждался 0,2 мл 50% ТХУ и отделялся центрифугированием. После этого 1 мл надосадочной жидкости разводился 5 мл этанола, последовательно добавлялись 0,2 мл концентрированной НС1, 0,012 мл 5% соли Мора в 3% НС1 и строго через 30 секунд - 0,5 мл 20% роданистого аммония. Развивающаяся окраска спектрофотометриро-валась через 10 минут при 480 нм. Расчет концентрации пероксидов прово- дился по калибровочной кривой, построенной с использованием Н202, с последующим пересчетом на содержание белка. Определение содержания диеновых и триеновых конъюгатов. Методика определения конъюгации двойных связей в составе жирных кислот ли-пидов основана на появлении в их спектре новых максимумов поглощения в ультрафиолетовой области (Стальная, 1977). Для определения концентрации диеновых конъютатов 0,5 мл суспензии растиралось в 4,5 мл смеси гептан : изопропиловый спирт в соотношении ]: 1 и центрифугировалось 10 мин при 4 тыс. об/мин. К надосадочной жидкости добавлялось 0,1 объема воды для разделения фаз. К 0,5 мл верхней гептановои фазы добавлялось 2,5 мл этанола, после чего проводилось спектрофотометрирование против контроля (гептан : этанол в соотношении 1 : 5). Расчет ДК производился по формуле: ДК = Е232/(с-є1), где с - концентрация белка в пробе, є - коэффициент молярной экстинкции (є = 2,2 10" М" см" ), 1 - толщина кюветы (1 =1 см). Расчет ТК производился по формуле: ТК = Е272 / (с 1), их содержание выражалось в Е2?2 / мг"1 белка. Определение содержания малонового диальдегида.
Содержание малонового диальдегида (МДА) определялось на основе реакции взаимодействия этого соединения с тиобарбитуровой кислотой (ТБК) (Стальная, Гари-швили, 1977). К 1,5 мл суспензии хлоропластов добавлялось 1,5 мл Н20 и 1 мл 0,5% ТБК в 20% ТХУ. Пробирки помещались в кипящуто водяную баню на 30 минут. После охлаждения пробы отфильтровывались и фильтрат спек-трофотометрировался при 532 нм против контроля (3 мл Н20 и 1 мл 0,5% ТБК в 20% ТХУ). Содержание МДА рассчитывалось по формуле: МДА = Е532/(с-є-1), где с - концентрация белка в пробе, - коэффициент молярной экстинкции (е = 1,56 105 М"1 см"1), 1 - толщина кюветы (1 =1 см). 2.2 Анализ активности антиоксидантних ферментов и уровня низкомолекулярных антиоксидантов Определение активности супероксиддисмутазы. Активность СОД определялась по методике Е.Е. Дубининой, Л.А. Салтыковой и Л.Ф. Ефимовой (1983). Принцип метода основан на способности СОД конкурировать с нитросиним тетразолием (НСТ) за супероксидные анион-радикалы, образующиеся в результате аэробного взаимодействия восстановленного НАДН с феназинметасульфатом (ФМС). В результате этой реакции НСТ восстанавливается до гидразинтетразолия. В присутствии СОД процент восстановления НСТ уменьшается. В суспензию хлоропластов добавлялся 1 мМ (конечная концентрация) ЭДТА, после чего она центрифугировалась 20 минут при 20 000 g для разрушения мембранных структур и выхода ферментов в суспензию. Реакционная смесь содержала 1,2 мл 0,15 М фосфатного буфера, рН 7,8; 0,1 мл 0,16 мМ ФМС; 0,3 мл 0,61 мМ НСТ; 0,3 мл супернатанта. Реакция запускалась добавлением 0,2 мл 1 мМ НАДН. Активность фермента рассчитывалась по формуле: Т % = (ДЕ0- АЕпр) / Е0 Т00%, где Т % процент блокирования, АЕ0 - изменение экстинкции О-пробы (без суспензии) за 1 минуту при 540 нм, ДЕпр - изменение экстинкции исследуемой пробы за 1 минуту, Асод = (Т %) / (100 - Т %) / с где АСОд - удельная активность фермента, с - концентрация белка в пробе. Активность СОД выражалась в условных единицах мг"1 белка мин "\ Определение активности глутатионредуктазьи Активность ГР определялась по методу J. Iavata, U. Tanaka (1977). Принцип метода основан на уменьшении содержания НАДФН в результате восстановления окисленного глутатиона. Инкубационная смесь содержала 2мл 0,05 М К-фосфатного буфера (рН 8,0); 0,2 мл 1мМ ЭДТА; 0,2 мл исследуемого субстрата; 0,5 мл 7,5 мМ раствора окисленного глутатиона. Реакция запускалась ОД мл 6 мкМ НАДФН. Расчет активности фермента проводился по формуле: АГР = ДЕпр / (с є t), где АЕпр - изменение экстинкции пробы при 340 нм, с - концентрация белка в пробе, є - коэффициент молярной экстинкции НАДФН (є = 6,22 М"1 см"1), t - время инкубации, мин. Определение активности глутатионтрансферазы. Активность глута-тионтрансферазы определялась по методу W.H. Habig et al. (1974). Принцип метода основан на измерении количества образовавшегося под действием фермента конъюгата 1-С1-2,4-динитробензола с глутатионом. Реакционная смесь содержала 1,7 мл 0,1 М К-фосфатного буфера (рН 6,5); 0,2 мл 10 мМ раствора восстановленного глутатиона; ОД мл исследуемого субстрата. Реакцию запускали добавлением к смеси 0,02 мл ОД мМ раствора 1-С1-2,4-динитробензола.
Расчет активности фермента проводился по формуле: Агт = ДЕф / (с є t), где АЕпр - изменение экстинкции пробы при 346 нм, с - концентрация белка в пробе, є - коэффициент молярной экстинкции образовавшегося конъюгата (є = 9,6 мМ"1 см"1), t - время инкубации, мин. Определение глутатионового статуса хлоропластов. Содержание восстановленной и окисленной форм глутатиона оценивалось титрометриче-ски по методу Вудворда-Фрея (Удинцев и др., 1987). Принцип метода заключается в окислении глутатиона йодом по уравнению: 2GSH + I2 = GSSG + 2HI. Избыток йода определяется титрованием. Для получения устойчивых растворов йода применяется йодноватистый калий, а титрование ведут в присутствии йодистого калия в кислой среде. Реакция в этом случае идет по уравнению: КЮ3 + 5KI + 3H2S04 = 3K2S04+ 3H20 + 61. В колбу Эйлера на 50 мл помещалось 24 мл Н2О и 3 мл суспензии хло-ропластов, после тщательного перемешивания медленно приливалось при постоянном помешивании 3 мл 25% сульфосалициловой кислоты для осаждения белков. Через 5-Ю минут смесь отфильтровывалась в сухую колбу, 10 мл фильтрата бралось на анализ, а к оставшемуся добавлялось немного цинковой пыли, после чего он оставлялся не менее чем на полчаса при постоянном взбалтывании. После этого содержимое вновь отфильтровывалось и 10 мл отбиралось на анализ. В колбы с цинком (GSSG + GSH) и без него (GSH) добавлялось по 2,5 мл 4% сульфосалициловой кислоты, 5% KI и несколько капель 1% крахмала. Содержимое титровалось 0,001 N КЮз до появления светло-голубой окраски. Расчет концентрации глутатиона проводился согласно формуле; Глут = V a / V0, где V - объем КЮ3, пошедший на титрование пробы, Vo - объем КЮ3, пошедший на титрование 1 мМ GSH, а - разведение перед титрованием. Концентрация глутатиона пересчитывалась на единицу содержания белка. На основании определенной концентрации GSH и общего содержания глутатиона в пробе (GSSG + GSH) рассчитывалось содержание GSSG и отношение GSSG / GSH. Определение содержания каротиноидов. Содержание каротиноидов оценивалось спектрофотометрически в суммарной вытяжке пигментов. Суспензия хлоропластов (0,2 мл) растиралась в 100% ацетоне. Для полученной ацетоновой вытяжки определялась оптическая плотность при 644, 662 и 440,5 нм и проводился расчет содержания пигментов по формулам Хольма-Веттштейна для 100% ацетона (Методы..., 1987); Скар= 4,695 Е44о,5 - 0,268 (Ca+b), Ca+b- 5,134 Е662- 20,436 Е644, где Скар — концентрация каротиноидов и Са+ь — суммарное содержание хлорофилл ов. Определение содержания белка. Концентрация белка в суспензии определялась с феноловым реактивом Фолина (Lowry et al., 1951).
Статистическая обработка полученных результатов
Обработка полученных результатов производилась методами параметрической статистики (Гланц, 1998; Гавриленко, Жигалова, 2003). На рисунках представлены средние арифметические 3-6 независимых опытов, каждый из которых проводился в трехкратной биологической повторности, и их стандартные ошибки. Значимость различий оценивалась по критерию Стью-дента с поправкой Бонферрони для множественных сравнений с контролем и критерию Даннета. В случае исследования липидного состава использовался метод парных сравнений (п=12). Наличие значительной качественной аналогии в многообразии физиологических реакций растений на различные типы воздействий позволяет говорить о существовании в них неспецифической стрессовой компоненты. Роль такого универсального звена ответа растений на действие самых разнообразных факторов как биотической, так и абиотической природы может играть окислительный стресс (Барабой, 1991; Пескин, Столяров, 1994; Кис, 2001; Nurnberger, Scheel, 2001). Усиление продукции АФК, смещение проок-сидантно-антиоксидантного равновесия и, как следствие, накопление продуктов окислительной модификации макромолекул рассматриваются в качестве характерной черты ответа растений при действии высокой и низкой температур (Курганова и др., 1997; Chen, Li, 2001; Kocsy, Galiba, Brunold, 2001), засухи или водного стресса (Gogorcena et al., 1995; Yamaguchi-Shinozaki et al., 2002), засоления (Hernandez et al., 2001; Shalata, Neumann, 2001; Hernandez, Almansa, 2002; Xiong, Shumaker, Zhu, 2002), повышенных концентраций тяжелых металлов (Dixit, Pandey, Shyam, 2001; Romero-Puertas et al., 2002) и фотодинамических гербицидов (Iturbe-Ormaetxe et al., 1998; lan-elli et al., 1999). Окислительный стресс в целых растениях, клетках или отдельных клеточных компартментах индуцируется грибной и бактериальной инфекцией (Thordal-Christensen et al., 1997; Blumwald, Aharon, Lam, 1998; Muckenschnabel et al., 2002), экзогенными фитогормонами (Clarke et al., 2002; Pasqualmi et al., 2002), пероксидом водорода (Price et al., 1994; Sairam, Sri-vastava, 2000), различными видами излучения (A.-H.-Mackerness, Jordan, Thomas, 1999; Gaiatro, Simontacchi, Puntarulo, 2001; Hideg et al., 2001). Однако остается открытым вопрос о степени универсальности подобной реакции и возможных специфических чертах, зависящих от природы действующего фактора. Направленное воздействие стрессоров, заведомо различающихся по механизму продукции АФК, способно в значительной степени облегчить выяснение закономерностей развития окислительного стресса в растительной клетке. Суспензия изолированных хлоропластов, использовавшаяся нами в качестве экспериментальной системы, обладает рядом особенностей.
С одной стороны, при выделении пластид они уже подвергаются значительному стрессовому воздействию, эффект которого необходимо учитывать в дальнейшем, а с другой - система позволяет исключить влияние дифференциальной экспрессии ядерных генов и, следовательно, цитоплазматический белковый синтез fife novo, а также свести к минимуму фитогормональное участие, что значительно упрощает интерпретацию результатов. При этом исследования in organello являются максимально приближенными к условиям in vivo, чем выгодно отличаются от оценок in vitro, в случае которых ферментативные и неферментативные реакции оказываются вырванными из их природного метаболического окружения (Danon, 1997; Micol, Fernandez-Silva, Attardi, 1997). Для индукции окислительного стресса нами использовались обработка суспензии хлоропластов фотодинамическим гербицидом паракватом (PQ), механизм действия которого в пластидах основан на ЭТЦ-зависимой генерации значительных количеств 02 , введение экзогенного пероксида водорода, малые дозы ионизирующей радиации, характеризующейся продукцией ОН как первичной АФК при радиолизе воды, а также воздействие высокой температуры, вызывающей усиление образования широкого спектра активированных молекулярных форм, а кроме того, влияющей на развитие окислительных процессов посредством ускорения радикальных реакций и модуляцией работы ферментов. Маркерами развития окислительного стресса являлись скорость продукции Ог , содержание пероксидов, выраженное в НгОг-эквивалентах, а также развитие процесса липопероксидации, оцениваемое по накоплению конъюгированных двойных связей и малонового диальдегида. Развитие окислительного стресса в хлоропластах при тепловом шоке Наиболее типичным абиотическим фактором, влияющим на существование растений в природных условиях, является температура окружающей среды. Существование растительных видов и их распространение в значительной степени обуславливаются диапазоном температур, в пределах которых они способны сохранять жизнеспособность и осуществлять полный жизненный цикл, определяющий их воспроизводство (Huner et al., 1996; Iba, 2002). Как было сказано ранее, воздействие повышенной температуры приводит к увеличению образования широкого спектра активных молекулярных форм. Рядом авторов это показано в отношении О2, Oi , Н2О2 и ROOH (А1-scher, Donahue, Cramer, 1997; Dat et al., 1998; Курганова и др., 1999). Причинами этого могут являться; тепловая инактивация молекул, в том числе анти-оксидантных белков (Курганов, 2002); разобщение фотосистем и увеличение "утечки" электронов на молекулярный кислород (Лютова, Каменцева, 1996; Бухов, Буше, Карпантье, 1997; Курганова, Синицына, Веселое, 2001); темпе-ратурозависимое изменение физических свойств мембран и ускорение радикальных реакций (Конев, Нисенбаум, Волотовский, 1982); ускорение метаболических процессов, ведущее к неизбежному увеличению "ошибок" и выхода побочных реакций. Как следует из рис. 6, повышение температуры до 42С вызывало увеличение продукции Ої примерно в 1,5 раза по сравнению с контролем, остававшимся при 23-25С. Основная масса Ог" в хлоропластах продуцируется в ходе реакции Мелера - при фотовосстановлении молекулярного кислорода компонентами акцепторной стороны фотосистемы I, при этом ( конкурирует с окисленным НАДФ+ (Badger et al., 2000; Noctor, Veljovic-Jovanovic, Foyer, 2000; Heber et al., 2001). Кроме этого, источниками АФК могут являться водоокисляющий комплекс ФС II и пул пластохинонов (Застрижная и др., 1997; Casano et al., 2000), Образующийся 02 утилизируется ферментами так называемого водно-водного цикла (англ.: "water-water cycle") - мембраносвя-занной супероксидцисмутазой, дисмутирующей его до Н2О2, восстанавливающегося при работе аскорбатпероксидазы (Asada, 1999, 2000). Реактивация аскорбата происходит за счет монодегидро- и дегодроаскорбатредуктазы. Нарушение баланса про- и антиоксидантных реакций цикла становится причиной увеличения в пластидах концентрации пероксидов. В наших экспериментах их содержание в хлоропластах постепенно увеличивалось и достигало максимума через 30 минут прогрева (рис. 7).
Характерно, что данный эффект полностью снимался при отсутствии освещения (рис. 7), что подтверждает предположение о фотосинтетическом происхождении избыточных количеств пероксидов при тепловом шоке в пластидах. Несмотря на относительно низкую окислительную способность, опасность данных АФК состоит в их способности генерировать ОН в реакциях Фентона и Хабера-Вайса с участием ионов металлов переменной валентности и 02 (Осипов, Азизова, Владимиров, 1990). Следствием разбалансировки прооксидантно-антиоксидантной системы организма в сторону увеличения продукции АФК является развитие окислительной модификации макромолекул. Наиболее часто маркерами этого процесса служат продукты перекисного окисления липидов (ПОЛ), что обусловлено несколькими причинами. С одной стороны, липопероксидация является достаточно лабильным процессом, скорость которого быстро изменяется в ответ на различные стимулы (Барабой и др., 1992; Becana, Могап, Iturbe-Ormaetxe, 1998). Рядом авторов данное изменение предлагается рассматривать как неспецифический показатель протекания общей стрессовой реакции организма (Барабой, 1991; Alscher, Donahue, Cramer, 1997). С другой стороны, именно состояние мембран и, как следствие, мембранных комплексов и ансамблей во многом определяет устойчивость растений к действию стрессоров и их адаптационные возможности (Шаяхметов и др., 1990; Тар-чевский, 1992). Наконец, продукты ПОЛ имеют важное значение не только как токсические агенты, по и как модуляторы функций белков и нуклеиновых кислот, способные выполнять сигнальную роль в регуляции ответа организма на действие различных факторов (Berlett, Standtman, 1997; Anderson, Chen, Klessig, 1998; Weber et al., 2004). Первичными продуктами перекисного окисления липидов (ПОЛ) являются пентадиенильньте радикалы, образующие диеновые конъюгаты (ДК) и гидроперекиси жирных кислот. В случае полиненасыщенных жирных кислот возможно также образование триеновых конъюгатов (ТК). Дальнейшее окисление гидроперекисей и их распад приводит к образованию широкого спектра конечных продуктов: альдегидные и спиртовые производные с укороченной цепью, низкомолекулярные продукты (этан, пентан), эпоксиды, малоновый диальдегид (МДА) (Барабой и др., 1992).
Влияние абиотических стрессоров на антиоксидантный статус изолированных хлоропластов
При действии на растения неблагоприятных факторов различной природы существенную роль приобретает работа антиоксидантных (АО) систем, обеспечивающих сдерживание усиливающейся продукции активных форм кислорода и предотвращение накопления в клетке подвергшихся окислительной модификаций макромолекул (Пескин, Столяров, 1994; Alscher, Donahue, Cramer, 1997). Уровень активности антиоксидантных ферментов и содержание низкомолекулярных антиоксидантов отражают общую "обороноспособность" организма и определяют рамки, в пределах которых он способен успешно противостоять действию стрессоров (Меньшикова, Зенков, 1993). Способность к изменению АО-статуса клеток или клеточных органелл в условиях развития стрессовой реакции свидетельствует о существовании в растениях, как и у животных, механизмов активной защиты от неблагоприятных факторов, строго регулируемых в соответствии с конкретными условиями среды (Allen, Webb, Schake, 1997). Адаптивное увеличение ан-тиоксидантной активности может служить показателем степени напряжения защитных систем организма. При этом усиление работы АО-системы даже при неизменном уровне окислительных процессов является показателем развития окислительного стресса в клетках и свидетельствует о нарушении про-оксидантно-антиоксидантного гомеостаза (Калашников и др., 1999; Mittler, 2002). Кроме того, антиоксиданты обуславливают выполнение активными формами кислорода регуляторных и сигнальных функций (Гамалеи, Клюбин, 1996; Suzuki, Forman, Sevanian, 1997). Осуществление АФК роли посредников в процессах восприятия и передачи информации о состоянии окружающей среды требует существования не только достаточно чувствительного механизма образования активированных молекулярных форм, но и строго регулируемой системы их утилизации. Как и в случае с продукцией АФК или накоплением в мембранах продуктов перекисного окисления липидов, ответ антиоксидантной системы на действие стрессоров различной природы обладает рядом неспецифических черт.
Так, для стрессовой реакции растений считается характерным усиление активности основных антиоксидантних ферментов и увеличение пула низкомолекулярных антиоксидантов на фоне роста их окисленности. Сходные картины АО-ответа получены при воздействии на растения экстремальных температур (Filek et al., 1997; Курганова и др., 1999; Chaitanya et al., 2002), засоления (Hernandez et al., 2000), тяжелых металлов (Hegedus, Erdei, Horvath, 2001), засухи (Loggini et al., 1999; Fu, Huang, 2001), ультрафиолета (A.-H.-Mackerness, Jordan, Thomas, 1999). К настоящему времени остается невыясненным, является ли данная универсальность следствием адекватного ответа на сходную картину развития окислительного стресса (увеличение образования АФК и накопление продуктов ПОЛ) или же существуют какие-либо иные механизмы, обуславливающие однотипную реакцию АО-системы на изменение условий среды и стрессирующие воздействия. Кроме того, даже в условиях отсутствия белкового синтеза de novo (в нашей экспериментальной системе), можно заведомо предположить существование специфичных аспектов влияния каждого индивидуального стрессора на содержание и активность антиоксидантов. С целью выяснения характерных черт и индивидуальных особенностей ответа антиоксидантной системы хлоропластов на действие различных по своей природе стрессоров (42С, экзогенный 1 и 10 мМ Н202, 100 и 500 мкМ паракват, низкоинтенсивное ионизирующее излучение) нами были проанализированы активности таких антиоксидантных ферментов как супероксиддис-мутаза (СОД), глутатионредуктаза (ГР) и глутатионтрансфераза (ГТ), а также определен глутатионовый статус пластид (GSH, GSSG и соотношение GSSG/GSH) и содержание в них каротиноидов при указанных выше воздействиях. Антиоксидантний статус хлоропластов при тепловом шоке Как было показано в главе 3.1, воздействие гипертермии на суспензию хлоропластов приводит к увеличению продукции 02 примерно в 1,5 раза по сравнению с контролем (рис. 5), Основным механизмом детоксикации данной АФК является её ферментативная дисмутация с участием супероксид-дисмутазы (Monk, Fagerstedt, Crawford, 1989; Scandalios, 1997). Для хлоропластов гороха к настоящему времени доказано наличие по меньшей мере двух изоформ СОД: Си п-СОД и Fe-СОД (Giannopolitis, Ries, 1977; Scioli, Zilinskas, 1988; Burke, Oliver, 1992; Iturbe-Ormaetxe et al., 1998), некоторые авторы упоминают о существования в пластидах растений Мп-СОД (Payton et al., 1997; Kingston-Smith, Foyer, 2000). Расположение данного фермента в мембранном матриксе в непосредственной близости от фотосистемы I, основного продуцента АФК, обуславливает его важнейшую роль в утилизации супероксида и предотвращении его выхода из липидной фазы в водную. Тем не менее, в строме хлоропластов присутствует второй, водорастворимый, пул фермента, осуществляющий дополнительные защитные функции (Alscher, Donahue, Cramer, 1997; Asada, 1999). Помещение суспензии изолированных хлоропластов в условия гипертермии в наших опытах не приводило к существенному изменению активности СОД (рис. 20). Незначительная активация фермента отмечалась только через 10 минут после начала прогрева, однако уже через 15 минут показатель возвращался к контрольному уровню. Как было показано ранее в работе Л.Н. Кургановой и др. (1999), кратковременный прогрев целых растений гороха вызывал значительную активацию хлоропластной СОД. Сопоставление этих данных с полученными в нашей работе позволяет предположить необходимость ядерных и (или) цито-плазматических факторов для индукции фермента при тепловом шоке. Результатом функционирования супероксиддисмутазы становится переход заряженной молекулы 02 в более стабильный незаряженный пероксид водорода.
Основное преимущество СОД по сравнению с низкомолекулярными антиоксидантами заключается в следующем: если при взаимодействии последних с 02 стехиометрическое соотношение 02 : Н202 составляет 1:1, то при работе СОД оно становится равным 2:1 (Polle, 2001), Иными словами, происходит не только восстановление Ог ", но и уменьшение концентрации АФК вдвое. Утилизация образующегося Н202 в хлоропластах осуществляется при работе аскорбат-глутатионового цикла (п. 1.1), основным ферментом которого является глутатионредуктаза, осуществляющая НАДФН-зависимое восстановление окисленного димерного глутатиона (Чернов, 1995; Pastori, Mullineaux, Foyer, 2000). Воздействие повышенной температуры вызывало постепенное увеличение активности ГР, достигавшее 160% от исходного значения через 30 минут после начала обработки, однако в дальнейшем активность фермента существенно снижалась, падая до 50-60% от уровня контроля (рис. 21). Такая динамика может являться отражением действия совокупности активирующих и ингибирующих факторов в условиях теплового шока. С одной стороны, рост активности ГР может объясняться неспецифическим ускорением ферментативной реакции в пределах действующих температур, а кроме того, нельзя исключить индуцибельность фермента, несмотря на отсутствие в литературе данных по этому вопросу к настоящему времени. С другой стороны, для ГР показана высокая температурная лабильность (Курганова и др., 1997). Помимо этого, данный фермент требует для работы НАДФН в качестве кофактора, и дефицит восстановительных эквивалентов при развитии окислительного стресса пластид может стать причиной дезактивации фермента (De Vos, Kraak, ВІпо, 1994, Kumar, Knowles, 1996). Именно недостатком НАДФН Т. Shikanai et al. (1998) объясняют эффективную работу аскорбат-глутатионового цикла лишь на ранних этапах развития фотоиндуцированно-го окислительного стресса в хлоропластах табака. Одной из причин снижения содержания НАДФН является переключение потоков электронов и ингибирование нециклического фотофосфорилирования, показанные в хлоропластах при гипертермии (Синицына, 2002). Другим глутатион-зависимым ферментом, осуществляющим детокси-кацию продуктов липопероксидации, в первую очередь 4-гидрокси-ноненалей, а также катализирующим глутатионпероксидазную реакцию с гидроперекисными производными жирных кислот, является глутатионтранс-фераза (Колесниченко, Кулинский, 1989; Marrs, 1996). Под единым названием данного фермента объединяется широкий ряд изоферментных форм, отличающихся как по субстратной специфичности, так и по аминокислотной последовательности (Rossini et al., 1996; Edwards, Dixon, Walbot, 2000; McGonigle et ah, 2000).
